Biologically active composition for regulation of lipolysis process in the organism under obesity

Abstract

The aim of the research was to study the mechanism of intermolecular interaction of allicin and lecithin with pancreatic lipase, and developing the composition, contributing to the inactivation process of lipolysis, and reduce the absorption of fats in the organism. Methods of computer chemistry have been used for modeling spatial structures of allicin and lecithin. Geometric optimization was carried out, quantum chemical characteristics and the distribution of charge density of the molecules of the studied biologically active substances and pancreatic lipase were studied. In the study of the molecular properties of the lipase of pancreatic juice before and after molecular docking, it was found that one molecule of lecithin didn't fully block the active site of the enzyme. For complete inactivation of lipase, two molecules of lecithin or one molecule of allicin were required (Epot. = -412.36 and-159.4 kcal, respectively). An optimal composition of supplement to blocking pancreatic lipase has been set: allicin containing additive - 95% (75% sunflower oil, 25% chopped garlic), lecithin - 5%. The efficacy of lipase inactivation by supplement stored at 2-4 °C in fat-water mixture has been studied. It was found that after storage for three days the developed composition retained its properties. Acid number of fat, subjected to enzymatic treatment varies slightly (0.1 to 0.25 mg KOH/g). Peroxide value and microbiological characteristics of the investigated fraction also did not exceed the permissible norms. When evaluating the biological value of the developed composition in the experiment on white BALB/c mice (with initial body weight of 20-30 g), it was found that its administration on the background of high fat (19%) diet at a dose of 6% of the diet fat from the 15th to the 40th day was accompanied by 1.5 fold reduce in body weight increasing in comparison with animals which received no additives. Their blood levels of total lipids, cholesterol, triglycerides and glucose reduced while the level of total protein and urea increased to the level of the control group (without obesity).

Keywords:lipase, lecithin, allicin, molecular properties, complex compounds, molecular docking

Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2017; 86 (6): 74-83.

Адекватная диетотерапия способствует оптималь­ному течению процессов адаптации и компенсации нарушенных функций, коррекции патологически изме­ненных звеньев метаболизма, достижению иммуномодулирующего, антиоксидантного и других положитель­ных эффектов [1]. По оценкам специалистов в области медицины и питания, возможность воплощения в пов­седневную жизнь принципов здорового питания позво­лила бы снизить уровень смертности от сердечно-сосу­дистых заболеваний на 25%, онкологии - на 20-30%, диабета - на 50%. Избыток в рационе жиров, углеводов, недостаток полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) и пищевых волокон может привести к патологичес­ким состояниям, связанным с ожирением. Избыточная масса тела повышает риск развития гипертонии, ате­росклероза, сахарного диабета, остеопороза, болезней желчевыводящих путей, онкологических заболеваний и др. [2, 3].

Одной из проблем здравоохранения в промышленно развитых странах стало ожирение, которое в настоящее время приобретает угрожающие масштабы из-за развития сопутствующих заболеваний. В России ожирение также занимает одно из первых мест среди алимен­тарно-зависимых патологий. По последним данным, в России 25% лиц трудоспособного возраста имеют разную степень ожирения и 30% - избыточную массу тела [2, 3].

На практике эффективность лечения ожирения с использованием голодания и различных диет остается низкой. Клинические исследования показывают, что в первые сутки недостаток калорий компенсируется за счет запасов гликогена, затем процесс получения глюкозы обеспечивается за счет распада мышечных глюкогенных аминокислот (аланина, аспарагина, аспарагиновой кислоты). Поэтому до 30% снижения массы тела приходится на мышечную ткань, на место которой по окончании голодания и использования сильно реду­цированной диеты приходит жировая ткань. В 95% слу­чаев лечение ожирения приводит к кратковременному снижению массы тела и последующему ее увеличению [4-6].

Эффективной профилактикой при избыточной массе тела является использование в рационе питания биологически активных добавок к пище (БАД). Одно из направлений - это разработка рецептур и техноло­гий специализированных пищевых продуктов, содер­жащих биологически активные вещества (БАВ). При этом важное значение имеют химический состав сырья и правильно подобранное количественное соотношение компонентов, что позволяет регулировать функцио­нально-технологические свойства и пищевую ценность готовых продуктов, а также прогнозировать лечебно-профилактический эффект [7-9].

