Development of technology and study of the immunobiological properties of a sour milk beverage based on camel milk

Abstract

The article presents data on the technology of production of a fermented milk prod­uct based on camel milk and the evaluation of its immunotropic properties in experiment on 60 male mice F1 (CBAxC57Bl/6) with an initial body weight 17.8±0.1 g. To simulate immune suppression, mice were injected cyclophosphamide intraperitoneally (125 mg/kg b.w). The fermented milk product was daily administered orally in a volume of 0.5 ml/mouse for 30 days (n=30). The animals of the control group (n=30) received a similar amount of distilled water. The study of the immunotropic activity of a fermented milk drink on the model of immune deficiency showed that a 30-day administration to mice caused an increase in the number of antibody-plaque-forming cells (IgM-AFC) by 1.3 times in spleen of mice (32,4х103 vs 24.7x103 per organ in the control group). The analyzed drink strengthened the effector phase of the response of the cellular response to erythrocytes of the sheep. Thus, in mice treated with distilled water (control group), the reaction index was 7.80%, while in mice of the main group it increased by 70% and amounted to 13.26%. The use of a fermented dairy product in immune-deficient mice resulted in a significant (by 63%) increase of antioxidant activity of blood plasma. At the same time, the imbalance in the functioning of antiradical protection enzymes (catalase and superoxide dismutase) reduced sharply, indicating an increase in the adaptive capac­ity of the organism, disturbed by the introduction of an immune suppressive compound. The obtained data indicate a pronounced immune modulating and antioxidant effects of the fermented dairy product based on camel milk, which can be used in the preven­tion and in complex therapy of secondary immune deficiencies and inflammatory diseases.

Keywords:sour-milk product, immunotropic activity, antioxidant activity, camel milk

Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2017; 86 (6): 67-73.

Результаты исследований верблюжьего молока пока­зали, что по качественным характеристикам оно выгодно отличается низким уровнем холестерина, высо­ким содержанием минеральных веществ (калий, железо, медь, цинк и магний), сбалансированным жирнокислотным составом [1]. Помимо этого показаны антигипертензивные, антидиабетические и противоопухолевые свойства верблюжьего молока [1, 2]. Имеются сведения о более легкой степени перевариваемости у лиц с лактазной недостаточностью [3].

Жирнокислотный состав верблюжьего молока пред­ставлен главным образом длинноцепочечными полине­насыщенными жирными кислотами и крайне низкими концентрациями короткоцепочечных жирных кислот [3]. Концентрация белка варьирует от 2,30 до 3,95%, при этом молоко содержит низкие концентрации лактоглобулина, обладающего выраженной аллергенностью [4]. Антиоксидантные свойства верблюжьего молока обус­ловлены высокой концентрацией витамина С, превы­шающей содержание витамина С в коровьем молоке в 2-3 раза [3]. Высокая концентрация витамина С в сочетании с низким рН молока способствует более длительной его сохранности по сравнению с коровьим молоком [5, 6].

Наличие в верблюжьем молоке высоких концентраций цинка (до 2 мг/100 мл) - один из важнейших факторов его потенциальной иммунопротективной активности [7]. Наряду с этим в молоке содержатся многие ферменты, обладающие антибактериальной и иммунотропной ак­тивностью. Так, концентрация лизоцима составляет 0,03­0,65 мг/100 мл, кроме того, в верблюжьем молоке содер­жатся иммуноглобулины, обеспечивающие противоинфекционную и противовирусную защиту [8], лактоферрин (95-250 мг/100 мл) [9], а также высокие концентрации пептидоглюкан-распознающего белка, что объясняет противоопухолевую активность данного вида молока [9].

Учитывая свойства верблюжьего молока, создание на его основе кисломолочных продуктов - приоритетная задача для производства лечебно-профилактических продуктов для различных возрастных групп населения, в первую очередь лиц с алиментарно-зависимыми иммунодефицитными патологиями.

В настоящее время известно несколько способов про­изводства кисломолочных напитков, представленных в патентах (RU № 2409963, KZ № 30167, KZ № 21385 и др.). Однако технология их производства длительна (в некоторых случаях достигает 24 ч), к тому же функци­ональные свойства входящих в состав кисломолочных напитков биологически активных компонентов и выбор заквасочных культур, к сожалению, недостаточно обос­нованы. В связи с этим создание современного эффек­тивного технологического производственного процесса с целью снижения временных параметров сквашива­ния/заквашивания, использование традиционной про­изводственной закваски и получение наиболее популяр­ного из кисломолочных продуктов - питьевого йогурта на основе верблюжьего молока - актуальная задача. Следует отметить, что не менее актуально создание линейки кисломолочных низколактозных продуктов на основе верблюжьего молока для лиц с низкой лактазной недостаточностью.

