Characteristic of the rats' immune status during vitamin and mineral deficiency

Abstract

The article presents the results of rats' immune status evaluation in conditions of different levels of B vitamins (B1, B2, B3, B6) and minerals (Fe3+ and Mg2+) supplying. Male Wistar rats (with initial body weight 90-110 g) within 65 days received model diets with 75, 30 and 19% content of the essential substances, females (with initial body weight 56-76 g) received diets with 75, 28 and 18% content. Some indicators of humoral and cellular immunity, including leukocyte count, lysozyme serum activity, IgG and IgE level, cytokine profile of blood serum and of the masses of the immune system internal organs have been examined. It has been shown that the decrease in the content of B vitamins, iron and mag­nesium in the diet didn't cause complex changes of the rats' immune status, therefore, the proposed model of adaptive potential change is not optimal for studying of immune sys­tem condtion. The extensive research of the immune status of rats (18 studied indicators, a sample of 90 males and 90 females) allows to set the range of physiological fluctuations of these indexes in Wistar rats of the corresponding gender and age.

Keywords:rats, immune status, adaptive potential, vitamin-mineral ration composition, humoral and cellular immunity

Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2017; 86 (6): 36-41.

Авторы статьи разработали модификацию витаминно-минерального состава рациона крыс, которая может быть использована в качестве модели снижения адаптационного потенциала крыс в токсикологических исследованиях при изучении объектов с неизвестной токсичностью, в частности новых видов пищевой про­дукции [1]. Принимая во внимание, что иммунный ста­тус является одной из составляющих адаптационного потенциала организма, были проведены исследования некоторых показателей гуморального и клеточного иммунитета у крыс линии Вистар, получавших модель­ные рационы с разными уровнями обеспеченности витаминами группы В (тиамином, рибофлавином, ниацином и пиридоксином), солями железа и магния. Следует отметить, что различные модификации моде­лей витаминной недостаточности были использованы в экспериментах по оценке безопасности наноматериалов [2], по выявлению наиболее чувствительных пока­зателей репродуктивной функции крыс [3] и др. [4-6]. Однако разработанная нами модель в значительной степени отличалась от ранее использованных, поэтому потребовалось проведение дополнительных исследо­ваний, направленных на изучение возможности данной модели при исследовании иммунного статуса крыс.

Цель настоящей работы - оценка иммунного ста­туса самцов и самок крыс в условиях оптимальной, маргинальной и субмаргинальной обеспеченности ви­таминами (В1, В2, В3, В6) и минеральными веществами (Fe3+ и Mg2+).

Материал и методы

Эксперимент длительностью 65 дней проводили на крысах линии Вистар с исходной массой тела самцов 90-110 г и самок - 56-76 г возраст крыс в начале эк­сперимента составлял 30 дней. Самцы и самки были разделены на 3 группы (по 30 самцов и 30 самок в каж­дой группе). Всего в эксперименте было использовано 180 животных. Крысы получали полусинтетический ка­зеиновый рацион с оптимальной (75%) дозировкой эссенциальных веществ (витаминов В1, В2, В3, В6 и мине­ральных веществ - Fe3+ и Mg2+), с маргинальной (30% для самцов и 28% для самок) и субмаргинальной (19% для самцов и 18% для самок) дозировками эссенциальных веществ (табл. 1). Экспериментальные рационы животные получали на протяжении всего срока иссле­дований.

Крыс содержали в пластиковых клетках (по 2 особи в клетке) с древесной подстилкой, в отапливаемом (тем­пературный режим 21-23°С) и вентилируемом помеще­нии с естественным освещением, доступ к корму и воде ad libitum. В течение экспериментов вели наблюдения за поедаемостью корма и общим состоянием животных. Массу тела измеряли еженедельно, постмортальную некропсию, взвешивание внутренних органов и отбор материала для гематологических и иммунологических исследований проводили на 65-й день эксперимента. Эвтаназию проводили в соответствии с Правилами лабораторной практики, утвержденными приказом Мин­здрава России от 01.04.2016 № 193н. За 12 ч до эвтана­зии животных лишали пищи.

Оценка иммунного статуса включала подсчет лейко­цитарной формулы, измерение лизоцимной активности сыворотки крови, определение содержания иммуно­глобулинов IgG, IgE, анализ цитокинового профиля сыворотки крови, а также определение массы органов иммунной системы (селезенки и тимуса).