В результате анализа литературы были выявлены ин­гредиенты, обладающие биологически активными свойс­твами, которые могут быть использованы в рецептурах функциональных и специализированных пищевых про­дуктов для диетического (профилактического) питания, предназначенных для лиц с избыточной массой тела: аллицин (содержащийся в чесноке), растительное масло с высоким содержанием ПНЖК и лецитин [10-12].

Известно, что нарушение целостности зубка чеснока приводит к разрушению клеток и взаимодействию кле­точных компонентов, при этом из аллиина образуется БАВ - аллицин. Аллицин находится в цитозоле и является инертным химическим компонентом, он преобразуется в аллицин ферментом аллиназой, которая находится отдельно от аллиина в вакуолях и при повреждении (дроблении, измельчении и др.) растения вступает во взаимодействие со своим субстратом [13, 14]. Алли­цин обладает противомикробной активностью, снижает синтез триглицеридов в печени и уровень холестерина в крови, вступая в реакцию со свободными радикалами, нейтрализует их. Также имеются данные, что аллицин блокирует различные ферменты [14, 15]. Аллицин - это соединение, имеющее невысокую термическую ста­бильность. Он медленно разрушается при комнатной температуре и крайне быстро в процессе нагревания. В растворах растительных масел аллицин способен сохранять свои свойства очень длительный период вре­мени [14, 16]. Нестабильность аллицина при тепловой обработке и в процессе хранения предполагает разра­ботку технологии подготовки чеснока к использованию в качестве источника БАВ при производстве специа­лизированных пищевых продуктов. Поэтому возникает необходимость стандартизации чеснока по содержанию аллицина.

Поскольку растительные масла способствуют повы­шению стойкости и сохранности полезных свойств ал­лицина, целесообразно предусмотреть использование в композиции сырья с высоким содержанием ПНЖК. Доказано, что ПНЖК как составная часть структуры клеточных и субклеточных мембран являются родо­начальниками многих жировых структур в организме человека. При недостатке ПНЖК нарушаются многие функции клеток организма. В подсолнечном масле находится значительное количество ПНЖК семейства ω-6 (примерно 65,7%) [17, 18].

Использование лецитина в питании обусловлено его способностью обновлять поврежденные клетки, оказы­вать антиоксидантное действие. Треть мозговых, защитных и изолирующих тканей, окружающих спинной и го­ловной мозг, состоит из лецитина. Недостаток лецитина может вызвать слабоумие, способствовать развитию болезни Паркинсона, рассеянного склероза и прочих нервных заболеваний [19, 20].

По данным литературы, аллицин (содержащийся в чесноке), растительное масло с высоким содержанием ПНЖК и лецитин [10-12, 20, 21] обладают многофункци­ональными лечебно-профилактическими свойствами, являются активаторами процессов метаболизма и липолиза, способны блокировать ферментные системы и положительно влиять на организм человека. Однако липотропные свойства и механизм снижения уровня ус­воения жиров в организме при использовании в питании выявленных БАВ недостаточно хорошо изучены.

Цели исследования - изучение механизма межмо­лекулярного взаимодействия аллицина и лецитина с панкреатической липазой, а также разработка состава композиции БАВ, способствующей инактивации про­цесса липолиза и уменьшению усвоения жиров в живом организме.

Материал и методы

В качестве материалов при проведении эксперимен­тальных исследований были использованы: лецитин с содержанием фосфолипидов не менее 97%; панк­реатин с липолитической активностью 4300 ед. ФИП; чеснок свежий (ГОСТ 33562-2015) и рафинированное подсолнечное масло (ГОСТ Р 52465-2005).

Уровень рН (8-9) жироводной смеси для обеспечения оптимального действия липазы регулировали 0,1 N рас­твором NaOH.

Экспериментальные исследования проводили с при­менением стандартных методов титриметрического оп­ределения кислотного и перекисного чисел [21-23].

Определение аллицина в луковицах чеснока про­водили с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) [24] изократическим эллюированием [эллюентом одного состава (в %) метанол : вода -50:50] при длине волны спектрофотометрического де­тектирования 220 нм в системе LC-20AD Prominence (Shimadzu, Япония). В качестве стандартного образца использовали аллицин 100% AllimaxTM ("CLM Health Group Inc.", Великобритания) [26].

