Modeling of the in vitro melanoid formation reaction on the interaction of protein hydrolysate of chicken egg and glucose

Abstract

Food production technologies, including heat treatment, are often accompanied by a change in their organoleptic characteristics (color, taste and aroma) due to the forma­tion of colored substances as a result of the melanoidin reaction. The authors simulated the reaction of melanoidin formation in vitro using the example of the interaction of the hydrolyzate of a chicken egg protein and glucose to determine the content of amino acids depending on the conditions for carrying out this reaction. The egg protein (0.2 g) was subjected to acid hydrolysis for 24 hours at 80 °C. Then the hydrolyzate was neutral­ized (vend=100 см3) and the initial amino acid content was determined therein. In each sample (30 см3), 4.5 g of glucose was added to the hydrolyzate to obtain a 15% solution of glucose in the hydrolyzate. The effect of temperature (50, 70 and 90 °C), time (10, 30 and 50 min), pH (pH 2, 7 and 12) on the amino acid content in the hydrolyzate as a result of the melanoidin reaction has been studied. The determination of the amount of amino acids was carried out using high performance liquid chromatography with precolumnar derivatization using o-phthalaldehyde. As a result of the studies on modeling the melanoidin reaction, the following regularities were revealed: when the temperature of the Mayyar reaction increased, the concentrations of GLU, SER, HIS, THR, ARG, ALA, CYS, VAL, MET, LEU, and LYS decreased. At the same time, with an increase in the duration of the reaction, an increase in the concentration of SER, THR, VAL, MET, ILE, LEU was observed. Variations in the concentration of amino acids in the reaction medium with increasing temperature were characteristic for ASP, GLY, TYR, PHE, ILE, and with increasing the reaction time for ASP, GLU, HIS, GLY, ARG, ALA, TYR, CYS, PHE, LYS. Other things being equal, the process of melanoid formation most fully pro­ceeded in an alkaline medium at pH 12. Thus, the study of the effect of the experimental conditions showed that during the melanoidin formation, the content of certain amino acids (including essential amino acids) decreases and, consequently, the nutritional value of the product decreases. As a result of this reaction, from 20 to 50% of free amino acids are lost, and with increasing temperature and increasing the duration of heating, these losses increase. The obtained data are important to take into account when developing new food technologies with the maximum preservation of their chemical composition, nutritional value and consumer properties.

Keywords:protein, amino acids, reducing sugars, Maillard reaction, melanoidin formation

Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2017; 86 (3): 92-100. doi: 10.24411/0042-8833-2017-00050.

В процессе технологической тепловой обработки пищевых продуктов часто наблюдается изменение их органолептических характеристик (окраски, вкуса и аромата) вследствие образования окрашенных веществ в результате реакции так называемого процесса меланоидинообразования, взаимодействия редуцирую­щих сахаров и свободных аминокислот, реакции нефер­ментативного потемнения, впервые описанной француз­ским ученым Майяром в 1912 г. Данная реакция может проходить в продуктах животного и растительного про­исхождения, поскольку все они содержат определенное количество редуцирующих сахаров и свободных амино­кислот или они образуются в ходе технологического процесса [1-6].

Процесс меланоидинообразования оказывает опреде­ленное влияние на потребительские свойства и качес­тво пищевых продуктов, так как наряду с улучшением органолептических показателей [7-10] и образованием веществ, обладающих антиоксидантными свойствами [11-13], при этом наблюдается накопление токсичных веществ [14-16], снижение пищевой ценности вследс­твие расходования аминокислот. В связи с этим исследование данного химического превращения является важным аспектом создания инновационных пищевых продуктов.

Цель работы - моделирование реакции меланоидинообразования in vitro на примере взаимодействия гидролизата белка куриного яйца и глюкозы для определения изменения содержания аминокислот в зависимости от условий протекания данной реакции.

Материал и методы

Объектом исследования стал гидролизат белка ку­риного яйца, который получали следующим образом. Белок куриного яйца отделяли от желтка, отбирали 4 пробы по 0,2 г белка. К каждой пробе добавляли по 4 см3 6 н раствора HCl и проводили кислотный гид­ролиз в течение 24 ч при 80 °С. Далее каждую пробу разбавляли дистиллированной водой в мерной колбе объемом 100 см3. Затем гидролизат нейтрализовали 10 н раствором NaOH до рН 7, доводили объем до 100 см3. Отбирали 2 см3 гидролизата и фильтровали его через мембранный фильтр; далее определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хромато­графии (ВЭЖХ) исходное (начальное) содержание ами­нокислот.