Материал и методы

Для приготовления кисломолочного напитка исполь­зовали цельное верблюжье молоко. Процесс произ­водства предполагает очистку молока от механических примесей, нормализацию по жиру, гомогенизацию при 12±2 МПа, пастеризацию при температуре 85±2 °С в течение 5-10 мин, охлаждение до 4±2 °С при условии дальнейшего резервирования, подогрев до темпера­туры заквашивания 40±2 °С и внесение производст­венной симбиотической закваски ФГБНУ "Всероссий­ский научно-исследовательский институт молочной промышленности" СТБп (Streptococcus salivarius subsp. termophilius и Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus) в количестве 1, 3, 5 и 10% к массе молока. Рациональное количество закваски из исследуемого ряда определяли по такому критерию, как время сквашивания, которое не должно превышать 5-6 ч. Окончание процесса скваши­вания определяли по образованию сгустка свойствен­ной консистенции, а также по кислотности, значение которой должно составлять рН 4,7±0,05. Затем готовый продукт разливают и охлаждают в холодильной камере до 4±2 °С, где в течение 4-6 ч происходит его дальней­шее созревание.

Технология низколактозного продукта отличалась тем, что в пастеризованное и охлажденное молоко вносили 0,02-0,03% β-галактозидазы (активность 5200 ед/г) к его массе, после чего смесь выдерживали в течение 2-3 ч для инициации процесса гидролиза лактозы. Остальные процессы - по аналогии с базовой технологией.

Процесс сквашивания для обеих технологий осущест­вляли на компьютеризированном приборе параллель­ных биореакторов (DASGIP, Германия) на 400 cм3 с поча­совым замером динамики рН в течение суток.

С целью определения иммунотропных свойств кисло­молочного продукта были проведены эксперименталь­ные исследования на модели искусственно вызванной иммуносупрессии. Для моделирования иммуносупрессии мышам однократно внутрибрюшинно вводили циклофосфан в дозе 125 мг на 1 кг массы тела. Эксперименты про­ведены на 60 мышах-самцах гибридах F1 (CBAxC57Bl/6) со средней начальной массой тела 17,8±0,1 г (M±m), полученных из питомника лабораторных животных Фи­лиал "Столбовая" ФГБНУ "Научный центр биомедицин­ских технологий" ФМБА России. Животных содержали при 20-22 °С и режиме освещения 12/12 ч. Животные находились на общевиварном рационе. Животным ос­новной группы (n=30) кисломолочный продукт вводили ежедневно перорально в объеме 0,5 см3/мышь в течение 30 дней. Животным контрольной группы (n=30) вводили аналогичное количество дистиллированной воды.

Работу с животными выполняли в соответствии с руководством [10], правилами лабораторной практики (приказы Минздравсоцразвития России от 23.08.2010 № 708Н "Об утверждении правил лабораторной прак­тики" и от 23.01.1985 № 48 "О контроле за проведением работ с использованием экспериментальных животных", этических норм, изложенных в Правилах лабораторной практики (GLP), Хельсинкской декларации и Директивах Европейского сообщества 86/609EEC (2000).

Влияние кисломолочного напитка на гуморальное звено иммунитета оценивали по изменению числа IgM-антителообразующих клеток (IgM-АОК) в селезенке иммунизированных эритроцитами барана мышей [11]. Клеточный иммунный ответ изучали в реакции гипер­чувствительности замедленного типа по ранее описан­ному методу [12]. После завершения курса введения напитка осуществляли сенсибилизацию мышей эритро­цитами барана (1х107/мышь, подкожно в объеме 0,1 см3). Разрешающую дозу эритроцитов барана (1х108 в объеме 20 мкл) вводили в подушечку задней лапы на 5-й день после сенсибилизации. Параллельно в противополож­ную лапу вводили физиологический раствор в том же объеме. Интенсивность реакции (ИР) оценивали через 24 ч по индексу реакции, который вычисляли индивиду­ально для каждого животного по формуле:

ИР (%) = (Ро - Рк)/Рк х 100,

где Ро - масса опытной лапы; Рк - масса контрольной лапы.