Биологическую ценность и безопасность продукта оценивали на лабораторных животных - белых мышах, путем определения состояния белкового, углеводного и липидного обмена [25, 26]. Исследования прово­дили на белых мышах линии BALB/c (самцы и самки) с исходной массой тела 20-30 г. Животных содержали в клетках на подстилке из опилок при температуре около 20°С и стандартном режиме освещения в условиях ви­вария ФГБОУ ВО "Ставропольский государственный медицинский университет". Эксперимент проводили в соответствии с санитарными, санитарно-эпидемиоло­гическими, гигиеническими положениями, требованиями и правилами лабораторной практики [27-31]. Лабо­раторных животных разделили на 2 экспериментальные группы (1-й, 2-й опыты) и 1 контрольную по 5 особей в каждой. Животные опытных групп в течение 2 нед получали корм, обогащенный жирами - 19% от общего состава рациона. Затем в рационе животных 2-й группы использовали корм с разработанной добавкой. Масса ежедневного рациона для контрольной группы из 5 особей составляла 14,35 г [32]. На протяжении всего эксперимента (40 сут) 1-я группа получала корм, обогащенный жирами (без композиции), контрольная группа - стандартный рацион вивария (табл. 1).

Содержание в крови лабораторных животных общего количества липидов, холестерина, триглицеридов, общего белка вели на автоматическом биохимичес­ком анализаторе Cobas c 111 ("Roche Diagnostics", Швейцария).

Результаты исследований анализировали в приложе­ниях Statistic v. 8.0, 10 с использованием модуля Statistic Neural Networks. Опыты проводили в 3-5-кратной повторности. Достоверность полученных результатов конт­ролировали в модуле Error per Case, уровень значимости (р) в каждом опыте не превышал 0,05. Прогнозирова­ние молекулярных свойств химических соединений вели в приложениях HyperChem v. 8 и AutoDock v. 4.2.

Результаты и обсуждение

Одним из биологически активных компонентов БАД является аллицин, образующийся при нарушении це­лостности зубка чеснока. В России выращиваются раз­личные сорта чеснока: "Широколистный 220", "Сочин­ский 56", "Грибовский юбилейный", "Отрадненский", "Любаша", "Добрыня" и др. На юге России и в Ставро­польском крае (в Андроповском и Кировском районах) на промышленной основе выращивают в основном чес­нок сортов "Грибовский юбилейный" и "Любаша" [33]. Химический состав чеснока и содержание биологически активного ингредиента аллиина (предшественника ал­лицина) зависит от агротехнических приемов возделы­вания культуры, типа почв, погодных условий, а также от технологии переработки, хранения и др. Поэтому химический состав одного и того же сорта чеснока может отличаться в разные периоды времени и в зависимости от условий возделывания культуры.

На содержание аллицина исследованы образцы чес­нока свежего неподсушенного (после измельчения) сор­тов "Грибовский юбилейный" и "Любаша", выращенные в 2016 г. в Андроповском районе Ставропольского края. Хроматограммы содержания аллицина в чесноке пред­ставлены на рис. 1 (А, В).

В луковицах чеснока "Грибовский юбилейный" содер­жится 0,38% аллицина, а в сорте "Любаша" - 0,32%. В дальнейших исследованиях для оценки эффектив­ности композиции на лабораторных животных использо­вали сорт чеснока "Любаша" с меньшим содержанием аллицина.

Знание структуры, пространственной конфигурации, молекулярных свойств, плотности распределения за­ряда на поверхности реагентов и комплексных соеди­нений является важным этапом в понимании механизма взаимодействия активаторов процесса липолиза и БАВ, препятствующих новообразованию и усвоению жира. Оптимизация геометрии молекул в приложении Hyper-Chem предусматривает определение устойчивой конфи­гурации молекулярных структур с минимальной потен­циальной энергией системы. Молекулярные свойства липазы, лецитина и аллицина сведены в табл. 2.

Потенциальная энергия липазы, лецитина и аллицина имеет невысокие величины, что свидетельствует об ус­тойчивом состоянии исследуемых молекул. Среднеквад­ратичный градиент приближен к нулевому значению для всех молекул 0,1-0,19 ккал/(Ехмоль), что подтверждает эффективность минимизации потенциальной энергии. Дипольный момент характеризует полярность молеку­лярной системы.

Анализ образования комплексных соединений прово­дили в приложении AutoDock v. 4.2 методом молекуляр­ного докинга, который позволяет определить наиболее выгодную ориентацию молекул для образования ус­тойчивого комплекса. Комплексы данных биологически значимых молекул являются важным фактором в пере­даче химического сигнала. Относительное ориентиро­вание между двумя взаимодействующими молекулами влияет на тип произведенного сигнала (ингибирующий или каталитический).

