The study of the association between rs2228570 polymorphism of VDR gene and vitamin D blood serum concentration in the inhabitants of the Russian Arctic

AbstractGenetic factor plays a significant role in nutrient deficiency development, including vitamins, by present time the association between several genetic polymorphisms and vitamin deficiency in the different regions of the world has been established. The aim of this study was to evaluate the possible association between VDR Fokl polymorphism and vitamin D sufficiency in the population of the Yamal-Nenets Autonomous District of the Russian Federation. The group of participants included 172 people, among them 133 women and 39 men aged 20 to 75 years old. Genomic DNA was extracted from blood and genotyped for the single nucleotide polymorphism (SNP) of Fokl T/C: (rs2228570) using allele-specific amplification, results were detected in real time using TaqMan-probes complementary DNA polymorphic sites. The concentration of 25-hydroxyvitamin D [25(OH)D] was measured by ELISA. The decreased level of 25(OH)D in blood serum (<20 ng/ml) occurred in 38.2% of the population surveyed, and 25(OH)D blood level in the alien population of the region was significantly lower than that in the indigenous population. Genetic peculiarities of the inhabitants of the Arctic zone were identified by comparison with the inhabitants of the European part of the Russian Federation. Allele C frequency of VDR rs2228570 polymorphism in the alien population was 71.1%, higher than in indigenous population (50.0%) while in the inhabitants of the European part of Russia it was 57.8%. Vitamin D blood level was statistically significantly lower in all homozygous C allele carriers than in genotype TT carriers, and vitamin D deficit frequency was 2.3 fold higher (48.4 vs. 21.1%, p<0.05). In the group of indigenous people of this region vitamin D levels in carriers of CC and CT genotype were also significantly lower than that of TT genotype carriers. The incidence of vitamin D deficiency in homozygous carriers of the allele C (45.5%) was 5.5 fold higher than among TT genotype carriers (p<0.01), and 1.6 fold higher than that in CT genotype carriers (p>0.05). Thus, the association between C allele presence of rs2228570 polymorphism of VDR gene and a deficiency of vitamin D (reduced levels of 25 (OH)D in blood serum) has been revealed.

Keywords:vitamin D, blood serum, vitamin D receptor (VDR) gene, genetic polymorphism rs2228570 (FokI), Russian Arctic, Yamal-Nenets Autonomous District

Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2017; 86 (4): 77-84. doi: 10.24411/0042-8833-2017-00062.

Внедрение геномных и постгеномных исследова­ний в практику здравоохранения показало, что значительную роль в развитии состояния дефицита пищевых веществ, в том числе витаминов, может играть генетический фактор, в частности носительство генетических полиморфизмов. Так, биологичес­кие эффекты витамина D осуществляются через вза­имодействие со специфическим рецептором, который кодируется геном рецептора витамина D, официальный символ VDR, местоположение 12q13.11. Активирован­ная витамином молекула этого рецептора взаимо­действует с активаторами и репрессорами, оказывая комплексное воздействие на процессы транскрипции генома. Белки, транскрипция которых модулирует­ся рецептором, вовлечены в процессы всасывания кальция и фосфора в кишечнике, транспорт каль­ция в костную ткань, иммуномодуляцию и другие процессы [1, 2].

В настоящее время выявлен целый ряд генетичес­ких полиморфизмов гена VDR, которые ассоциированы с уровнем в крови 25-гидроксихолекальциферола [25(OH)D], а также с различными метаболическими нарушениями. Характер и степень ассоциаций, частота встречаемости аллелей риска генетических полимор­физмов в значительной степени ассоциированы с расово-этническим происхождением обследуемых.

Полиморфизм rs2228570 расположен в экзоне 2 стар­тового кодона гена VDR, содержит 2 аллеля - C и T [3]. Изучение связи этого полиморфизма с обеспеченно­стью витамином D привело к неоднозначным резуль­татам. Так, выявлена его связь с уровнем 25(OH)D в крови в европейских популяциях (Великобритания) [4]. В клинике медицинского университета Тегерана по­казано, что этот полиморфизм связан с дефицитом витамина D у обследуемых лиц, страдающих сердечно­сосудистыми заболеваниями [5]. В то же время в группе канадских жителей не выявлено связи полиморфизма rs2228570 гена VDR c уровнем 25(OH)D в крови [6]. В ряде работ показана связь полиморфизма со сниже­нием минеральной плотности костной ткани [7]. Обследование населения азиатского происхождения выявило ассоциацию этого полиморфизма с риском развития сахарного диабета 1 типа [8].