Оценку интенсивности свободнорадикального окис­ления осуществляли путем оценки люминол-зависимой Н2O2-индуцированной хемилюминесценции плазмы крови [13, 14] с измерением максимальной ампли­туды вспышки хемилюминесценции и площади быстрой вспышки на хемилюминотестере ЛТ-01 (НПО "Люмин", Россия). Определение антиокислительной активности плазмы крови проводили амперометрическим спо­собом на анализаторе антиоксидантной активности "Яуза-01-ААА" (НПО "Химавтоматика", Россия) [15].

Определение активности каталазы проводили по ско­рости утилизации перекиси водорода в гемолизате эрит­роцитов колориметрическим методом [16] и выражали в условных единицах активности по отношению к контролю. Активность супероксиддисмутазы в сыворотке крови определяли по способности супероксиддисмутазы ингибировать реакцию аутоокисления кверцетина [17, 18] и выражали в условных единицах активности.

Статистическую обработку полученных данных осу­ществляли с использованием системы статистического анализа R (R Development Core Team, 2008) и f-критерия Стьюдента. Статистически значимыми считали разли­чия при р<0,05 [19].

Результаты и обсуждение

В ходе исследований подтвержден дозозависимый характер интенсивности процесса сквашивания. Ди­намика рН приготовленных кисломолочного напитка и низколактозного кисломолочного напитка для различ­ных концентраций заквасочного материала представ­лена соответственно на рис. 1 и 2.

Установлено, что для обеспечения технологически ра­циональной продолжительности сквашивания порядка 5-6 ч необходимо внести 10±0,5% закваски к массе молока. Это позволяет не только оптимизировать параметры производственного цикла, но и существенно повысить качество готового кисломолочного продукта. На основе проведенных исследований разработан рег­ламент приготовления производственной закваски.

Следует отметить, что консистенция полученных кисломолочных продуктов характеризовалась более низкой вязкостью. Более выражено это проявлялось в низколактозном продукте, что, вероятно, связано с образованием в системе моносахаридов в результате гидролиза лактозы.

На основании полученных экспериментальных дан­ных установлены закономерности процесса гидролиза лактозы при варьировании параметрами: продолжи­тельность и температура процесса, дозировка β-галак-тозидазы, массовая доля сухих обезжиренных веществ в молочной смеси.

По органолептическим показателям продукт характе­ризуется выраженным кисломолочным вкусом и запа­хом, однородной в меру текучей консистенцией.

При микроскопировании препаратов готового про­дукта (рис. 3) установлено, что микрофлора продукта выраженно представлена кокковыми и палочковидными микроорганизмами.

Исследование иммунотропной активности кисломо­лочного напитка показало, что 30-дневное введение мышам вызвало увеличение (р<0,05) числа IgM-АОК в селезенке в 1,3 раза по сравнению с животными, не получавшими исследуемый продукт (24,7х103 на селе­зенку) (рис. 4).

Последующие исследования показали, что введе­ние кисломолочного напитка усиливало и эффекторную фазу реакции клеточного ответа на эритроциты барана. Так, у мышей, которым вводили дистилли­рованную воду (контрольная группа), индекс реакции составил 7,80%. У мышей основной группы после 30-дневного введения напитка индекс реакции увели­чился на 70%.

Применение кисломолочного продукта у иммунодефицитных мышей приводило к существенному (на 63%) увеличению антиоксидантного потенциала крови при восстановлении интенсивности свободнорадикального окисления (см. таблицу), что характеризовалось сниже­нием максимума вспышки и площади хемилюминесценции. При этом увеличивалась активность каталазы, что говорит о повышении в определенной мере адаптацион­ных возможностей организма, нарушенных введением иммуносупрессивного соединения.

Полученные результаты свидетельствуют о возмож­ности коррекции нарушений прооксидантно-антиоксидантной системы с помощью приема кисломолочного напитка на основе верблюжьего молока.

Таким образом, разработанная технология получе­ния кисломолочного напитка на основе верблюжьего молока (питьевой йогурт) позволяет получить пищевой продукт, обладающий выраженной иммуномодулирующей и антиоксидантной активностями. Установлено, что данный пищевой продукт в условиях эксперимен­тально вызванного иммунодефицита восстанавливает не только иммунный ответ, но и антиоксидантную ак­тивность организма. Полученные данные позволяют предположить, что указанные свойства кисломолочного продукта могут быть использованы в клинической прак­тике с целью профилактики и в комплексной терапии воспалительных заболеваний, при которых нарушена антиоксидантная защита организма, а также заболева­ний, сопровождающихся вторичными иммунодефицитными состояниями.

