Subacute oral toxicity in vivo of multi-walled carbon nanotubes

Abstract

Multiwall carbon nanotubes (MWCNTs) are regarded as environmental pollutants with increased risk. Recently MWCNTs have attracted attention as a promising component of packaging materials for food products, as carriers for agricultural plant growth stimu­lants, agrochemicals components and advanced pesticides, which creates the possibility of their exposure through the gastrointestinal tract. Objective of the research is assess­ment of sub-acute oral toxicity to rats of MWCNTs in an experiment lasting 100 days. MWCNTs preparation «Taunit-M®» was preliminary characterized by electron micros­copy and Raman light scattering. Nanomaterial was administered to animals as sonicated dispersion in water with 1% by weight of nonionic surfactant Tween 20. The experiment was performed on 80 growing male Wistar rats with initial body weight (b.w.) 86±2 g. Rats of experimental groups (from 2nd to 5th) received MWCNTs dispersion instead of drinking water, the animals of the 1st control group - a carrier solution (Tween 20). Doses of MWCNTs consumed were, respectively, in groups 1-5: 0; 0.01; 0.1; 1.0 and 10 mg/kg b.w. Hematological and biochemical indices of blood were determined together with the activity of glutathione peroxidase of erythrocytes, the content of non-protein thiols in the liver, excretion of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine (8-oxo-G) and content of the main and transient components of gastrointestinal microbiocenosis in the cecum contents. Apoptosis of hepatocytes was studied by flow cytometry. As a result MWCNTs led to increase of blood glucose and creatinine in rats in group 2, a significant decrease in the number of neutrophils and monocytes by increasing the number of lymphocytes, decreased platelet volume, the most pronounced also in group 2, receiving the lowest dose of MWCNTs. There were no signs of oxidative DNA damage identified. At the lowest dose MWCNTs caused a significant decrease in the number of bifidobacteria, increase -citrate-assimilating Enterobacteriaceae, hemolytic aerobic microorganisms and yeast. These changes in the microbiota should be considered as adverse, apparently leading to disturbances in the immune function.

Keywords:MWCNTs, rats, oral toxicity, intestinal microbiocenosis

Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2017; 86 (4): 61-9. doi: 61-69.10.24411/0042-8833-2017-00060.

Углеродные нанотрубки (УНТ) рассматриваются в настоящее время как загрязнители окружающей среды, обладающие повышенной опасностью. Боль­шинство сценариев экспозиции человека УНТ прини­мают во внимание их ингаляционный путь поступления в условиях производства как самого наноматериала, так и содержащих его композитов, а также использования в быту содержащей УНТ продукции [1]. В последнее время УНТ привлекают к себе внимание как компоненты инновационных упаковочных материалов для пищевой продукции [2], а также в качестве носителей для сти­муляторов роста сельскохозяйственных растений [3], компонентов агрохимикатов [4, 5] и перспективных пес­тицидов [6]. Повышенная вероятность поступления УНТ в организм человека через желудочно-кишечный тракт, в том числе в малых и сверхмалых дозах, обусловливает определенные риски, связанные с токсичностью УНТ для человека и млекопитающих. Токсикологичес­кие эффекты при пероральном введении УНТ изучены недостаточно, а имеющиеся данные о действующих дозах противоречивы. Это может быть связано как с методическими трудностями при введении данного нерастворимого в воде наноматериала эксперименталь­ным животным, так и с проблемами при определении его действующих доз в условиях сильной агрегации в биологическом окружении.

В нашем предыдущем исследовании был разработан и апробирован метод получения стабильных дисперсий многостенных УНТ для проведения длительных подострых и (в перспективе) хронических исследований токсичности путем введения лабораторным животным с питьевой жидкостью в растворе неионогенного поверх- ностно-активного вещества (ПАВ) Tween 20 (пищевая до­бавка Е433) [7]. Цель настоящей работы - токсиколого-гигиеническая оценка перорально вводимых много­стенных УНТ в подостром эксперименте на крысах длительностью 100 сут с использованием комплекса показателей, включающих гематологию, апоптоз клеток печени, биохимические маркеры токсического действия, окислительного повреждения дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и состояния микробиоты толстой кишки.