Цель настоящей работы - изучение обеспеченности витамином D населения Ямало-Ненецкого автономного округа РФ в зависимости от полиморфизма rs2228570 (Fokl) гена VDR.

Материал и методы

Генотипирование было проведено у 172 человек, проживающих на территории Арктической зоны РФ (Ямало-Ненецкий автономный округ), среди них 133 жен­щины и 39 мужчин в возрасте от 20 до 75 лет. Корен­ное население Арктической зоны среди обследованных составило 81%.

Дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) выделяли из буккального эпителия стандартным методом, с исполь­зованием многокомпонентного лизирующего раствора, разрушающего комплекс ДНК с белком, затем ее сорби­ровали на покрытые силикагелем магнитные частицы, осуществляли отмывку спиртом и на конечном этапе элюцию в буферный раствор. ДНК выделяли с использо­ванием набора реагентов "РеалБест ДНК-экстракция 3" (ЗАО "Вектор-Бест", РФ) на автоматической станции epMotion 5075 ("Eppendorf", Германия). Генотипирование проводили с применением аллель-специфичной ампли­фикации с детекцией результатов в режиме реального времени и использованием TaqMan-зондов, комплемен­тарных полиморфным участкам ДНК, c использованием реагентов ("Синтол", Россия). Для проведения ампли­фикации использовали амплификатор "CFX96 Real Time System" ("Bio-Rad", США).

Обеспеченность витаминами оценивали по их уровню в сыворотке крови, взятой натощак из локтевой вены. Концентрацию витамина А (ретинола) определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хромато­графии [9], витамина В2 (рибофлавина) - флуориметрически с использованием рибофлавинсвязывающего апобелка [10], 25-гидроксивитамина D 25(ОН)D - иммуноферментным методом с использованием наборов "25-Hydroxy Vitamin D EIA" ("lmmunodiagnotic Systems Ltd", Великобритания).

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием системы PASW Statistics 20. Тесты на соблюдение равновесия Харди-Вайнберга и выявление ассоциаций методом Пирсона χ2 проводили с помощью программы DeFinetti на сайте Института генетики человека (Мюнхен, Германия), https://ihg.gsf.de/cgi-bin/hw/hwa2.pl.

Результаты и обсуждение

Результаты исследования полиморфизма rs2228570 гена VDR у обследуемых, проживающих в Арктической зоне РФ (Ямало-Ненецкий автономный округ), показали, что частота встречаемости аллеля С в 2 раза превы­шает частоту выявления аллеля Т, при этом генотип СС был выявлен почти у половины обследованных, СТ -чуть более чем у 1/3, а генотип ТТ - у каждого 7-го об­следованного (табл. 1). При оценке распределения ге­нотипов и частоты аллелей этого полиморфизма по гендерному признаку была выявлена более высокая частота встречаемости (на 11,3%) минорного аллеля (Т) у женщин, однако эта разница не достигала уровня статистической значимости: OR=1,72; CI (0,97-3,06) при р=0,06.

Анализ результатов генотипирования отдельно корен­ного и пришлого населения Ямало-Ненецкого автоном­ного округа выявил статистически значимые различия. Частота встречаемости минорного аллеля (Т) была на 21,1% выше у пришлого населения этого региона по сравнению с частотой у коренных жителей: OR=2,46; CI (1,44-4,18) при р=0,0007. Эти данные подтверждают вывод о зависимости частоты встречаемости поли­морфных вариантов гена VDR от этнической прина­длежности обследуемых и региона проживания.

Частота встречаемости аллеля С в группе пришлого населения (50,0%) согласуется с данными, полученными ранее у русского населения Европейской части РФ, где она составила 57,8%, в Республике Коми - 52,3%, в европейских популяциях - 52,5% [11, 12]. При обсле­довании африканского и азиатского населения выяв­лена более высокая частота встречаемости аллеля С: 83,3 и 64,6% соответственно. В отдельных странах час­тота встречаемости аллеля С полиморфизма rs2228570 гена VDR составила 68,5 (Великобритания), 66,5 (Фран­ция), 68,5 (Япония), 77,0% (Индия), что несколько пре­вышает этот показатель в Российской Федерации и европейской популяции в целом [13]. У коренного населения Ямало-Ненецкого автономного округа час­тота встречаемости аллеля С близка с аналогичному показателю в Японии и Индии и составляет 71,1% (см. табл. 1).