В тонком отделе кишечника фермент липаза отвечает за расщепление нейтральных жиров - триглицеридов, сложных эфиров глицерина и высших карбоновых кислот. Возможность блокирования активного центра липазы позволит снизить интенсивность процесса гид­ролиза липидов, что будет способствовать выведению их из организма.

Исследование молекулярных характеристик липазы панкреатического сока человека до молекулярного до-кинга и после в присутствии лецитина представлено на рис. 2-4.

Результаты молекулярного докинга свидетельство­вали (рис. 3) о недостаточно хорошей блокировке актив­ного центра липазы одной молекулой лецитина - фермент продолжает выполнять каталитические функции. Поскольку образование комплексного соединения про­исходит вблизи активного центра, анализировали меж­молекулярное взаимодействие липазы с двумя молеку­лами лецитина (рис. 4).

Результаты компьютерного моделирования (рис. 4) взаимодействия панкреатической липазы с двумя мо­лекулами лецитина показали полную блокировку актив­ного центра фермента.

Предполагают, что подобным эффектом, свойствен­ным лецитину, обладает аллицин (рис. 5).

Компьютерное моделирование выявило эффективную блокировку активности липазы одной молекулой алли­цина (Epot. = -159,4 ккал) (см. рис. 5) или двумя молеку­лами лецитина (Epot. = -412,36 ккал) (см. рис. 5).

Исходя из данных по изучению активности липазы с лецитином и аллицином в качестве компонентов БАД для профилактики процессов ожирения использовали лецитин и аллицин-содержащую добавку (АСД). Ал­лицин относят к классу эфирных масел, он является нестойким соединением и легко разрушается в присутс­твии воды, образуя аллилдисульфид и SO2, но хорошо хранится в растительном масле, что обусловлено хими­ческой природой этого соединения [24]. В связи с этим АСД готовили путем измельчения чеснока и перемеши­вания его с растительным маслом в соотношении 1:3 для обеспечения стойкости аллицина.

Обоснование использования в питании БАВ базиру­ется на нормах физиологических потребностей в энергии и пищевых веществах для различных групп населения. Адекватный уровень суточного потребления лецитина (молекулярная масса 760,22 а.е.м.) - 7-15 г/сут; аллицина (молекулярная масса 162,28 а.е.м.) - 4-12 мг/сут [34]. На основании проведенного хроматографического анализа адекватный уровень суточного потребления аллицина содержится в 1,25-3,75 г чеснока сорта "Любаша".

Известно, что при гидролизе в желудочно-кишечном тракте фосфолипид лецитин распадается на высшие жирные кислоты, глицерин, фосфорную кислоту и холин. Однако в желудке человека расщепление липидов прак­тически невозможно. Это связано прежде всего с тем, что рН желудочного сока 1,5 не соответствует оптимуму действия фермента липазы, отсутствуют также условия для эмульгирования, а липаза может расщеплять жиро­вую фракцию только в форме эмульсии. Расщепление и последующее переваривание липидов происходит в тонкой кишке [35]. Учитывая тот факт, что моделирова­ние молекулярного докинга велось in vacuo (в вакууме), а образовавшееся соединение высокоустойчиво, пос­кольку потенциальная энергия комплекса гораздо ниже соответствующего показателя для панкреатической липазы (Epot. = -412,36 для комплекса липаза/лецитин против 4,97 ккал/моль), можно сделать вывод о высокой вероятности образования комплекса липаза/лецитин в желудке человека и малой вероятности его разрушения в тонкой кишке. Не связавшийся в желудке лецитин под­вергается гидролизу в тонкой кишке.

В обычном рационе холина (молекулярная масса 104,172 а.е.м.) содержится 500-900 мг. Верхний допусти­мый уровень потребления - 1000-2000 мг/сут для детей до 14 лет, 3000-3500 мг/сут для детей старше 14 лет и взрослых. Рекомендуемые уровни потребления холина: для взрослых - 500 мг/сут; для детей 4-6 лет - от 100 до 200 мг/сут; 7-18 лет - от 200 до 500 мг/сут [36], что эквивалентно 729,8-3649,0 мг/сут лецитина.

Следовательно, желательное соотношение компонен­тов лецитин : чеснок в БАД должно быть приблизи­тельно 1:1.

