Determination of N-nitrosodiphenylamine in meat canned food for children by the method of chromato-mass-spectrometry

AbstractThis study demonstrates the results obtained from the GC/MS experimental determination of low concentrations of N-nitrosodiphenylamine in meat canned baby food in the concentration range of 0.027-3.89 mg/kg. The perfect conditions of sample preparation (extraction with organic solvent and solid phase extraction) as well as the application of the chromatography-mass spectrometry allowed us to detect N-nitrosodiphenylamine in samples of the meat canned baby food with high selectivity in concentrations ranged from 0.016 to 5 mg/kg when an error of 23% was assumed. The use of the reaction of transesterification of fatty acids by potassium methylate, the removal of the ester generated from the samples of canned meat by organic solvent (hexane), concentrating of N-nitrosodiphenylamine in the aqueous layer on the cartridges of an automatic solid-phase extraction system provided 99.94% extraction of N-nitrosodiphenylamine from the canned meat samples. The experiment has made evident the presence of N-nitrosodiphenylamine in the samples of canned meat (beef + chicken) with the help of mass-spectrometry method in the mode of full ion scanning using the AMDIS automatic mass-spectral identification system.

Keywords:baby food, canned meat, N-nitrosodiphenylamine, chromatography-mass spectrometry, solid phase extraction

Problems of Nutrition. 2017; 86 (5): 56-62. doi: 10.24411/0042-8833-2017-00077.

Продовольственная безопасность страны - неотъ­емлемая часть ее национальной безопасности. Улучшение обеспечения населения, особенно детского, пищевыми продуктами надлежащего качества пред­ставляет собой важную социально-экономическую задачу, решение которой имеет огромное значение для России [1].

Обеспечение безопасности пищевых продуктов, в том числе детского питания, по содержанию химических соединений и других загрязнителей регламентируется СанПиН 2.3.2.1078-01, Техническими регламентами Та­моженного союза (ТР ТС 021/2011, ТР ТС 034/2013, ТР ТС 033/2013) [2-4]. Вместе с тем далеко не все потен­циально опасные и токсичные соединения регламентиру­ются в этих документах. Особую опасность представляет группа высокотоксичных, канцерогенных N-нитрозоа-минов (NAS) (N-нитрозодиметиламин, N-нитрозометил-этиламин, N-нитрозодиэтиламин, N-нитрозопирролидин, N-нитрозоди-н-пропиламин, N-нитрозопиперидин, N-нит-розоди-н-бутиламин, N-нитрозодифениламин), которые определяются практически во всех мясных и рыбных продуктах и контролируются в странах ЕС. По результа­там зарубежных исследований (Италия, Дания, Китай) в мясных продуктах были обнаружены N-нитрозоамины, в том числе N-нитрозодифениламин в диапазоне концен­траций 0,051-9,4 мг/кг продукта [5-7].

В Техническом регламенте Таможенного союза (ТР ТС 034/2013 Приложение 3) [4] не допускается в консервах из мяса для питания детей раннего возраста содержа­ние суммы N-нитрозоаминов (N-диметилнитрозоамина и N-диэтилнитрозоамина).

Поступление N-нитрозоаминов в пищевую продукцию возможно в результате добавления нитритов и нитра­тов в качестве пищевых добавок в мясные продукты с целью совершенствования технологии, сохранения или улучшения качества продукта и пищевых свойств [8, 9]. Нитраты в организме человека восстанавлива­ются до нитритов, которые способствуют образованию канцерогенных N-нитрозоаминов [10].

Среди группы N-нитрозоаминов по физико-хими­ческим характеристикам особое место занимает N-нитрозодифениламин. Это твердое вещество с вы­сокой температурой кипения - 346,5 °С, не расщеп­ляется растворами щелочей и разбавленных кислот, не подвергается разрушающему действию рассеян­ного света, обладает слабыми основными свойствами, окисляется до N-нитроаминов, восстанавливается до диалкилгидразинов, в кислой среде отщепляет азо­тистую кислоту [11]. Эти свойства N-нитрозодифени-ламина предопределяют его длительное присутствие в пищевых продуктах.