Результаты определения витамина D показали, что сниженный уровень 25(ОН)D в крови (<20 нг/мл) имел место у 35,2% всех обследованных жителей Ямало-Не­нецкого автономного округа. Причем уровень в крови у пришлого населения региона был статистически зна­чимо ниже, чем у коренного населения (табл. 2). Концен­трация ретинола в сыворотке крови женщин была ниже соответствующего показателя у мужчин, у коренного населения ниже, чем у пришлого.

В ходе дальнейших исследований была проведена оценка связи полиморфизма rs2228570 гена VDR с обес­печенностью витамином D у обследуемых изучаемого региона Арктической зоны РФ по типу "случай-конт­роль". Все обследованные были разделены на 2 группы: 1-я - с уровнем в сыворотке крови 25(ОН)D <20 нг/мл (дефицит витамина D - случай) и группа с содержанием 25(ОН)D≥20 нг/л (контроль). Во второй серии исследо­ваний такое же деление обследуемых было проведено в группах, состоящих только из коренных жителей и только из пришлого населения. Анализ результатовгенотипирования выявил статистически значимую связь между дефицитом витамина D и наличием аллеля С по­лиморфизма rs2228570 гена VDR у всех обследованных, а также отдельно у коренного населения (табл. 3). В то же время для пришлого населения этого региона выяв­ленная положительная ассоциация дефицита витамина D с аллелем С не достигла статистически достоверной значимости OR=1,97; CI (0,62-6,23) при р=0,24.

Определение уровня витамина D в зависимости от ге­нотипа полиморфизма rs2228570 гена VDR подтвердило ассоциацию аллеля С с дефицитом витамина D. Содержа­ние витамина D в крови всех обследованных носителей аллеля С в гомозиготном состоянии было статистически значимо ниже, чем у носителей генотипа ТТ (табл. 4), а дефицит выявлялся в 2,3 раза чаще (48,4 против 21,1%, р<0,05). На рисунке представлено распределение концентрации 25(ОН)D в сыворотке крови в зависи­мости от генотипа. Если у половины обследованных -носителей генотипа СС уровень в крови не превышал 20 нг/мл, то у носителей генотипа ТТ медиана составила 30,6 нг/мл. Носители гетерозиготного генотипа по концентрации этого витамина заняли промежуточное положение (Ме=24,2 нг/мл).

В силу недостаточного количества мужчин - носите­лей генотипа ТТ выявить зависимость уровня витамина D от генотипа не удалось, а у женщин снижение показа­теля обеспеченности холекальциферолом не достигало уровня статистической значимости (см. табл. 4). Дефи­цит витамина D у женщин - носителей генотипа СС вы­являлся в 2,0 раза чаще (42,9 против 21,1%, р<0,05).

В группе коренного населения региона у носителей ге­нотипов СС и СТ уровень витамина D был статистически значимо ниже, чем у носителей ТТ-генотипа. Частота выявления дефицита этого витамина у гомозиготных носителей аллеля С (45,5%) была в 5,5 раза выше, чем среди носителей ТТ-генотипа (р<0,01), и в 1,6 раза выше, чем у носителей генотипа СТ >0,05), что также подтверждает связь аллеля С со сниженным уровнем 25(ОН)D в крови у коренного населения. В то же время в силу небольшого количества обследованных лиц, у пришлого населения уровень витамина D у носите­лей аллеля С как в гомозиготном, так и в гетерозигот­ном состоянии статистически достоверно не отличался от показателя у носителей генотипа ТТ (см. табл. 4).

Необходимым условием осуществления витамином D своих функций является адекватная обеспеченность организма человека всеми витаминами, учас­твующими в образовании гормонально активной формы витамина D. Аскорбиновая кислота участ­вует в процессе гидроксилирования витамина D с образованием 25(ОН)D, коферментные формы ви­тамина В2 входят в состав активного центра флавопротеиновых монооксигеназ, осуществляющих гидроксилирование витамина D при его превращении в гормонально активную форму 1,25(ОН)D [14]. Этот активный метаболит витамина D взаимодействует с ядерным рецептором витамина D, который связы­вает Х-рецептор ретиноевой кислоты с образованием гетеродимерного комплекса, который присоединяется к специфическим последовательностям нуклеотидов в ДНК. После связывания к этому комплексу присо­единяются различные транскрипционные факторы, что приводит к повышению или к понижению генной активности [15].