Для оценки эффективности блокировки липазы гомо­генизировали свиной шпик с водой в соотношении 1:1, добавляли АСД и лецитин, смесь подвергали термической обработке, затем нормализировали уровень рН и к полу­ченной остывшей композиции добавляли панкреатин.

Оценку эффективности разработанного состава БАД проводили на модельных липидных образцах (рис. 6).

1. Гомогенизированная жироводная (1:1) смесь (конт­роль).

2. Контроль с 0,3% лецитина.

3. Контроль с 2% АСД.

4. Контроль с 0,3% лецитина и 2% АСД.

5. Контроль с 6% АСД.

6. Контроль с 0,3% лецитина и 6% АСД.

Для оценки степени гидролиза липидной фрак­ции панкреатином в опытных образцах определяли кислотное число (КЧ). Эксперимент был разделен на 2 этапа. На 1-м этапе нагреванием имитировали процесс термической обработки при 72 °С (с учетом использования добавки при производстве мясопродук­тов, что обусловлено присутствием чеснока во мно­гих рецептурах мясных изделий); на 2-м - исследо­вали эффективность блокирования фермента липазы, для этого в состав композиции вносили 0,1% панкре­атина и выдерживали при 37 °С (оптимум действия липазы).

На 1-м этапе показатель кислотного числа (КЧ) жира изменялся незначительно (0,21-0,33 мг КОН/г жира). В образце с 0,3% лецитина и 6% АСД по истече­нии 2-часовой ферментативной обработки значение КЧ было самое низкое (4,86 мг КОН/г) по сравнению с 1-5-й композициями. Повышенная скорость гидроли­тического распада наблюдалась у образцов контроль­ного и с 2% добавкой АСД (3-й образец). По результатам проведенных исследований установлен состав БАД: АСД - 95% (75% подсолнечного масла, 25% измельчен­ного чеснока), лецитина - 5%.

Для оценки эффективности блокировки липазы, разработанной биологически активной композицией в составе продуктов, подвергающихся хранению, в жировую фракцию вносили 6% (Процентное соотношение установлено с учетом нормы потребления аллицина, восполнения недостатка лецитина и по результа­там изучения гидролиза липидной фракции в присутствии биологически активных добавок.) разработанной компо­зиции (что соответствует минимальному адекватному суточному потреблению аллицина - 4,56 мг и воспол­няет недостаток потребления лецитина на 0,3 г), затем в смесь добавляли эквивалентное количество воды, перемешивали и делили на 4 части. 2, 3 и 4-ю части выдерживали при 2-4 °С в течение соответственно 1, 2 и 3 сут. Образцы, полученные в момент изготовле­ния (1-я часть) и после хранения, термостатировали с панкреатической липазой при 37 °С в течение 30 мин, затем определяли показатели гидролитического рас­пада (КЧ), микробиологической и окислительной порчи (ПЧ) жировой фракции.

Показатели кислотного и перекисного (ПЧ) чисел жира анализируемых образцов, полученных в момент получения композиции и после хранения смеси, из­менялись незначительно: КЧ с 0,10 до 0,25 мг КОН/г; ПЧ с 1,2 до 1,5 ммоль активного кислорода/кг. Санитарно-микробиологические показатели (КМА-ФАнМ, бактерии S. aureus и группы кишечных па­лочек, патогенные микроорганизмы) не превышали допустимых норм (СанПиН 2.3.2.1078-01). Результаты проведенных исследований свидетельствовали о воз­можности хранения в охлажденном состоянии жиросодержащих пищевых продуктов с разработанной добавкой.

Для оценки биологической ценности разработанной композиции у экспериментальных животных (белых мышей) был смоделирован процесс ожирения повы­шением калорийности рациона за счет введения избы­точного количества липидов - 19% от общего состава рациона.

Изменение массы тела животных в ходе эксперимента представлено в табл. 3. Индивидуальные взвешивания вызывают стресс у животных, поэтому в первые 7 сут практически у всех животных наблюдался отрица­тельный или незначительный прирост: в контроль­ной группе среднее изменение массы тела составило -1,05 г, в 1-й опытной группе - +0,32 г, во 2-й опытной группе - +0,44 г.