Материал и методы

Исследуемый наноматериал

В качестве объекта исследования использовали аттестованный стандартизованный препарат много­стенных УНТ, выпускаемый в промышленных масшта­бах, "Таунит-М®" (ООО "Нанотехцентр", Тамбов, РФ). По данным изготовителя, многостенные УНТ имели наружный диаметр 15-40 нм, диаметр внутренней по­лости - 3-8 нм, среднюю длину - более 2 мкм, со­держание примесей, включая аморфный углерод, -менее 1,5%. Для приготовления стоковой дисперсии многостенные УНТ диспергировали в питьевой высокоочищенной воде из установки "Milli-RO" ("Waters", США) в присутствии 1% (по массе) неионогенного ПАВ Tween 20 ("Panreac", Испания) с обработкой ультразву­ком. Максимальная концентрация многостенных УНТ в стоковом растворе составляла 0,1 мг/см3. Методика диспергирования представлена в [7].

По данным динамического рассеяния света, комби­национного лазерного светорассеяния и трансмиссион­ной электронной микроскопии. препарат в полученной водной дисперсии был изначально представлен сво­бодными многостенными УНТ диаметром около 20 нм, длиной более 1000 нм и их некрупными агрегатами [7].

Дизайн эксперимента на животных

Эксперимент проведен на 80 крысах-самцах линии Вистар исходной массой тела 86±2 г (M±m), полученных из питомника филиала "Столбовая" ФГБУН "Научный центр биомедицинских технологий" ФМБА России. Ра­боту на животных выполняли в соответствии с правилами надлежащей лабораторной практики [8, 9]. На протяже­нии эксперимента животные получали сухой сбалан­сированный корм (ООО "Лабораторкорм", РФ) и воду в режиме неограниченного доступа. Крыс размещали по 2 особи в клетках из поликарбоната при 12/12-часовом режиме освещенности и температуре 21±1 °С. В начале эксперимента все животные были разделены методом случайной выборки на 5 групп по 16 крыс; средняя масса тела животных в группах не различалась (р>0,1 ANOVA). Дисперсии многостенных УНТ животным вводили с водой. Для получения в ней необходимой концен­трации многостенных УНТ исходный стоковый рас­твор разбавляли 1% раствором используемого ПАВ. Дозы многостенных УНТ рассчитывали индивидуально для животных каждой клетки, исходя из фактического объема ежедневного потребления жидкости, мас­совой концентрации многостенных УНТ в суспензии и суммарной массы тела крыс в клетке на день расчета. Фактические дозы потребляемых многостенных УНТ, которые определяли исходя из концентрации в диспер­сии и объемов выпитой животными жидкости, незна­чительно отличались от расчетных и составляли для 1-5-й групп соответственно 0 (контроль); 0,01; 0,1; 1,0 и 10 мг на 1 кг массы тела.

Общая длительность эксперимента составила 100 сут. В ходе наблюдения крыс 2 раза в неделю взвешивали и ежедневно оценивали общее состояние животных. На 94-95-е сутки проводили сбор суточной мочи в ин­дивидуальных обменных клетках. Выведение животных из эксперимента осуществляли на 101-е сутки после 16-часового голодания. Часть животных (по 10 из группы) выводили из эксперимента путем обескровливания из нижней полой вены под глубокой эфирной анестезией. На секции отбирали кровь для определения гемато­логических показателей и часть печени для изучения показателей апоптоза. Содержимое слепой кишки отби­рали в асептических условиях в стерильные контейнеры для микробиологического исследования. Для изучения биохимических показателей у остальных животных из каждой группы (по 6 крыс) отбирали кровь на сыворотку после декапитации под легкой эфирной анестезией.

Аналитические методы

Гематологические показатели определяли стандарт­ными методами на гематологическом анализаторе "Coulter AC TTM 5 diff OV" ("Beckman Coulter", США) с на­бором реагентов ("Beckman Coulter", Франция). Апоптоз клеток печени изучали на проточном цитофлуориметре "FC 500" ("Beckman Coulter International S.A.", Австрия) с использованием технологии окрашивания гепатоцитов в суспензии флуоресцентными реагентами FITC-аннек-сином V и 7-аминоактиномицином (7-AAD) [10].