В связи с этим у обследованных был определен уровень ретинола и рибофлавина в сыворотке крови. Ассоциации концентрации этих витаминов с носительством генотипа полиморфизма rs2228570 гена VDR не выявлено (см. табл. 4). В отличие от других регионов сниженный уровень витамина А у населения Аркти­ческой зоны обнаруживался гораздо чаще - у 19,9% против обычно выявляемого у 0-8% [15-19]. Дефицит витамина В2 выявлялся у 33,3% лиц. Примерно такая же обеспеченность витамином В2 характерна для дру­гих регионов страны [15-19].

Заключение

Результаты определения уровня 25(OH)D в сыворотке крови показали недостаточную обеспеченность этимвитамином населения Ямало-Ненецкого автономного округа. Выраженный дефицит витамина D [уровень 25(ОН)D в крови <20 нг/мл] выявлен у 38,2% обследо­ванных жителей.

Результаты генотипирования показали наличие ге­нетических особенностей у жителей этого региона РФ по сравнению с жителями Европейской части. У коренного населения этого региона частота встре­чаемости аллеля С rs2228570 гена VDR была выше, чем у пришлого населения, и составила 71,1%, в то время как в европейской части России она составляет 57,8%.

Анализ результатов генотипирования выявил статисти­чески значимую связь между аллелем С полиморфизма rs2228570 гена VDR и дефицитом витамина D. Аналогич­ная ассоциация между наличием доминантного аллеля Т и уровнем витамина D была обнаружена при обследова­нии других групп здоровых и больных лиц [20-24].

Литература

1. Arai H. A vitamin D receptor gene polymorphism in the translation initiation codon: effect on protein activity and relation to bone min­eral density in Japanese women // J. Bone Miner. Res. 1997. Vol. 12. P. 915-921.

2. Haussler M.R., Jurutka P.W. Vitamin D receptor (VDR)-mediated actions of 1alpha, 25(OH)(2)vitamin D(3): Genomic and non-genomic mechanisms // Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab. 2011. Vol. 25, N 4. P. 543-559.

3. Kilic S., Silan F., Hiz M.M., Isik S. et al. Vitamin D receptor gene BSMI, FOKI, APAI, and TAQI polymorphisms and the risk of atopic dermatitis // J. Investig. Allergol. Clin. Immunol. 2016. Vol. 26, N 2. P. 106-110. doi: 10.18176/jiaci.0020.

4. Gilbert R., Bonilla C., Metcalfe C., Lewis S. et al. Associations of vitamin D pathway genes with circulating 25-hydroxyvitamin-D, 1,25-dihydroxyvitamin-D, and prostate cancer: a nested case-con­trol study // Cancer Causes Control. 2015. Vol. 26. P. 205-218.

5. Hossein-Nezhad A., Eshaghi S.M., Maghbooli Z., Mirzaei K. et al. The role of vitamin D deficiency and vitamin D receptor geno­types on the degree of collateralization in patients with sus­pected coronary artery disease // Biomed. Res. Int. 2014. Article ID 304250.

6. Larcombe L., Mookherjee N., Slater J., Slivinski C. et al. Vitamin D, serum 25(OH)D, LL-37 and polymorphisms in a Canadian First Nation population with endemic tuberculosis // Int. J. Circumpolar Health. 2015. Vol.74. Article ID 28952.

7. Jakubowska-Pietkiewicz E., Mlynarski W., Klich I., Fendler W. et al. Vitamin D receptor gene variability as a factor influencing bone mineral density in pediatric patients // Mol. Biol. Rep. 2012. Vol. 39, N 5. P. 6243-6250.

8. Wang G., Zhang Q., Xu N., Xu K. et al. Associations between Two Polymorphisms (FokI and BsmI) of Vitamin D Receptor Gene and Type 1 Diabetes Mellitus in Asian Population: A Meta-Analysis //PLoS One. 2014. Vol. 9, N 3. Article ID e89325. doi: 10.1371/journal. pone.0089325.

9. Якушина Л.М., Бекетова Н.А., Бендер Е.Д., Харитончик Л.А. Использование методов ВЭЖХ для определения витаминов в биологических жидкостях и пищевых продуктах // Вопр. питания. 1993. № 1. С. 43-48.

