Characteristic of efficiency experimental evaluation of zinc oxide nanoparticles use in nutri-tion experiments on the laboratory animal

AbstractIn experiments on rats there was researched bioavailability of zinc oxide (ZnO) nanopаrticles. There were determined the content of Zn in blood serum and tibia, intestinal uptake of macromolecules of egg albumin, some hematological, biochemical and immune indices, liver cells apoptosis. The results obtained show that the uptake of nanoparticles of ZnO enables restoration of this microelement status damaged by zinc deficit diet.

Keywords:zinc oxide, nanoparticles, rats, bioavailability

Цинк (Zn) играет важную роль в организме человека и животных,входя в состав более чем 200 функционально активных белков, включая многие ферменты [6, 7]. Отмечающийся среди населения ряда развивающихся стран дефицит Zn, тесно сопряженный с недостаточным потреблением белка животного происхождения, частным возникновением гельминтозов и развитием диареи, проявляется, в первую очередь, резкой задержкой роста и полового развития, дерматитом, снижением противоинфекционного иммунитета [8]. В России клинические признаки недостаточности Zn встречаются крайне редко, однако, согласно данным неоторых авторов [3, 12 и др.], обеспеченность российского населения (особенно детей) Zn может быть не оптимальной. Ввиду этого актуальным представляется обогащение данным микроэлементом ряда пищевых продуктов массового потребления или использование цинксодержащих биологически активных добавок к пище (БАД). При этом возникает вопрос о способах введения дополнительного Zn [4-6].

Развитие нанотехнологий позволяет по-новому подойти к вопросу о формах эссенциальных элементов, применяемых в питании человека. Наночастицы (НЧ) неорганических веществ, в том числе оксида цинка (ZnO), отличаются, согласно ряду данных [2, 9], повышенной способностью к проникновению через биологические барьеры, а также повышенной химической активностью и растворимостью. Вследствие этого есть основания полагать, что НЧ ZnO могут быть эффективным источником Zn в питании человека. Целью настоящей работы было изучение возможности коррекции недостаточности Zn у крыс с использованием НЧ ZnO.

Материал и методы

В работе использованы препарат НЧ ZnO фирмы "Sigma-Aldrich" (США-Германия), а также сульфат цинка семиводный (ZnSO4Ч7Н2О) химически чистый (х.ч.). Размер НЧ, по данным фотонно-корреляционной спектроскопии на приборе "Рhotocor Complex" (производства фирмы "Photocor Instruments", США) составил в среднем около 30 нм1.

Проведены 3 серии эксперимента. В 1-й серии на 2 группах крыс (по 28 животных в каждой) по стандартной методике [7] изучали острую токсичность препаратов НЧ ZnO и сульфата цинка семиводного (ZnSO4), которые вводили однократно внутрижелудочно в виде дисперсии этих НЧ и раствора указанной соли. На протяжении данной серии эксперимента (14 дней) животные получали стандартный полусинтетический рацион [7]. По окончании данного эксперимента животных умерщвляли путем декапитации под легким эфирным наркозом.

Целью исследования во 2-й и 3-й сериях опыта было изучение биодоступности Zn. Эксперименты проводили на полученных из питомника РАМН "Столбовая" белых крысах-самцах Вистар с исходной массой тела в среднем 81±2 г.