Биохимические показатели сыворотки определяли на биохимическом анализаторе ("Konelab 20i", Финляндия); активность глутатионпероксидазы - спектрофотометрическим методом, согласно [11], с незначительными модификациями; содержание небелковых тиолов в пе­чени - спектрофотометрическим методом с реакти­вом Эллмана. Степень окислительного повреждения ДНК оценивали по экскреции с мочой 8-гидрокси-2'-дезоксигуанозина (8-oxo-G) [12], который определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматогра­фии [колонка Supersphere 100 RP18 (125x2 мм, 4 мкм) с предколонкой Supersphere 100 RP18 (10x2 мм), "Merck", Германия]. В качестве детектора использовали трех­уровневый квадрупольный масс-спектрометр API 3000 ("PE Biosystems", Германия). В анализируемых фрак­циях элюата отслеживали ион с M/Z=168 м/з, образуе­мый распадом иона-предшественника c M/Z=284. Время удерживания пика 8-oxo-G составило 7,2 мин.

Для оценки состояния микробиоты слепой кишки де­лали ряд десятикратных разведений проб кишечного содержимого в фосфатно-тиогликолевом буфере и количественно засевали на дифференциально-диагнос­тические и селективные среды. Общее содержание аэробных микроорганизмов и содержание гемолити­ческих микроорганизмов определяли на Колумбийском агаре с содержанием крови 5%; общее содержание анаэробных микроорганизмов - на Колумбийском агаре с содержанием крови 8%; содержание бифидобактерий -на среде ГМК; лактобацилл - на MRS-агаре; бакте­рий семейства Enterobacteriaceae - на среде Эндо и цитратном агаре, бактерий рода Staphylococcus - на агаре Байрд-Паркера; Enterococcus spp. - азидном агаре с канамицином и эскулином; Bacteroides spp. - на желчно-эскулиновом агаре для бактероидов; дрожжей и плесне­вых грибов - на агаре Сабуро. Инкубирование анаэроб­ных микроорганизмов, бифидобактерий и лактобацилл осуществляли в анаэробных условиях с использованием газогенерирующих пакетов для химического связывания кислорода "AnaeroGen" (Oxoid). Содержание микроорга­низмов выражали в lg КОЕ/г сырой массы фекалий. Оценку антагонистической (кислотообразующей) активности по­пуляций бифидобактерий проводили путем определе­ния рН культуральной жидкости (тиогликолевой среды) на 5-е сутки инкубации с помощью рН-метра. Критериями служили пределы рН: менее 4,5 - антагонистически актив­ные бифидобактерии; 4,6-5,1 - слабый антагонизм, более 5,1 - отсутствие антагонистической активности. Приме­нявшиеся методики соответствовали [13].

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета SPSS 18.0. Расчет включал определе­ние выборочного среднего (М), стандартной ошибки (m), вероятности принятия нуль-гипотезы о совпадении рас­пределений сравниваемых выборок согласно критерию Стьюдента, Манна-Уитни, ANOVA и Краскела-Уоллиса. Различия признавали достоверными при уровне значи­мости р<0,05.

Результаты

При определении показателей апоптоза печени у животных 1-й, контрольной, группы выявлено, что ко­личество живых клеток составляло 93,5±0,4%, клеток в "раннем" апоптозе (AnV-FITC+ 7-AAD-) - 5,37±0,48%, в "позднем" апоптозе (AnV-FITC+ 7-AAD+) - 0,65±0,16% и мертвых клеток (AnV-FITC- 7-AAD+) - 0,52±0,25%, что соответствует данным для контрольных здоровых жи­вотных и свидетельствует об отсутствии токсического действия применявшегося ПАВ на печень. У крыс всех 4 опытных групп указанные показатели достоверно не отличались от контрольных значений. Величина пула восстановленных тиоловых соединений (глутатиона) в печени животных 1-й группы составила 44,8± 4,1 мкмоль, что практически не отличалось от дан­ного показателя в группах с 3-й по 5-ю. Во 2-й группе (при наименьшей дозе многостенных УНТ) содержание тиолов было незначительно и статистически недосто­верно (р>0,05) повышено (54,4±7,1 мкмоль) по сравнению с контрольным значением. Эти результаты, в сочетании с данными определения активности аминотрансфераз (табл. 1), показывают, что многостенные УНТ в данном интервале доз не оказывают видимого токсического действия на печень.