Подсчет лейкоцитарной формулы выполнен с ис­пользованием гематологического анализатора "Coulter Aс-Tτм 5 diff OV" ("Beckman Coulter", США). Содержание иммуноглобулинов IgG, IgE определяли методом иммуноферментного анализа с использова­нием микропланшетного ридера "Anthos 2020" и стан­дартных иммуноферментных наборов (Rat IgG, кат. № E-EL-RO518; Rat IgE, кат. № E-EL-RO517, "Elabscience Biotechnology Co.Ltd", Китай). Лизоцимную активность сы­воротки крови определяли нефелометрическим методом по О.В. Бухарину, 1971 [7], основанным на изменении оптической плотности среды в результате способности лизоцима сыворотки крови лизировать тест-культуру Micrococcus lysodeikticus. Цитокиновый профиль крыс оп­ределяли с помощью наборов (Bio-Plex ProTM Rat Cytokine Th1/Th2 Assay, кат. 171-K1002M, "Bio-Rad", США). Иссле­дования проведены на мультиплексном проточном ана­лизаторе Luminex 200 ("Luminex Corporation", США).

Статистическую обработку проводили с использо­ванием пакета прикладных программ MS Excel 2007. Характер распределения количественных признаков оп­ределяли с помощью χ2-критерия, равенство дисперсий - с помощью F-критерия. Оценку статистической значи­мости различий средних величин проводили методом однофакторного дисперсионного анализа. Критический уровень значимости нулевой статистической гипотезы (p) принимали равным 0,05 [8].

Результаты и обсуждение

На протяжении эксперимента не отмечено гибели крыс, общее состояние животных было удовлетворительным. По внешнему виду, качеству шерстного покрова и по­ведению крысы 3 групп не различались между собой. Еженедельный прирост массы тела самцов и самок, получавших рационы с оптимальным содержанием эссенциальных веществ (группа "75"), был несколько выше, чем у крыс маргинальной группы (группа "30" для самцов и "28" для самок), в конце эксперимента на 4% у самцов и на 1% у самок (p>0,05), у субмаргиналь­ной группы (группа "19" для самцов и "18" для самок) -на 18% у самцов и 10% у самок (p<0,05) (см. рисунок).

На этапе постмортальной некропсии были выделены и взвешены внутренние органы, в данной статье при­ведены массы органов иммунной системы - тимуса и селезенки (табл. 2). Относительная масса тимуса у крыс субмаргинальной и маргинальной групп была несколько ниже, чем у крыс оптимальной группы: на 14 (p<0,05) и 8% (p>0,05) у самцов; на 8 и 2% (p>0,05) у самок соответственно. Относительная масса се­лезенки у самцов субмаргинальной и маргинальной групп была на 11 (p>0,05) и 15% (p<0,05) ниже, чем у самцов оптимальной группы, тогда как у самок ко­лебания массы селезенки не превышали 2% (p>0,05) между группами, и самая высокая масса была отмечена у животных маргинальной группы. Анализ полученных данных позволил выявить определенную тенденцию к снижению относительной массы тимуса в зависи­мости от снижения обеспеченности эссенциальными веществами, в большей степени это проявлялось на примере массы тимуса у самцов, в меньшей - у самок. Масса селезенки самцов в группах, получавших марги­нальные и субмаргинальные дозы витаминов и минеральных веществ, также демонстрировала снижение, однако взаимосвязи с дозами не прослеживалось и значение этого показателя в группе с субмаргиналь­ной обеспеченностью было выше, чем в группе с мар­гинальной обеспеченностью.

Лейкоцитарный профиль самцов и самок всех групп не демонстрировал значимых различий, которые можно было бы связать с составом рационов (табл. 3). Тем не менее отмечено снижение содержания моноцитов: у самок субмаргинальной и маргинальной групп -на 23 и 22% (р<0,05) по сравнению с уровнем у крыс оп­тимальной группы; у самцов соответственно на 13 и 6% (р>0,05). Вместе с тем все показатели лейкоцитарной формулы не выходили за пределы физиологических колебаний, характерных для крыс [9-12].

Лизоцимная активность сыворотки крови (табл. 4) у самцов 3 групп не имела существенных различий, значения колебались в сравнительно узком диапазоне от 32 до 50%. У самок аналогичный показатель характеризо­вался более высокой вариабельностью значений в диа­пазоне от 1 до 60%, отмечено повышение показателя у самок субмаргинальной и маргинальной групп по сравнению с оптимальной группой на 75 (p<0,05) и 7% (p>0,05) соответственно.

Концентрация иммуноглобулинов у крыс всех групп не имела статистически значимых различий и не де­монстрировала очевидной зависимости от состава ра­ционов (табл. 5). Содержание IgG у самцов варьировало в диапазоне 0,661-5,763 нг/мл, у самок - в диапазоне 0,489-8,688 нг/мл; содержание IgE у самцов - в диапа­зоне 35,3-296,6 нг/мл, у самок 106,8-293,8 нг/мл. Сле­дует отметить, что у самцов диапазон колебаний уровня IgE был несколько выше, чем у самок, а диапазон ко­лебаний IgG, напротив, ниже чем у самок. Сравнительная оценка содержания иммуноглобулинов у самцов и самок выявила половые различия, что подтверждается результатами исследований [13], на основании которых были сделаны выводы о том, что половые различия им­мунной системы определяются кариотипом и влиянием стероидных половых гормонов: эстрогенов, прогестинов и андрогенов.