Величина относительного прироста животных во 2-й опытной группе через 14 сут эксперимента была сопоставима с соответствующим показателем 1-й группы и превышала таковой в контрольной группе в 3,8-4,0 раза, что свидетельствует об эффективности моделирования процесса ожирения у животных за счет используемого рациона питания. При введении в лярд композиции БАВ в последующие 26 сут (период на­блюдения 15-40) во 2-й опытной группе наблюдалось снижение относительного прироста массы тела жи­вотных почти в 2 раза относительного прироста для 1-й опытной группы. Основной относительный прирост массы тела у животных 2-й опытной группы происходил с 1-х по 14-е сутки, когда в лярд не вводилась компози­ция БАВ. За весь период наблюдения (40 дней) относи­тельный прирост во 2-й опытной группе был в 1,5 раза ниже, чем в 1-й опытной группе.

Введение обогащенной жирами пищи приводило к увеличению в крови содержания липидов (в том числе триглицеридов и холестерина). Показатели крови у мышей 2-й опытной группы за счет использования в рационе БАВ не отличались от параметров животных контрольной группы (табл. 4).

При потреблении обогащенного жирами корма (без разработанной добавки - 1-й опыт) наблюдалось увели­чение в крови уровня глюкозы (табл. 5).

Обогащение рациона добавкой, содержащей АСД и лецитин, повышало в крови лабораторных живот­ных концентрацию белка и мочевины и снижало со­держание глюкозы до уровня контрольных животных (см. табл. 5).

Таким образом, использование в рационе разрабо­танной добавки нормализовало обмен белков, жиров и углеводов в организме животных с избыточной мас­сой тела.

Заключение

На основании компьютерного моделирования моле­кулярных свойств лецитина и аллицина и изучения их взаимодействия с панкреатической липазой обоснована целесообразность использования этих БАВ в композиции для уменьшения усвоения жиров в организме. Анализ норм потребления БАВ и экспериментальные исследова­ния на модели in vitro позволили обосновать состав био­логически активной композиции: аллицилсодержащая добавка - 95%, лецитин - 5%. Установлено, что у лабора­торных животных с искусственно вызванным ожирением, в рацион питания которых вводилась биологически ак­тивная композиция, содержание в крови общих липидов, холестерина, триглицеридов, общего белка, глюкозы и мочевины было приближено к соответствующим зна­чениям особей контрольной группы (без ожирения). Сле­довательно, использование биологически активной ком­позиции в рационе питания повышенной калорийности способствует нормализации липидного, углеводного и белкового обмена у лабораторных животных.

Литература

1. Тутельян В.А. О нормах физиологических потребностей в энер­гии и пищевых веществах для различных групп населения Рос­сийской Федерации // Вопр. питания. 2009. Т. 78, № 1. С. 4-15.

2. Аметов А.С., Курочкин И.О., Зубков А.А. Сахарный диабет и сер­дечно-сосудистые заболевания // РМЖ (Русский медицинский журнал). 2014. № 13. С. 958-943.

3. Бунина О.Ю. Разработка технологии мясопродукта для лиц с избыточной массой тела : автореф. дис. ... канд. техн. наук. Ставрополь, 2013.

4. Новодержкина Ю.Г., Дружинина В.П. Диетология. Ростов н/Д : Феникс, 2004. 384 с.

5. Балаков Н.А., Мазуров В.И. Ожирение. СПб. : СПбМАПО, 2003. 519 с.

6. Фалеев А. Голодание - это способ набора веса! [Электронный ресурс]. URL: http://www.faleev.com/slimming/slim/p009.html.

7. Мартинчик А.Н., Батурин А.К., Пескова Е.В., Кешабянц Э.Э. Михайлов Н.А. Потребление йогурта и снижение риска избыточ­ной массы тела и ожирения среди взрослого населения // Вопр. питания. 2016. № 1. С. 56-65.

8. Мартинчик А.Н., Батурин А.К., Кешабянц Э.Э. Фатьянова Л.Н., Семенова Я.А., Базарова Л.Б. и др. Анализ фактического пита­ния детей и подростков России в возрасте от 3 до 19 лет // Вопр. питания. 2017. Т. 86, № 4. С. 50-60.

9. Sadovoy V.V., Selimov M.A., Slichedrina T.V., Nagdalian A.A. Usage of biological active supplements in technology of prophilactic meat products // RJPBCS (Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences). 2016. Vol. 7, N 5. P. 1861-1865.

10. Ringseis R., Keller J., Eder K. et al. Role of carnitine in the regulation of glucose homeostasis and insulin sensitivity: evidence from in vivo and in vitro studies with carnitine supplementation and carnitine deficiency // Eur. J. Nutr. 2012. Vol. 51, N. 1. P. 1-18.