Представленные в табл. 1 биохимические показатели сыворотки крови животных контрольной, 1-й группы на­ходятся в пределах нормы для самцов крыс данного воз­раста [14], за исключением сниженного уровня глюкозы, естественным образом связанного с 16-часовым голо­данием животных перед выведением из эксперимента. Как следует из данных табл. 1, отличие показателей животных групп со 2-й по 5-ю от контроля статистически недостоверно, за исключением значимо повышенного уровня глюкозы у крыс 2-й группы, получавших наименьшую дозу многостенных УНТ (0,01 мг на 1 кг массы тела). В этой же группе выявлено достоверное, хотя и не выходящее за пределы нормы для животных дан­ного пола и возраста (50-80 мкмоль/л), повышение содержания креатинина, что ранее также отмечалось авторами [15] в условиях 6-месячного перорального вве­дения крысам многостенных УНТ в очень низких дозах (менее 0,1 мг на 1 кг массы тела).

Определение состояния системы эритроцитов и уровня гемоглобина крови у крыс опытных групп показало отсутствие каких-либо значимых отличий от контрольных значений (данные не приведены). Однако при оценке лейкоцитарной формулы крови и тромбо­цитов был выявлен ряд сдвигов, обусловленных при­емом многостенных УНТ (табл. 2). Так, у крыс 3-й и 4-й групп в крови отмечалось достоверное снижение числа нейтрофилов и моноцитов за счет повышения количества лимфоцитов. Наименьшее количество мо­ноцитов (снижение более чем в 2 раза) обнаружено у животных 2-й группы, получавших наименьшую дозу многостенных УНТ. Зависимость количества лимфо­цитов от дозы многостенных УНТ в интервале от 0,1 до 1 мг на 1 кг массы тела отсутствовала. Средний объем тромбоцита был достоверно снижен по сравнению с контролем у крыс 2-й и 4-й групп, причем в наиболь­шей степени при самой низкой дозе наноматериала.

Определение величины экскреции 8-oxo-G, являюще­гося маркером окислительной деструкции ДНК, показало (табл. 3), что этот показатель монотонно снижается с увеличением дозы многостенных УНТ и составляет в 5-й группе (при дозе 10 мг на 1 кг массы тела) только 36% от контрольного уровня. Таким образом, свиде­тельств усиления окислительного повреждения генети­ческого аппарата клетки под действием многостенных УНТ получено не было.

Данные табл. 4 свидетельствуют о влиянии много­стенных УНТ на ряд представителей микробиоты толс­той кишки. Так, при наименьшей дозе наноматериала (0,01 мг/кг) отмечено достоверное снижение (более чем в 15 раз) количества бифидобактерий, повышение в 3,9 раза количества цитратассимилирующих энтеробактерий на фоне снижения содержания общих энтеробактерий. При следующей по величине дозе 0,1 мг на 1 кг массы тела достоверно возрастало (в 1,7 раза) количество гемолитических аэробных микроорганизмов и более чем в 250 раз - количество дрожжей. Указан­ные изменения в микробиоте следует рассматривать как неблагоприятные, свидетельствующие о возможном развитии дисбиотических изменений. Они, в свою оче­редь, могут привести к сдвигам в иммунной функции, что находит отражение в выявленных изменениях лей­коцитарной формулы, однако для подтверждения этого предположения необходимо исследование с примене­нием более специфических иммунологических методов. Характерно, что нежелательные сдвиги в микробиоте отмечались только при низких дозах многостенных УНТ, тогда как при наибольших (1 и 10 мг на 1 кг массы тела) подобного не наблюдалось, и, напротив, при наиболь­шей дозе 10 мг на 1 кг массы тела отмечено достоверное торможение (порядка 10 раз по медиане) развития неже­лательной плесневой микрофлоры.

Обсуждение

Имеющиеся в доступной литературе данные о пероральной токсичности различных многостенных УНТ частично противоречивы, получены на различных экс­периментальных моделях и в разных (часто неперекры­вающихся) интервалах доз.