По 30 см3 гидролизата отбирали в 3 конические колбы объемом 50 см3 для 3 опытов по одному из па­раметров моделируемой реакции: температуре (50, 70 и 90 °С) и времени (10, 30 и 50 мин). В каждую пробу к гидролизату добавляли по 4,5 г глюкозы для получе­ния 15% раствора глюкозы в гидролизате. Далее прово­дили реакцию меланоидинообразования при рН 7. При исследовании воздействия температуры на реакцию меланоидинообразования реакция продолжалась 30 мин, а при исследовании влияния времени ее проводили при 70 °С. После завершения реакции исследуемые рас­творы охлаждали до комнатной температуры, фильтро­вали через мембранный фильтр в виалы объемом по 2 см3. Подготовленные таким образом пробы анализи­ровали методом ВЭЖХ.

Определение количества аминокислот производили с помощью ВЭЖХ [17] с предколоночной дериватиза-цией с использованием о-фталевого альдегида. Сис­тема включала хроматограф Agilent 1200 ("Agilent", США), диодно-матричный детектор (DAD, G1315D) и аналитическую колонку 3,0x150 мм, 3,5 мкм (ZORBAX Eclipse-AAA). Условия проведения ВЭЖХ-анализа: тем­пература термостатов колонки - 40 °С, расход элюента - 0,4 мл/мин, длина волны детектирования УФ -338 нм. Для количественного определения был построен калибровочный график зависимости площади пика ами­нокислот от их концентрации. Для этого использовали стандартные растворы смеси аминокислот с концент­рациями 25, 100, 250 пмоль/мкл. Время удерживания аминокислот составило (RT), мин: аспартат (ASP) -2,5; глутамат (GLU) - 3,7; серин (SER) - 9,7; гистидин (HIS) - 11,1; глицин (GLY) - 11,6; треонин (THR) - 11,9; аргинин (ARG) - 13,1; аланин (ALA) - 13,6; тирозин (TYR) -15,2; цистин (CYS) - 17,0; валин (VAL) - 18,1; метионин (MET) - 18,4; фенилаланин (PHE) - 20,2; изолейцин (ILE) -20,5; лейцин (LEU) - 21,4; лизин (LYS) - 21,6.

Результаты и обсуждение

Общая схема образования меланоидинов представ­лена на рис. 1 [18-20]. Так, начальная реакция - кон­денсация карбонильной группы редуцирующего сахара (альдозы) со свободной аминогруппой белка или ами­нокислоты, с потерей молекулы воды и образованием N-замещенного глюкозамина (этап 1).

Глюкозамин нестабилен и подвергается перегруппи­ровке Амадори с формированием 1-амино-1-дезокси-2-кетозы (кетозамина) (этап 2). Продукты перегруп­пировки Амадори во второй фазе могут реагировать тремя путями. Один из них - дальнейшая дегидратация (потеря двух молекул воды) с образованием редуктонов и дегидроредуктонов (этап 3). Второй путь - об­разование короткоцепочечных продуктов гидролиза, таких как диацетил, ацетон, пировиноградный альдегид и т.д. (этап 4), которые далее с участием аминокислот подвергаются распаду по Стреккеру до альдегидов (этап 5) и альдольной конденсации, либо при отсутствии аминных соединений реагируют с образованием аль-долей и высокомолекулярных безазотистых полимеров (этап 6). Третий путь - через Шиффовы основания и фурфурол. При этом отщепляются 3 молекулы воды (этап 3), затем протекает реакция с участием амино­кислот и воды. Все продукты второй фазы реагируют далее с аминокислотами в третьей фазе с образова­нием азотистых полимеров и сополимеров, называемых меланоидинами, коричневого цвета (этап 7). Они имеют различный аромат: от горького (жженого, лукового, про­горклого, капустного) до приятного (солодовый, корки хлеба, карамели, кофе). Этап 8 иллюстрирует прямой путь расщепления глюкозамина, минуя стадию пере­группировки Амадори.

Стандартный меланоидин содержит гидроксильные, карбонильные и карбоксильные группировки, кратные и эфирные связи, а его молекулярная масса колеблется между двумя и тридцатью тысячами Да. Многие иссле­дователи, изучавшие реакцию Майара на различных примерах, выделили производные фурана, пиррола, пиридина, пиразина, карболина и других гетероцикли­ческих соединений [21].

Общая схема разложения аминокислот при реакции меланоидинообразования описывается последова­тельностью реакций по Стреккеру (рис. 2) [18-20].

В результате проведенных исследований по модели­рованию реакции меланоидинообразования были выяв­лены следующие особенности.