Цель данного исследования - определение содер­жания N-нитрозодифениламина в детских мясных кон­сервах с использованием хромато-масс-спектрометрической системы (ГХ/МС) и твердофазной экстракции на этапе подготовки пробы.

Материал и методы

Анализ образцов мясных консервов на содержание N-нитрозодифениламина выполняли с использованием газовой хроматографической системы Agilent 7890А ("Agilent Technologies", США) с квадрупольным масс-спектрометрическим детектором (MCD) 5975С. Для раз­деления использовали кварцевую капиллярную колонку HP-FFAP длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм и толщиной пленки неподвижной фазы 0,25 мкм. Режим программирования колонки: начальная температура 50 °С, повышение температуры до 120 °С со скоро­стью 8 °С/мин; от 120 до 185 °С со скоростью 12 °С/мин и от 185 до 240 °С со скоростью 25 °С/мин, с выдержкой при конечной температуре 5 мин. В качестве газа-но­сителя использовали гелий; скорость газа-носителя -1,0 см3/мин в режиме постоянного потока. Температура аналитического интерфейса 220 °С, время удержива­ния N-нитрозодифениламина - 21,7 мин. Ввод пробы осуществляли с помощью автосамплера Agilent ALS ("Agilent Technologies", США) в режиме pulsed/splitless; объем пробы 2 мкл.

Режим работы масс-спектрометрического детектора (для качественного и количественного анализа в диапа­зоне низких концентраций 0,016-5,0 мг/кг): селективный ионный мониторинг (SIM,) по 3 характеристическим ионам анализируемого соединения 167, 168, 169 m/z, образующимся при отщеплении от молекулы N-нитро-зодифениламина группы NO.

Режим сканирования (SCAN) в диапазоне 50-250 m/z использовали для подтверждения структуры изучаемого соединения в более высоком диапазоне концентраций N-нитрозодифениламина (от 0,05 до 1,0 мг/кг) путем сравнения масс-спектров обнаруженного химического соединения в пробе мясных консервов с масс-спектром масс-спектральных данных NIST 08.L для ручной иден­тификации. Для автоматической идентификации приме­няли AMDIS библиотеки.

Использовали стандартный раствор (2 мг/дм3) смеси N-нитрозоаминов EPA 521 Nitrosamine Mix (Supelco Analytical, USA), состоящий из N-диметилнитрозоамина, N-мети-лэтилнитрозоамина, N-диэтилнитрозоамина, N-пир-ролидиннитрозоамина, N-морфолиннитрозоамина, N-ди-бутилнитрозоамина, N-дипропилнитрозоамина, N-пипери-диннитрозоамина и N-дифенилнитрозоамина.

Ввиду сложного состава матрицы пищевых продуктов и низкого содержания в них определяемого соединения на этапе подготовки пробы требуется концентрирова­ние, очистка экстракта и селективное выделение анали­зируемого вещества [12].

Известно, что мясные консервы для детского питания представляют собой измельченное в различной степени мясо (говядину, свинину, баранину, телятину, мясо яг­ненка, кур, индеек, и др.), к которому может быть добав­лен соответствующий мясной бульон, смесь сливочного и растительного масла, обеспечивающие обогащение консервов незаменимыми полиненасыщенными жир­ными кислотами (линолевой и линоленовой). Вместе с тем жировой компонент биологического происхожде­ния мешает селективному извлечению N-нитрозодифе-ниламина из пищевого продукта.