Определение уровня интерлейкинов (ИЛ) не выявило статистически достоверных различий между группами, получавшими рационы с разными уровнями обеспе­ченности эссенциальными микронутриентами (табл. 6). Вместе с тем выявлены определенные половые раз­личия, более выраженные у самок и самцов, полу­чавших оптимальные рационы (в среднем у самцов в 10 раз выше содержание ИЛ-1а, ИЛ-2 и ИЛ-4), тогда как у крыс с маргинальными и субмаргинальными уров­нями обеспеченности половые различия были менее значительными (в 2-2,5 раза выше у самцов, чем у самок).

Таким образом, не выявлено комплексных изменений иммунного статуса крыс в зависимости от уровня обеспеченности эссенциальными веществами, все отмечен­ные различия не являлись бесспорным свидетельством взаимосвязи содержания витаминов группы В - тиамина (В1), рибофлавина (В2), ниацина (В3), пиридоксина (В6) и дефицита минеральных веществ - железа (Fe3+) и магния (Mg2+) в рационе. Предложенная модель из­менения адаптационного потенциала не является оп­тимальной для изучения иммунного статуса. Вместе с тем проведенные масштабные исследования иммун­ного статуса крыс (изучено 18 показателей, выборка из 90 самцов и 90 самок) позволяют с определенной долей условности установить диапазон физиологичес­ких колебаний этих показателей у крыс линии Вистар соответствующего пола и возраста. Поскольку уро­вень ИЛ у крыс на таком объеме выборки был изучен впервые, полученные данные, вне всяких сомнений, уникальныи будут в дальнейшем использованы в экспе­риментальных исследованиях.

Исследование проведено при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 16-16-00124).

Литература

1. Тышко Н.В., Садыкова Э.О., Тимонин А.Н., Шестакова С.И., Требух М.Д., Пашорина В.А. Модификация витаминно-минераль-ного состава рационов как модель снижения адаптационного потенциала крыс для токсикологических исследований // Вопр. питания. 2016. Т. 85, № 6. C. 64-71.

2. Гмошинский И.В., Вржесинская О.А., Шумакова А.А., Шипелин В.А., Коденцова В.М., Хотимченко С.А. Воздействие наноразмер-ного диоксида кремния аморфного на усвояемость витаминов В1, В2 и В6 у крыс // Вопр. питания. 2016. Т. 85, № 6. С. 72-79.

3. Тышко Н.В., Селяскин К.Е., Мельник Е.А., Пашорина В.А., Жминченко В.М. Оценка репродуктивной функции крыс при раздельном и сочетанном воздействии алиментарного и токсического факторов // Вопр. питания. 2012. Т. 81, № 1. С. 33-43.

4. Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Бекетова Н.А., Сото С.Х. и др. Биохимические показатели плазмы крови и некоторые параметры антиоксидантого статуса крыс при полигиповитаминозах разной степени // Бюл. экспер. биол. 2012. № 10. С. 439-442.

5. Коденцова В.М. Витамины. М. : МИА, 2015. 408 с.

6. Кравченко Л.В., Аксенов И.В., Трусов Н.В., Гусева Г.В. и др. Вли­яние поливитаминной недостаточности на активность ферментов метаболизма ксенобиотиков в печени крыс // Вопр. питания. 2012. Т. 81, № 2. С. 28-33.

7. Бухарин О. В. Применение таблицы для определения количества лизоцима в сыворотке крови // Материалы межкафедр. совещ. "Вопросы неспецифического иммунитета". Оренбург, 1971. С. 162-163.

8. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ Statistica. М. : Медиа Сфера, 2006. 312 с.

9. Мустафина О.К., Трушина Э.Н., Шумакова А.А., Арианова Е.А., Тышко Н.В., Пашорина В.А. Гематологические показатели у крыс Вистар разного возраста, содержащихся на полусинтетическом полноценном виварном рационе // Вопр. питания. 2013. № 2. С. 10-16.

10. Lewi P.J., Marsboom R.P. Toxicology reference data - Wistar rat. Amsterdam : Elsevier, North-Holland Biochemical, 1981. 358 p.

11. Suckow M.A., Weisbroth S.H., Franklin C.L. The Laboratory Rat. Burlington : Elsevier Academic Press, 2006. 912 p.

12. Tucker M.J. Diseases of the Wistar Rat. London : Taylor and Francis, 1997. 272 p.

13. Klein S. L., Roberts C. W. Sex Hormones and Immunity to Infection. Berlin, Heidelberg : Springer, 2010. 329 p.