Так, в эксперименте на беременных крысах с 6-19 днями гестации [16] пероральная эмбриотоксичность многостенных УНТ диаметром 10-15 нм и длиной 20 мкм не выявлялась при дозах вплоть до 1000 мг на 1 кг массы тела. Оцененная величина максимальной недействующей дозы (NOAEL) по изменениям в массе внутренних органов самок составила 200 мг на 1 кг массы тела в сутки. В отличие от этого, согласно [17], гидроксилированные УНТ уже при однократном пероральном введении беременным мышам в дозе 10 мг на 1 кг массы тела вызывали резорбцию плодов и их скелетные аномалии. Характерно, что при более вы­сокой дозе (100 мг на 1 кг массы тела) эти эффекты не проявлялись, что авторы связывают с усилением агрегации УНТ. Одностенные УНТ диаметром 0,9-1,7 нм и длиной менее 1 мкм, вводимые однократно в желу­док крыс в дозах 0,064 или 0,64 мг на 1 кг массы тела, вызывали увеличение продукции 8-oxo-G в печени [18]. В отличие от этого, многостенные УНТ в дозах до 50 мг на 1 кг массы тела при однократном пероральном вве­дении не приводили к повышению уровня аддуктов ДНК в моче крыс [19]. При пероральном введении мышам в остром опыте одностенных УНТ длиной более 1 мкм в очень высокой дозе (1000 мг на 1 кг массы тела) никаких признаков токсичности не выявлено. Можно предположить, что при таких высоких дозах УНТ, как и в случае нашего исследования, начинают преобладать процессы образования в кишечнике крупных неабсорбируемых волокноподобных агрегатов наноматериала, выводимых с калом [20].

Наиболее близки по методологии к настоящей работе исследования, в которых многостенные УНТ вводили животным с питьевой жидкостью. Потребление мы­шами водной дисперсии многостенных УНТ "Таунит-М®" в дозах 0,3; 3 и 30 мг на 1 кг массы тела на протяжении 30 сут не вызывало каких-либо изменений в скорости роста животных и морфологии внутренних органов [21]. Однако при дозе 30 мг/кг (большей, чем максимальная доза в нашей работе) были выявлены воспалительные инфильтраты в печени. По данным недавнего исследо­вания [22], многостенные УНТ "Таунит-М®", вводимые мышам перорально в дозе 30 мг на 1 кг массы тела в течение 30 сут, вызывали очаги локального некроза в слизистой оболочке тонкой кишки с частичным лизи­сом энтероцитов и разрушением их апикальных мем­бран. В цитоплазме отдельных энтероцитов были вы­явлены электронноплотные структуры, напоминающие короткие обломки многостенных УНТ, однако их полная идентификация была невозможна. По данным [15], многостенные УНТ, вводимые с питьевой водой в те­чение 6 мес в очень низких дозах (менее 0,1 мг на 1 кг массы тела), вызывали ряд сдвигов в биохимических показателях крыс, включая повышение уровня креатинина, активности щелочной фосфатазы и аланин-аминотрансферазы, снижение уровня липопротеинов высокой плотности, наличие признаков окислительного стресса в эритроцитах. Количественно сопоставление этих данных с результатами нашего эксперимента, од­нако, затруднено, ввиду того что в этой работе изна­чально использовали животных с массой тела 300 г, имеющих оценочно исходный возраст более 2,5 мес, а в конце эксперимента - более 8 мес.

Таким образом, проведенный эксперимент показал, что вводимые крысам в течение 100 дней с водой многостенные УНТ "Таунит-М®" способны вызывать ряд неблагоприятных эффектов, включая изменения в уровнях гликемии и креатинина, в лейкоцитарной формуле, состоянии кишечной микробиоты. В основ­ном все указанные изменения наблюдались при низких дозах наноматериала (от 0,01 до 0,1 мг на 1 кг массы тела), а при наибольшей дозе отсутствовали, что со­гласуется с данными литературы. Так, имеются данные об изменении стабильности микробиоты под воздейст­вием наночастиц в низких дозах, соответствующих их остаточным концентрациям в окружающей среде (0,01 мкг/дм3 ZnO, 0,01 мкг/дм3 CeO2 и 3 мг/дм3 TiO2) в эксперименте in vitro с использованием модели изо­лированного кишечника [23]. Введение этих наночастиц приводило к нелетальным, но значительным изменениям фенотипических свойств микробного сообщества, кото­рые могут быть соотнесены с общими последствиями для здоровья.