11. Селютина И. Ю. Биологически активные вещества видов рода Allium L. (Alliaceae) // Сиб. ботан. вестн. 2007. Т. 2, № 2. С. 79-86.

12. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. М. : Медици­на, 2004. 704 с.

13. Hawkesford M., de Kok L. Managing sulphur metabolism in plants // Plant Cell Envirom. 2006. Vol. 29. P. 382-395.

14. Манукян К.А. Изучение биологически активных веществ листьев лука медвежьего (Allium ursinum L.) и создание лекарственного средства на их основе : дис. . канд. фарм. наук. Пятигорск, 2014. 150 с.

15. Suetsuna, K. Isolation and characterization of angiotensin I-converting enzyme inhibitor dipeptides derived from Allium sativum L (garlic) // J. Nutr. Biochem. 1998. Vol. 9, N 7. P. 415-419.

16. Heintalu, A., Sihvart, A. Vigala Sassi taimeravi. Tallinn : Pegasus, 2012. 326 p.

17. Ипатова Л.Г., Кочеткова А.А., Нечаев А.П., Тутельян В.А. Жиро­вые продукты для здорового питания. Современный взгляд. М. : ДеЛи принт, 2009. 395 с.

18. Паронян В. Технология жиров и жирозаменителей. М. : ДеЛи принт, 2006. 760 с.

19. Тимошенко Ю.А., Красильников В.Н. Лецитин в производстве функциональных жировых продуктов // Масла и жиры. 2007. №11. С. 14-15.

20. Сас Е.И. Перспективы использования синергетических взаи­мосвязей эссенциальных фосфолипидов (ЭФЛ) в структуре функционального питания // Материалы VII Всерос. науч.-практ. конф. "Синергизм пищевых добавок". СПб., 2006. С. 17-21.

21. Базарнова Ю.Г. Методы исследования сырья и готовой продук­ции. СПб. : НИУ ИТМО; ИХиБТ, 2013. 76 с.

22. ГОСТ ISO 3960 Жиры и масла животные и растительные. Опре­деление перекисного числа. Йодометрическое (визуальное) определение по конечной точке.

23. ГОСТ Р 50457-92 (ИСО 660-83) Жиры и масла животные и расти­тельные. Определение кислотного числа и кислотности.

24. Arzanlou M., Bohlooli S. Introducing of green garlic plant as a new source of allicin // Food Chem. 2010. Vol. 120, N 1. P. 179-183.

25. Стальная Л.И. Современные методы в биохимии. М. : Медицина, 1977. 392 с.

26. Уилсон К., Уолкер Дж. Принципы и методы биохимии и моле­кулярной биологии. М. : Бином Лаборатория знаний, 2015. 848 с.

27. СП 2.2.1.3218-14 "Санитарно-эпидемиологические требования к проектированию, оборудованию и обслуживанию эксперимен­тальных биологических клиник (виварий)".

28. Единые санитарно-эпидемиологические и гигиенические требования к продукции (товарам), подлежащей санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) (с изменениями на 10.11.2015).

29. Правила надлежащей лабораторной практики. Приказ Минздра­ва России от 01.04.2016 № 199n.

30. Требования Международного научного комитета по использо­ванию лабораторных животных в экспериментальных исследо­ваниях // Бюл. ИКЛАС. 1978. № 24. С. 4-5.

31. Приказ Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977 "Правила работы с использованием подопытных животных".

32. Кырыкбайулы С., Садуов М.С., Малышев И.Л., Уразбекова Д.С., Жумагелдиев А.А. Лабораторное дело. Алматы, 2009. 270 с.

33. Сельское хозяйство, охота и лесоводство в России : стат. сб.. M. : Росстат, 2015.

34. МР 2.3.1.1915-04. Рекомендуемые уровни потребления пищевых и биологически активных веществ (утв. Главным государствен­ным санитарным врачом РФ 02.07.2004 г.). М. : Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благо­получия человека, 2004.

35. Тютюнников Б.Н. Химия жиров. М. : Колос, 1992. 448 с.

36. Методические рекомендации MP 2.3.1.2432-08 "Нормы физио­логических потребностей в энергии и пищевых веществах для различных групп населения Российской Федерации" : утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 18.12.2008. М. : Роспотребнадзор, 2009.