Влияние продолжительности реакции на процесс меланоидинообразования неоднозначно (см. таблицу). Для SER, THR, VAL, MET, ILE, LEU с увеличением продолжи­тельности реакции с 10 до 50 мин концентрации аминокислот практически линейно возрастали. ASP и HIS харак­теризуются скачкообразным изменением концентрации с максимумом при продолжительности процесса 30 мин. Минимальные концентрации следующих аминокислот: GLU, GLY, ARG, ALA, TYR, CYS, PHE и LYS были отме­чены при продолжительности реакции 30 мин.

При исследовании зависимости протекания реакции меланоидинообразования от концентрации глюкозы в растворе гидролизата белка с увеличением количест­ва глюкозы наблюдалось уменьшение концентраций аминокислот, причем для большинства аминокислот их концентрация уменьшалась плавно, практически линейно, и только для CYS имело место резкое паде­ние содержания, а в случае TYR концентрация сначала сильно уменьшалась, затем незначительно возрастала (рис. 3).

Подобная зависимость наблюдалась при исследова­нии влияния температуры на протекание реакции меланоидинообразования: реакция проходила уже при тем­пературе 30 °С, дальнейшее изменение температуры в диапазоне 50-90 °С практически не влияло на процесс меланоидинообразования (рис. 4).

При термической обработке происходит дальнейшая поликонденсация, а при температуре выше 400 °С образуются так называемые пиромеланоидиды. Меланоидины не расщепляются пищеварительными ферментами человека, и следовательно, они не усваи­ваются. Однако они могут образовывать комплексы с белками-ферментами, влияя на их каталитическую активность [21].

Важную роль в реакции меланоидинообразования играет термическая трансформация глюкозы. Так, глюкоза при нагревании в кислой среде до 100 °С способна превращаться в фурфурол или 5-гидроксиметилфур-фурол [21].

Известно, что 5-гидроксиметилфурфурол малоустой­чив и легко разлагается с образованием муравьиной и левулиновой кислот; при его конденсации также могут образовываться гуминовые вещества. Гуминовые ве­щества небольшой степени конденсации растворимы в воде и окрашивают продукт в желтый цвет [21].

Наиболее значительное влияние на аминокислотный состав пробы оказывает уровень рН среды, в которой протекает реакция (рис. 5).

Так, было установлено, что в кислой среде про­цесс меланоидинообразования замедлялся для всех исследуемых кислот. Наибольшая устойчивость к раз­рушению отмечена у CYS, наименьшая - у LYS. Также установлено значительное снижение концентраций ILE, LEU и PHE, их содержание было практически на одном уровне. Другие аминокислоты, такие как MET, ALA, THR, GLY, HIS, SER, GLU, ASP, имели близкое содержание, наиболее сохранились CYS и TYR.

Кривая зависимости концентрации аминокислот от рН среды имеет максимум в нейтральной среде (рН 7) для PHE и CYS. Так же как и в кислой среде, в наибольшей степени подверглась деградации аминокислота LYS, а наиболее устойчивой оказалась CYS. Концентрация аминокислот VAL и TYR снизилась незначительно.

В щелочной среде наиболее устойчивыми оказались ILE, MET, VAL, причем максимальную устойчивость проявили аминокислоты MET и ILE при рН 12, причем для ILE наблюдалось линейное снижение концентрации при переходе из щелочной среды в кислую. Сильной де­градации подверглись следующие аминокислоты: THR, HIS, GLY, SER, ASP, LYS, CYS, GLU. Относительно устой­чивыми оказались LEU, PHE, ARG, TYR, ALA.

В целом исследования показали, что при прочих рав­ных условиях эксперимента наиболее полно процесс меланоидинообразования протекал в щелочной среде при рН 12.

Анализ результатов исследований показывает, что процесс образования меланоидинов многостадиен, и на каждой стадии сахароаминной реакции могут образовываться побочные продукты. Чередующиеся кратные связи хиноидной системы стабилизируются, принимая ароматический характер гетероциклических соединений. Меланоидины способны окисляться и вос­станавливаться, причем первая реакция идет быстрее второй [21].

Наблюдаемое существенное снижение концентраций аминокислот в гидролизате белка куриного яйца, по-види­мому, связано с протеканием реакции меланоидинообразования и процессов термического разрушения аминокислот.