Алиментарную недостаточность Zn воспроизводили согласно [1]. Для этого крысы были разделены на 6 групп (по 8-10 животных в каждой). На протяжении 14 дней они получали полусинтетический цинкдефицитный корм производства фирмы "MP Biomedicals" (США) (по данным атомно-абсорбционной спектрофотометрии, содержание Zn <0,03 мг/кг) и деионизованую воду без ограничений. Затем опытные животные 2-й и 3-й групп (из 2-й серии опытов) на фоне указанного цинкдефицитного рациона получали в течение 35 дней ежедневно внутрижелудочно 1 раз в день указанные выше препараты НЧ ZnO в виде диспесии и соль ZnSO4 в дозе 0,4 мг на 1 кг массы тела в расчете на Zn. Опытные животные 5-й и 6-й групп (3-я серия эксперимента) получали внутрижелудочно по той же схеме, что крысы 2-й и 3-й групп, но в течение не 35, а 14 дней; дисперсию НЧ ZnO и соль ZnSO4 - в дозе 13 мг Zn на 1 кг массы тела. Животные 1-й и 4-й групп, находившиеся на цинкдефицитном рационе, получали внутрижелудочно деионизованную воду по той же схеме, что и опытные крысы (2, 3, 5 и 6-й групп) - препараты Zn. Всех животных содержали в пластмассовых клетках по 3-4 особи в каждой клетке, регулярно (2 раза в сут) сменяя подстилку во избежание копрофагии. Металлические (хромированные) детали клеток контролировали на отсутствие Zn в смывах с их поверхности. Крысы 7-й, контрольной, группы, получали сбалансированный общевиварный рацион (ОВР).

Животных всех групп еженедельно взвешивали на электронных весах с точностью до ±0,5 г и определяли динамику прироста массы тела.

По окончании введения препаратов Zn все животные 2-й и 3-й серии опыта получали внутрижелудочно через зонд по 2 г/кг лиофилизованный белок куриного яйца в виде 10% раствора в 0,15 М NaCl. Через 3 ч после введения животным данного белка крыс умерщвляли под эфирной анестезией путем обескровливания, проводили патолого-анатомическое вскрытие, взятие внутренних органов (печени, почек, селезенки, сердца, семенников, тимуса, легких, надпочечников, мозга), а также бедренной кости (освобожденной от массы скелетной мускулатуры) и образцов крови. Путем взвешивания их на электронных весах определяли с точностью ±0,01 г абсолютную и относительную массу данных внутренних органов и бедра. Взятые образцы крови подвергали биохимическим, гематологическии и иммунологическим исследованиям. В сыворотке крови выявляли активность щелочной фосфатазы (ЩФ) с помощью набора "BIO TEST Щелочная фосфатаза 120 (ALP 2*60)" (Чехия). Содержание Zn в бедренных костях определяли методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии на приборе "Solaar 969 AA Sbeam" [11]2. Степень всасывания в кишечнике макромолекул овальбумина куриного яйца (ОВА) оценивали по его концентрации в сыворотке крови с помощью твердофазного двухвалентного иммуноферментного теста [11]. Гематологические показатели, включая параметры эритропоэза (число эритроцитов, гематокрит, средний объем эритроцита, содержание и концентрация Hb в эритроците), общее количество лейкоцитов, лейкоцитарную формулу, общее количество тромбоцитов определяли на гематологическом анализаторе "Coulter AC TTM 5 diff OV" (фирма "Beckman Coulter", США).

Иммунологические показатели и апоптоз гепатоцитов изучали на проточном цитофлюориметре фирмы "Beckman Coulter International S.A." (США). Экспрессию CD45RA, CD3, CD4, CD8, CD161a на лимфоцитах периферической крови определяли методом прямого иммунофлюоресцентного окрашивания клеток цельной крови с использованием панели моноклональных антител, конъюгированных с флюоресцентными красителями: FITC, PC7, APC (IO Test, Beckman Coulter, США) и лизирующего/фиксирующего набора реагентов ImmunoPrep (Beckman Coulter, США). Для исследования апоптоза суспензию гепатоцитов получали с помощью автоматической системы для механической гомогенизации ткани BD Medimachine, производства фирмы "Becton Dickenson and Company", США. Окрашивание гепатоцитов (концентрация клеток - 1Ч106 см-3) производили конъюгированным с флюорохромом (FITC) аннексином V (AnV-FITC) и витальным красителем 7-аминоактиномицином (7-AAD). Иссеченные кусочки печени и клеточную суспензию в процессе работы хранили на льду. Результаты выражали как процентное соотношение живых клеток и гепатоцитов, находящихся на разных стадиях распада (апоптоза) на 10 000 просчитанных объектов в каждом образце.