Литература

1. Yadav A. K., Kumar R., Priyadarshini L., Singh J. Composition and medicinal properties of camel milk: a review // Asian J. Dairy Food Res. 2015. Vol. 34, N 2. P. 83-91.

2. Guakhar K., Bernard F. A better knowledge of milk quality parameters: a preliminary step for improving the camel milk market opportunity in a transition economy - the case of Kazakhstan. Saving the Camel and Peoples' Livelihoods Building a Multi stockholder Platform for the Conservation of the Camelin Rajasthan, International conference. 23-25, Sadri, Rajasthan, India, 2004. P. 28-36.

3. Singh R., Ghorui S.K., Sahani M.S. Camel milk: properties and processing potential. The Indian camel. Bikaner : NRCC, 2006. P. 59-73.

4. Abu-Lehiya I.H. Composition of camel milk // Milchwissenschaf. 1987. Vol. 42. P. 368-371.

5. Farah Z. Camel Milk. Properties and Products. St Gallen, Switzerland : SKAT, 1996.

6. Yagil R. The camel: self-sufficiency in animal protein in drought- stricken areas // World Anim. Rev. (FAO). 1986. Vol. 57. P. 2-10.

7. Hansen M.A., Fernandes G., Good R.A. Nutrition and immunity: the influence of diet on autoimmunity and the role of zinc in the immune response // Ann. Rev. Nutr. 1982. Vol. 2. P. 151-157.

8. Mal G., Sena D.S., Jain V.K., Sahani M.S. Therapeutic value of camel milk as a nutritional supplement for multiple drug resistant (MDR) tuberculosis patients // Israel J. Vet. Med. 2006. Vol. 61, N 3-4. P. 88-94.

9. Morin D.E., Rowan L.L., Hurley W.L. Comparative study of proteins, peroxidase activity and N-acetyl-glucosaminidase activity in llama milk // Small Rumi. Res. 1995. Vol. 17. P. 255-261.

10. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals; Institute for Laboratory Animal Research (ILAR); Division on Earth and Life Studies (DELS); National Research Council of the national academies. 8th ed. Washington : The National Academies Press, 2011. 248 p.

11. Kiselev S.L. Molecular cloning and characterization of the mouse tag-7 gene encoding a novel cytokine // J. Biol. Chem. 1998. Vol. 273. P. 18 633-18 639.

12. Иммунологические методы исследований : пер. с англ. / под ред. И. Лефковитса, Б. Парнаса. М. : Мир, 1988. 530 с.

13. Лакомкин В.Л., Коновалова Г.Г., Каленикова Е.И. и др. Изменение антиоксидантного статуса миокарда под влиянием коэнзима Q10 при окислительном стрессе // Биохимия. 2005. Т. 70, вып. 1. С. 97-104.

14. Макеева А.В., Попова Т.Н., Матасова Л.В. Действие тиоктовой кислоты на функционирование антиоксидантной глутатионзависимой системы при токсическом гепатите крыс // Биомеди­цинская химия. 2007. Т. 53, вып. 2. С. 181-189.

15. Павлюченко И. И., Басов А. А., Федосов С. Р. Пат. на изобретение № 2236008, Российская Федерация, МПК G01N33/48. 10.09.2004. Бюл. № 25. 10 с.

16. Павлюченко И.И., Басов А.А., Федосов С.Р. Пат. на полезную модель № 54787 Российская Федерация, A61K 33/00. 27.07.2006 Бюл. № 21. 2 с.

17. Павлюченко И.И., Федосов С.Р., Басов А.А. Свидетельство об официальной регистрации программы для ЭВМ № 2006611562. 16.03.2006. 1 с.

18. Быков И.М., Басов А.А., Быков М.И., Ханферьян Р.А. Сравни­тельная характеристика антиоксидантного потенциала и энер­гетической ценности некоторых пищевых продуктов // Вопр. питания. 2013. № 3. С. 77-80.

19. Фетисов Е.А., Семипятный В.К., Петров А.Н., Галстян А.Г. Плани­рование и анализ результатов технологических экспериментов. М. : Сталинград, 2015. 98с.