Системные биологические эффекты УНТ могут быть связаны как с их действием на микрофлору толстой кишки, так и с проникновением через стенку кишки во внутреннюю среду организма, - принципиальная возможность этого была показана в модельных сис­темах in vitro [24] и in vivo [22]. Примечательно, что кишечное всасывание многостенных УНТ считается наиболее вероятным именно при их наименьших дозах в условиях минимальной агрегации [25]. Однако следует иметь в виду, что системное действие многостенных УНТ, развивающееся по механизму незавершенного фагоцитоза, обязательно сопровождается признаками окислительного стресса, что противоречит данным нашего исследования (пул тиолов печени, экскреция 8-oxo-G).

Особый интерес представляет выявленный в настоя­щей работе эффект более чем 2,5-кратного снижения экскреции 8-oxo-G у крыс, получавших "Таунит-М®" в наибольшей дозе 10 мг на 1 кг массы тела. Подобное действие в отношении генетического аппарата клетки нельзя объяснить действием многостенных УНТ самих по себе, а следует, предположительно, связать с ад­сорбирующим действием избытка многостенных УНТ в отношении неустановленных генотоксических контаминантов, которые в неопределяемых аналитическими методами количествах могут присутствовать в объектах окружающей среды (корма, питьевая вода, опилки). В пользу этого предположения свидетельствуют данные о способности различных УНТ связывать гидрофобные токсиканты, такие как фенантрен [26, 27].

Таким образом, исследованный образец многостен­ных УНТ при поступлении в организм с водой в условиях 100-дневного эксперимента оказывает неоднозначное воздействие на комплекс биохимических, гематологи­ческих и микробиологических показателей, что следует учитывать при установлении пороговой токсической дозы этого наноматериала с привлечением более широ­кого круга информативных биомаркеров.

Литература

1. Фатхутдинова Л.М., Халиуллин Т.О., Шведова А.А. Оценка риска здоровью при воздействии углеродных нанотрубок: от токсико­логии к эпидемиологическим исследованиям (обзор современ­ного состояния проблемы) // Рос. нанотехнологии. 2015. Т. 10, 5-6. С. 144-150.

2. Kavoosi G., Dadfar S.M., Dadfar S.M., Ahmadi F. et al. Investi­gation of gelatin/multi-walled carbon nanotube nanocomposite films as packaging materials // Food Sci. Nutr. 2014. Vol. 2, N 1. P. 65-73.

3. Смирнова Е.А., Гусев А.А., Зайцева О.Н., Лазарева Е.М. и др. Углеродные нанотрубки проникают в ткани и клетки и оказы­вают стимулирующее воздействие на проростки эспарцета Onobrychis Arenaria (Kit.) // Acta Naturae (русскоязычная версия). 2011. Т. 3, 1. С. 106-113.

4. Mukherjee A., Majumdar S., Servin A.D., Pagano L. et al. Carbon nanomaterials in agriculture: a critical review // Front. Plant Sci. 2016. Vol. 7. P. 172.

5. Sekhon B.S. Nanotechnology in agri-food production: an overview // Nanotechnol. Sci. Appl. 2014. Vol. 7. P. 31-53.

6. Васюкова И.А., Грибановский С.Л., Гусев А.А., Убогов А.Ю. и др. Оценка репродуктивной токсичности и возможных популяционно-экологических эффектов многостенных УНТ на мыше­видных грызунах // Рос. нанотехнологии. 2015. Т. 10, 5-6. С. 109-116.

7. Гмошинский И.В., Шипелин В.А., Хотимченко С.А. Токсиколого-гигиеническая оценка в эксперименте многостенных углеродных нанотрубок // Сб. тезисов VIII Ежегодной конфе­ренции нанотехнологического общества России. М., 2017. С. 160-162.

8. Приказ Минздравсоцразвития России от 23.08.2010 № 708н "Об утверждении Правил лабораторной практики".

9. Guide for the care and use of laboratory animals. 8th ed. Commit­tee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals; Institute for Laboratory Animal Research (ILAR); Division on Earth and Life Studies (DELS); National Research Council of the national academies. Washington : The National Academies Press, 2011.

10. Распопов Р.В., Трушина Э.Н., Гмошинский И.В., Хотимченко С.А. Биодоступность наночастиц оксида железа при использовании их в питании. Результаты экспериментов на крысах // Вопр. питания. 2011. Т. 80, 3. С. 25-30.

11. Разыграев А.В. Метод определения глутатионпероксидазной активности с использованием пероксида водорода и 5,5'-дити-обис(2-нитробензойной кислоты)// Клинико-лабораторный кон­силиум. 2004. 4. С. 19-22.