Статистическую обработку результатов измерений проводили с помощью пакета компьютерных программ SPSS 17.0, используя непараметрический ранговый критерий Манна-Уитни (ANOVA) и определение средней арифметической и ее ошибки (М±m).

Результаты и обсуждение

При определении острой токсичности (1-я серия эксперимента) раствор ZnSO4 и суспезию НЧ ZnO вводили крысам однократно внутрижелудочно в количестве 115; 1150 и 5750 мг/кг в расчете на Zn. Соответственно, летальность животных при этих 3 дозах составила для соли 0/9 (0%), 3/9 (33%) и 10/10 (100%), а для НЧ - 0/9 (0%), 0/9 (0%) и 2/10 (20%)1. Из этих данных следует, что ZnSO4, вводимый внутрижелудочно крысам, характеризуется величиной LD50 около 2500 мг/кг массы тела, то есть относится к III классу опасности (умеренно опасные вещества). Летальность в результате введения высоких доз НЧ ZnO была достоверно ниже, чем в случае введения соли ZnSO4 в эквивалентных по Zn количествах (р<0,05, критерий χ2), и оцененная путем экстраполяции величина LD50 для НЧ составила не менее 10 000 мг/кг. Таким образом, НЧ ZnO могут быть отнесены к IV классу опасности (малоопасные вещества).

Полученный результат показывает, что острая токсичность НЧ значительно ниже, чем у традиционной формы Zn.

Потребление цинкдефицитного корма в течение 14 сут привело к существенной задержке прироста массы тела животных всех опытных групп по сравнению с животными 7-й группы, получавшими ОВР (р<0,05 для 1-6-й групп). Введение НЧ ZnO и раствора ZnSO4 в дозе 0,4 мг/кг крысам 2-й и 3-й группы на протяжении последующих 35 дней не приводило у них к нормализации темпов роста. Прирост массы тела животных за все 49 дней эксперимента во 2-й группе, получавшей НЧ, и в 3-й группе, получавшей соль Zn, недостоверно отличался от прироста массы тела животных 1-й группы с недостаточностью Zn, составившей 68,5±11,5%. За то же время прирост массы тела крыс, потреблявших ОВР (7-я группа), составил 232±8% (р<0,001 в сравнении с 1-3-й группами). В конце эксперимента у крыс 1-3-й групп отмечались достоверное (р<0,05) снижение относительной массы всех изученных внутренних органов в сравнении с 7-й группой. Активность ЩФ составила в этих группах соответственно 1,40±0,15; 1,19±0,32 и 1,01±0,29 против 3,44±0,56 мкмоль/мин/см3 в 7-й группе; содержание Zn в бедренной кости - 51,2±2,3, 57,3±1,8 и 64,4±3,6 против 99,2±6,5 мг в 7-й группе (р<0,001 при сравнении 7-й группы с 1-3-й группами; р>0,05 при попарных сравнениях 1-3-й групп по обоим показателям). Всего за 49 дней эксперимента в 1-й группе погибло 5 (50%) крыс, во 2-й группе - 4 (40%) и в 3-й - 3 (30%) крысы.

В совокупности полученные данные позволяют заключить, что доза Zn 0,4 мг/кг массы тела в форме как НЧ, так и соли была неадекватно мала для крыс на фоне потребления данного вида корма и не позволила восстановить статус Zn. Ввиду этого во 2-й серии экспериментов доза обеих форм Zn была увеличена до 13 мг на 1 кг массы тела.

Как следует из данных табл. 1, в результате 14-суточного введения НЧ ZnO и ZnSO4 крысам 5-й и 6-й групп их масса тела возрастала практически одинаково и достоверно (р<0,001) быстрее, чем у животных 4-й группы, продолжавших испытывать недостаточность Zn. На рисунке представлена репрезентативная фотография крыс из 4-й (недостаточность Zn) и 5-й (получавших НЧ ZnO) групп. Наблюдаемые клинические проявления (отставание в росте, нарушение пропорций тела, дерматит) полностью устранялись у всех животных 5-й и 6-й групп в результате 2-недельного введения НЧ.