10. Вржесинская О.А., Коденцова В.М., Рисник В.В., Спиричев В.Б. Сравнение флуоресцентных методов определения витамина В2 в крови // Вопр. питания. 1991. 4. С. 67-72.

11. Lins Т.С., Vieira R.G., Grattapaglia D., Pereira R.W. Population analysis of vitamin D receptor polymorphisms and the role of genetic ancestry in an admixed population // Genet. Mol. Biol. 2011 .Vol. 34, N 3. P. 377-385.

12. Козлов А.И., Вершубская Г.Г., Негашева М.А. Полиморфизм гена ре­цептора витамина D (VDR) в выборках населения Европейской Рос­сии и Приуралья // Перм. мед. журн. 2016. Т. XXXIII, 5. P. 60-66.

13. Osman E., Anouti A.A., El Ghazali G., Haq A. et al. Frequency of rs731236 (Taql), rs2228570 (Fok1) of Vitamin-D Receptor (VDR) gene in Emirati healthy population // Meta Gene. 2015. Vol. 6. P. 49-52.

14. Спиричев В.Б., Громова О.А. Витамин D и его синергисты // Земский врач. 2012. 2. С. 33-38.

15. Hossein-Nezhad A., Spira A., Holick M.F. Influence of vitamin D status and vitamin D3 supplementation on genome wide expression of white blood cells: a randomized double-blind clinical trial // PLoS One. 2013. Vol. 8, N 3. Article ID e58725.

16. Горбачев Д.О., Бекетова Н.А., Коденцова В.М., Кошелева О.В. и др. Оценка витаминного статуса работников Самарской ТЭЦ по данным о поступлении витаминов с пищей и их уровню в крови // Вопр. питания. 2016. Т. 85, 3. C. 71-81.

17. Бекетова Н.А., Погожева А.В., Коденцова В.М., Вржесинская О.А. и др. Витаминный статус жителей Московского региона // Вопр. питания. 2016. Т. 85, № 4. С. 61-67.

18. Бекетова Н.А., Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Кошелева О.В. и др. Оценка витаминного статуса студентов московского вуза по данным о поступлении витаминов с пищей и их уровню в крови // Вопр. питания. 2015. Т. 84, № 5. С. 64-75.

19. Бекетова Н.А., Морозова П.Н., Кошелева О.В., Вржесинская О.А. и др. Обеспеченность витаминами и характер питания работников металлургического производства (г. Нижний Новгород) // Вопр. питания. 2016. Т. 85, 2. Прил. С. 84-85.

20. Karpinski M., Galicka A., Milewski R., Popko J. et al. Association between vitamin D receptor polymorphism and serum vitamin D levels in children with low-energy fractures // J. Am. Coll. Nutr. 2017. Vol. 36, N 1. P. 64-71. doi: 10.1080/07315724.2016.1218803.

21. Elhoseiny S.M., Morgan D.S., Rabie A.M., Bishay S.T. Vitamin D receptor (VDR) gene polymorphisms (FokI, BsmI) and their relation to vitamin D status in pediatrics beta thalassemia major // Indian J. Hematol. Blood Transfus. 2016. Vol. 32, N 2. P. 228-238. doi: 10.1007/s12288-015-0552-z.

22. Coskun S., Simsek S., Camkurt M.A., Cim A. et al. Association of polymorphisms in the vitamin D receptor gene and serum 25-hydroxyvitamin D levels in children with autism spectrum dis­order // Gene. 2016. Vol. 588, N 2. P. 109-114. doi: 10.1016/j.gene. 2016.05.004.

23. Zheng S.Z., Zhang D.G., Wu H., Jiang L.J. et al. The asso­ciation between vitamin D receptor polymorphisms and serum 25-hydroxyvitamin D levels with ulcerative colitis in Chinese Han population // Clin. Res. Hepatol. Gastroenterol. 2017. Vol. 41, N 1. P. 110-117. doi: 10.1016/j.clinre.2016.09.001.

24. Rasheed H., Hegazy R.A., Gawdat H.I., Mehaney D.A. et al. Serum vitamin D and vitamin D receptor gene polymorphism in myco­sis fungoides patients: a case control study // PLoS One. 2016. Vol. 11, N 6. Article ID e0158014. doi: 10.1371/journal.pone. 0158014.