Для удаления из исследуемых образцов мясных кон­сервов (навеска 5 г) жиров биогенного происхождения и эффективного извлечения N-нитрозодифениламина выполняли реакцию переэтерификации жиров метилатом калия путем добавления к пробе 10 см3 раствора метилата калия в метаноле концентрацией 162 г/дм3. Затем смесь нагревали при температуре 60-70 °С и данную температуру поддерживали в течение 120 мин для образования метилового эфира жирных кислот. По­лученную смесь помещали в центрифужную пробирку объемом 50 см3, добавляли 10 см3 гексана, перемеши­вали и центрифугировали при 4500 об/мин (центрифуга Eppendorf 5804, "Eppendorf", Германия) в течение 20 мин. Верхний гексановый слой, содержащий эфиры жирных кислот, удаляли дозатором. В оставшийся нижний слой, содержащий N-нитрозодифениламин, глицерин, мета­нол, добавляли 45 см3 воды, интенсивно встряхивали в течение 10 мин и смесь оставляли на 12 ч при темпе­ратуре +5 °С для удаления остатков жирных кислот. По истечении 12 ч пробирку со смесью центрифугировали при 4500 об/мин в течение 20 мин с целью отделения остатков мясных консервов от водного слоя и водный слой, содержащий N-нитрозодифениламин, пропускали через угольный картридж "Supelco Superclean Coconut" объемом 6 см3, массой сорбента 2 г, с использова­нием системы твердофазной экстракции ("Separths", Италия).

На основании экспериментальных исследований ус­тановлено, что добавление к анализируемой пробе метилата калия объемом 10 см3 для удаления жи­рового компонента, экстракции метиловых эфиров жирных кислот гексаном, использование картриджей "Supelco Superclean Coconut" твердофазной экстра­кции на этапе подготовки пробы позволило достичь полноты извлечения N-нитрозодифениламина 99,94% (n=8).

Для количественного определения содержания N-дифенилнитрозамина выполняли хромато-масс-спектрометрический анализ стандартных растворов и на основе результатов измерений строили градуировочную зависимость в режиме селективного ионного детекти­рования (SIM) по характеристическим ионам соедине­ния 167, 168, 169 m/z (ион 168 m/z использовался для количественного определения, два другие в качестве подтверждающих) в диапазоне концентраций 0,0002­0,0016 мг/кг. Правильность методики оценена методом добавок аналита на трех уровнях концентраций 0,0002, 0,0008 и 0,0016 мг/кг. Погрешность методики составила 23% (табл. 1).

Результаты и обсуждение

На отечественном рынке продуктов детского питания представлен широкий ассортимент мясных консервовдетского питания. Были выполнены скрининговые ис­следования образцов мясных консервов для детского питания. Для того чтобы проба была представительной, а полученные результаты достоверными, из разных партий отбирали 5 раз навеску образца мясных кон­сервов и проводили подготовку пробы для каждого об­разца с последующим хромато-масс-спектрометрическим анализом. Результаты исследований представлены в табл. 2.

Пример хроматографического определения извле­ченного N-нитрозодифениламина из образца детских мясных консервов "говядина + цыпленок", в котором обнаружена наибольшая концентрация N-нитрозоди-фениламина в режиме сканирования по селективно избранным ионам m/z 167, 168, 169, представлен на рис. 1.

Дополнительным идентификационным признаком, определяющим, что в образце мясных консервов "го­вядина + цыпленок" был обнаружен N-нитрозодифе-ниламин, является поиск целевых ионов, реализуемый системой ChemStation. Для этого приводятся результаты хроматографического разделения извлеченных инте­ресующих ионов (целевой m/z 167 и подтверждающие ионы m/z 168, m/z 169, характеризующиеся наибольшей интенсивностью) и показываются в совмещенном виде (рис. 2).

На рис. 2 показано, что профили характерис­тических ионов N-нитрозодифениламина m/z 168, m/z 169 и m/z 167 по наиболее интенсивным массам совмещаются при совпадении времени удерживания 21,7 мин со стандартным раствором концентрацией С=2,0 мг/кг, что служит весомым доказательством присутствия данного соединения в образце про­дукта для детского питания.

Для оценки возможности идентификации N-нитрозоди-фениламина, обнаруженного в образцах мясных консер­вов для детского питания, при работе масс-спектрометра в режиме полного сканирования ионов использовали автоматическую систему масс-спектральной идентифи­кации AMDIS. Масс-спектр N-нитрозодифениламина, по­лученный автоматической системой масс-спектральной идентификации (AMDIS), представлен на рис. 3.