Как следует из данных табл. 2, относительная масса некоторых органов (почки, семенники, легкие) у животных 4-й группы достоверно отличалась от соответствующих значений для животных 5-й и 6-й групп. Вместе с тем различий между животными 2 последних групп, получавшими разные источники Zn, ни по одному из параметров не выявлено.

Крысы одного возраста: вверху - из 1-й группы (дефицит цинка), внизу - из 2-й группы (восстановление с помощью наночастиц ZnO)

В обеих группах животных, получавших добавки Zn (5-я и 6-я группы), величина всасывания ОВА в кишечнике составила соответственно 0,25±0,05 и 0,45±0,09%Ч103 от введенной дозы и была в среднем ниже, чем у животных с недостаточностью Zn (4-я группа) - 0,88±0,38% (различие на уровне тенденции, р>0,1). При сравнении животных 5-й и 6-й групп данный показатель достоверно не различался. Таким образом, введение крысам НЧ ZnO не вызывает усиленного проникновения во внутреннюю среду организма из желудочнокишечного тракта макромолекул белка, в отличие от того, что было установлено ранее для НЧ диоксида титана [9].

Данные, представленные в табл. 3, показывают, что у животных 4-й группы содержание Zn в бедренной кости было значительно и достоверно ниже, чем в 5-й и 6-й группах, что является объективным критерием его недостаточности [1, 10, 13]. При этом у животных 5-й и 6-й групп содержание Zn в кости практически не различалось. Определение активности ЩФ (см. табл. 3) также показало, что статус Zn, нарушенный у животных 4-й группы, эффективно и приблизительно в равной степени нормализуется у крыс 5-й и 6-й групп, получающих добавку Zn.

Как следует из данных табл. 4, общее количество эритроцитов, концентрация Hb, показатель гематокрита и средняя концентрация Hb в эритроците у животных 4-й группы была достоверно выше, чем в 5-й и 6-й группах. Напротив, средний объем эритроцита у крыс 4-й группы был достоверно ниже, чем в 5-й и 6-й группах. Наименее вариабельным из представленных в таблице показателей оказалось среднее содержание Hb в эритроците, однако в этом случае отмечена тенденция к снижению его в 4-й группы по сравнению с таковым в 5-й и 6-й группах. Различия между животными 5-ф-й и 6-й групп по всем перечисленным показателям минимальны и недостоверны.

Результаты исследования лейкоцитарной формулы (табл. 5.) показали, что в крови крыс 4-й группы повышается относительное число нейтрофилов, а также понижается число лимфоцитов по сравнению с показателями в 5-й и 6-й группах. Для общего числа лейкоцитов, относительного содержания моноцитов и эозинофилов различия не выявлены. Анализ состояния тромбоцитов (табл. 6) продемонстрировал достоверное отличие животных 4-й группы от крыс, получавших Zn, по среднему объему тромбоцитов, а у животных 6-й группы - и по общему количеству тромбоцитов. Различия по всем представленным в табл. 6 показателями между животные 5-й и 6-й групп оказались недостоверными.

Данные о состоянии апоптоза гепатоцитов, представленные в табл. 7, свидетельствуют о существенных отклонениях, наблюдаемых у животных 4-й группы (недостаточность Zn), в сравнении с крысами, получавшими добавки Zn. Так, у животных 4-й группы было достоверно уменьшено число живых клеток (AnV-FITC-/7-AAD-), повышена численность клеток, находящихся в раннем апоптозе (AnV-FITC+/7-AAD-), общее число клеток, находящихся в апоптозе (AnV-FITC+/7-AAD+), и мертвых клеток (AnV-FITC-/7-AAD+), в последнем случае - на уровне тенденции. Животные 5-й и 6-й групп, получавшие обе добавки Zn, по всем этим показателям не различались.