12. De Martinis B.S., Bianchi M.L.P. Methodology for urinary 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine analysis by HPLC with electrochemical detec­tion // Pharmacol. Res. 2002. Vol. 46, N 2. P. 129-131.

13. МУ 1.2.2634-10 "Микробиологическая и молекулярно генети­ческая оценка воздействия наноматериалов на представителей микробиоценоза".

14. Zhang Z.P., Tian Y.H., Li R., Cheng X.Q. et al. The comparison of the normal blood biochemical values of Wistar rats with different age and sex // Asian J. Drug Metab. Pharmacokinet. 2004. Vol. 4. P. 215-218.

15. Хрипач Л.В., Рахманин Ю.А., Михайлова Р.И., Князева Т.Д. и др. Влияние углеродных нанотрубок и активированного угля на биохимические показатели состояния организма при хроничес­ком введении препаратов крысам с питьевой водой // Гиг. и сан. 2014. № 5. С. 36-42.

16. Lim J.H., Kim S.H., Lee I.C., Moon C., Kim S.H., Shin D.H., et al. Evaluation of maternal toxicity in rats exposed to multi-wall carbon nanotubes during pregnancy // Environ. Health Toxicol. 2011. Vol. 26. Article ID e2011006.

17. Philbrook N.A., Walker V.K., Afrooz A.R., Saleh N.B., Winn L.M. Investigating the effects of functionalized carbon nanotubes on reproduction and development in Drosophila melanogaster and CD-1 mice // Reprod. Toxicol. 2011. Vol. 32, N 4. P. 442-448.

18. Folkmann J.K., Risom L., Jacobsen N.R., Wallin H. et al. Oxidatively damaged DNA in rats exposed by oral gavage to C60 fullerenes and single-walled carbon nanotubes // Environ. Health Perspect. 2009. Vol. 117, N 5. P. 703-708.

19. Szendi K., Varga C. Lack of genotoxicity of carbon nanotubes in a pilot study // Anticancer Res. 2008. Vol. 28, N 1A. P. 349-352.

20. Kolosnjaj-Tabi J., Hartman K.B., Boudjemaa S., Ananta J.S. et al. In vivo behavior of large doses of ultrashort and full-length single-walled carbon nanotubes after oral and intraperitoneal admin­istration to Swiss mice // ACS Nano. 2010. Vol. 4, N 3. P. 1481­1492.

21. Васюкова И.А., Гусев А.А., Халиуллин Т.О., Фатхутдинова Л.М. и др. Многостенные углеродные нанотрубки и их влияние на показатели мужской репродуктивной системы // Нанотехнологии и охрана здоровья. 2014. 6 (18). С. 10-15.

22. Масютин А.Г., Ерохина М.В., Сычевская К.А., Гусев А.А. и др. Мно­гостенные углеродные нанотрубки индуцируют патологические изменения в органах пищеварительной системы мышей // Бюл. экспер. биол. 2016. Т. 161, № 1. С. 143-148.

23. Taylor A. A. et al. Metal oxide nanoparticles induce minimal phenotypic changes in a model colon gut microbiota // Environ. Eng. Sci. 2015. Vol. 32, N 7. P. 602-612.

24. Coyuco J.C., Liu Y., Tan B.-J., Chiu G.N.C. Functionalized car­bon nanomaterials: exploring the interactions with Caco-2 cells for potential oral drug delivery // Int. J. Nanomed. 2011. Vol. 6. P. 2253-2263.

25. Bergin I.L. Witzmann F.A. Nanoparticle toxicity by the gastrointesti­nal route: evidence and knowledge gaps // Int. J. Biomed. Nanosci. Nanotechnol. 2013. Vol. 3. P. 1.

26. Cui X.Y., Jia F., Chen Y.X., Gan J. Influence of single-walled carbon nanotubes on microbial availability of phenanthrene in sediment // Ecotoxicology. 2011. Vol. 20, N 6. P. 1277-1285.

27. Ferguson P.L., Chandler G.T., Templeton R.C., Demarco A. et al. Influence of sediment-amendment with single-walled carbon nanotubes and diesel shoot on bioac-cumulation of hydrophobic organic contaminats by bentic invertebrates // Environ. Sci. Technol. 2008. Vol. 42, N 10. P. 3879.