Анализ рис. 3 показал, что масс-спектр N-нитрозоди-фениламина образца детских мясных консервов совпал с масс-спектром из библиотеки. Программное обеспе­чение AMDIS позволило не только провести идентифи­кацию соединений на хроматограмме, но и выделить из перекрывающихся пиков "чистый" спектр N-нитрозоди-фениламина.

Масс-спектр N-нитрозодифениламина с характерис­тическими ионами и структурная формула из библио­теки масс-спектров представлены на рис. 4.

Полное совпадение профилей характеристических ионов N-нитрозодифениламина по наиболее интен­сивным массам m/z 168, m/z 169 и m/z 167 (рис. 4), с учетом совпадения времени удерживания 21,7 мин по стандартному раствору концентрацией С=0,16 мкг/см3 позволяет говорить о том, что определяемое соеди­нение идентифицировано и его наличие в образцах пищевых продуктов для питания детей доказано с помо­щью точного метода проверки автоматической системы масс-спектральной идентификации AMDIS.

Таким образом, анализ различных образцов мясных консервов детского питания методом газовой хромато­графии с масс-селективным детектированием позволил определить N-нитрозодифениламин в диапазоне кон­центраций 0,027-3,89 мг/кг.

Для подтверждения присутствия N-нитрозодифенила-мина в образцах мясных консервов выполнена иден­тификация при работе масс-спектрометра в режиме полного сканирования ионов автоматической системой масс-спектральной идентификации AMDIS. Масс-спектр N-нитрозодифениламина по характеристическим ионам в исследованных образцах мясных консервов совпадает с масс-спектром библиотеки масс-спектральных данных.

Литература

1. Указ Президента РФ от 30.01.2010 № 120 "Об утверждении Доктрины продовольственной безопасности Российской Феде­рации".

2. Гигиенические требования к качеству и безопасности продо­вольственного сырья и пищевых продуктов. Санитарные прави­ла и нормы 2.3.2.1078-01. М., 2002.

3. ТР ТС 021/2011 Технический регламент Таможенного союза "О безопасности пищевой продукции".

4. ТР ТС 034/2013 "Гигиенические требования безопасности про­дуктов убоя, предназначенных для производства мясной про­дукции для детского питания".

5. URL: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0278691515000873.

6. Herrmann S.S., Duedahl-Olesen L., Granby K. Simultaneous deter­mination of volatile and non-volatile nitrosamines in processed meat products by liquid chromatography tandem mass spectrometry using atmospheric pressure chemical ionisation and electrospray ionization // J. Chromatogr. A. 2014. Vol. 1330. P. 20-29.

7. Al-Kaseem M., Al-Assaf Z., Karabeet F. Determination of seven vola­tile N-nitrosamines in fast food // Pharmacol. Pharm. 2014. Vol. 5. P. 195-203.

8. Шаулина Л.П., Корсун Л.Н. Контроль качества и безопасности пищевых продуктов и продовольственного сырья : учеб. посо­бие. Иркутск : Изд-во ИГУ, 2011. 111 с.

9. Жукова Г.Ф., Торская М.С., Родин В.И. N-нитрозамины и нитриты в мясе и мясопродуктах // Вопр. питания. 1999. № 4. С. 32-34.

10. Комарова В.И. Метаболизм нитратов в ротовой жидкости человека : автореф. дис. ... канд. биол. наук. СПб., 2001. 20 с.

11. Зульфигаров О.С., Юрченко В.В., Каширина Н.В., Стадничук Н.А. К вопросу об определении N-нитрозоаминов в пищевых продук­тах. Киев : Институт экогигиены и токсикологии им. Л.И. Мед­ведя, 2004.

12. Ярошенко Д.В., Карцова Л.А. Матричный эффект и способы его устранения в биоаналитических методиках, использующих хромато-масс-спектрометрию // Журн. аналит. химии. 2014. Т. 69, № 4. С. 1-8.