Изучение иммунологического статуса показало, что у крыс 4-й группы относительное содержание CD3+ Т-лимфоцитов достоверно понижено по сравнению с таковым у крыс 5-й и 6-й групп. Остальные изученные показатели изменялись недостоверно.

Таблица 1. Абсолютная и относительная масса тела крыс 4-6-й групп на 28-й день эксперимента, прирост массы тела (M±m)

Таблица 2. Относительная масса внутренних органов крыс опытных групп (M±m)

Таблица 3. Показатели, характеризующие обеспеченность цинком животных (M±m)

Таблица 4. Показатели, характеризующие состояние красной крови у крыс опытных групп (М±m)

Таблица 5. Показатели, характеризующие состояние лейкоцитов у крыс опытных групп (M±m)

Полученные в настоящем исследовании данные показывают, что НЧ ZnO позволяет восстанавливать статус Zn, нарушенный при потреблении цинкдефицитного рациона, не менее эффективно, чем традиционная форма этого микроэлемента - неорганическая соль ZnSO4, используемая, в частности, при обогащении специализированных продуктов для энтерального питания и заменителей женского молока [6]. При этом прием крысами НЧ ZnO в дозе 13 мг/кг не вызывает каких-либо неблагоприятных изменений исследованных показателей по сравнению с таковыми у животных, получавших традиционную форму этого микроэлемента, причем острая токсичность НЧ ZnO значительно меньше, чем у неорганической соли Zn. Перспективы использования НЧ ZnO в качестве пищевого источника Zn могут быть рассмотрены после проведения их токсикологической характеристики в длительном эксперименте.

Таблица 6. Показатели, характеризующие состояние тромбоцитов у крыс опытных групп (M±m)

Таблица 7. Показатели, характеризующие состояние апоптоза гепатоцитов у крыс опытных групп (M±m, %)

Литература

1. Баяржаргал М., Мазо В.К., Гмошинский И.В. и др. // Вопр. дет. диетологии. - 2007. - Т. 5, № 2. - С. 11-14.

2. Верников В.М., Арианова Е.А., Гмошинский И.В. и др. // Вопр. питания. - 2009. - Т. 78, № 2. - С. 4-17.

3. Конь И.Я., Копытько М.В., Алешко-Ожевский Ю.П. и др. // Гиг. и сан. - 2001. - № 1. - С. 54-57.

4. Мазо В.К., Гмошинский И.В., Скальный А.В. и др. // Вопр. питания. - 2002. - № 3. - С. 46-51.

5. Мазо В.К., Гмошинский И.В., Скальный А.В. и др. // Вопр. питания. - 2002. - № 3. - С. 38-43.

6. Мазо В.К., Гмошинский И.В., Ширина Л.И. Новые источники эссенциальных микроэлементов-антиоксидантов. - М.: Миклош, 2009. - 208 с.

7. Методические указания МУ 1.2.2520-09. Токсикологогигиеническая оценка безопасности наноматериалов. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009. - 36 с.

8. Микроэлементозы человека / Ред. А.П., Авцын А.А. Жаворонков, М.А. Риш, Л.С. Строчкова - М.: Медицина, 1991. - 496 с.

9. Онищенко Г.Г., Арчаков А.И., Бессонов В.В. и др. // Гиг. и сан. - 2007. - № 6. - С. 3-10.

10. Распопов Р.В., Верников В.М., Шумакова А.А. и др. // Вопр. питания. - 2010. - Т. 79, № 4. - С. 21-30.

11. Руководство по методам анализа качества и безопасности пищевых продуктов / Под ред. И.М. Скурихина, В.А. Тутельяна. - М.: Брандес-Медицина, 1998. - 340 с.

12. Скальный А.В. Распространенность микроэлементозов у детей в различных регионов в России. Вторая Российская школа "Геохимическая экология и биохимическое районирование биосферы". - М., 1999. - С. 209-211.

13. Sun H., Zhang X., Zhang Z. et al. // Environ. Pollut. - 2009. - Vol. 157, N 4. - P. 1165-1170.