Кроме того, активность реакции меланоидинообра-зования во многих случаях зависит от особенностей строения и физико-химических свойств органических соединений (моноуглеводов и аминокислот). Многие органические соединения имеют сложную иерархичную структуру и способны "ступенчато маскировать" свое сродство к реакции меланоидинообразования, т.е. на каждом из иерархических уровней организации данные вещества имеют свою активность. При этом именно на последнем иерархическом уровне сродство к реакции меланоидинообразования наибольшее. К веществам, обладающим сложной и многоуровневой иерархич­ностью, можно отнести белковые молекулы.

Наблюдаемое повышение концентрации некоторых аминокислот может быть связано с частичным ресинтезом. Установлено, что аминокислоты могут образовы­ваться при определенных условиях из простых неорга­нических соединений [22, 23].

Таким образом, в результате проведенных исследова­ний по моделированию реакции меланоидинообразованиявыявлены следующие закономерности: при увеличении температуры реакции Майяра снижались концентрации GLU, SER, HIS, THR, ARG, ALA, CYS, VAL, MET, LEU, LYS. В то же время с увеличением продолжительности реакции наблюдалось увеличение концентрации SER, THR, VAL, MET, ILE, LEU. Колебания концентрации аминокислот в ре­акционной среде (повышение и понижение) при повыше­нии температуры проведения реакции были характерны для ASP, GLY, TYR, PHE, ILE, а при увеличении времени проведения реакции - для ASP, GLU, HIS, GLY, ARG, ALA, TYR, CYS, PHE, LYS. Наиболее существенные изменения отмечены при изменении рН в щелочную сторону.

Исследование влияния условий проведения экспери­мента показало, что в процессе меланоидинообразования происходит снижение содержания некоторых ами­нокислот (в том числе незаменимых) и, следовательно, снижение пищевой ценности продукта. В результате протекания этой реакции теряется от 20 до 50% свобод­ных аминокислот, причем с возрастанием температуры и увеличением продолжительности нагревания эти по­тери возрастают. Полученные данные важно учитывать при разработке новых технологий пищевых продуктов с максимальным сохранением их химического состава, пищевой ценности и потребительских свойств.

Литература

1. Schamberger G.P., Labuza Th. P. Effect of green tea flavonoids on Maillard browning in UHT milk // LWT Food Sci. Technol. 2007. Vol. 40, N 8. P. 1410-1417.

2. Andrewes P. Changes in Maillard reaction products in ghee during storage // Food Chem. 2012. Vol. 135, N 3. P. 921-928.

3. Bekedam E.K., Roos E., Schols H.A., Van Boekel M.A.J.S., Smit G. Low molecular weight melanoidins in coffee brew // J. Agric. Food Chem. 2008. Vol. 56, N 11. P. 4060-4067.

4. Wellner A., Huettl Ch., Henle Th. Formation of Maillard reaction prod­ucts during heat treatment of carrots // J. Agric. Food Chem. 2011. Vol. 59, N 14. P. 7992-7998.

5. Coimbra M.A., Nunes C., Cunha P. R., Guine R. Amino acid profile and Maillard compounds of sun-dried pears. Relation with the red­dish brown colour of the dried fruits // Eur. Food Res. Technol. 2011. Vol. 233, N 4. P. 637-646.

6. Jing H., Yap M., Wong P.Y.Y., Kitts D.D. Comparison of physicochemical and antioxidant properties of egg-white proteins and fructose and inulin Maillard reaction products // Food Bioprocess Technol. 2011. Vol. 4, N 8. P. 1489-1496.

7. Hong J.-H., Kwon K.-Y., Kim K.-O. Sensory characteristics and con­sumer acceptability of beef stock containing the glutathione-xylose Maillard reaction product and/or monosodium glutamate // J. Food Sci. 2012. Vol. 77, N 6. P. S233-S239.

8. Wang R., Yang Ch., Song H. Key meat flavour compounds formation mechanism in a glutathione-xylose Maillard reaction // Food Chem. 2012. Vol. 131, N 1. P. 280-285.

9. Жаркова И.М., Кучменко Т.А., Росляков Ю.Ф. Исследование запаха хлеба их смеси ржаной и пшеничной муки, приготовленного на раз­ных заквасках и подкислителе // Хлебопродукты. 2015. 8. С. 47-49.

10. Lee S.M., Jo Ye-Jin, Kim Y.-S. Investigation of the aroma-active com­pounds formed in the Maillard reaction between glutathione and reduc­ing sugars // J. Agric. Food Chem. 2010. Vol. 58, N 5. P. 3116-3124.

11. Alves R.C., Costa A.S.G., Jerez M., Casal S., Sineiro J., Nunez M.J. et al. Antiradical activity, phenolics profile, and hydroxymethylfurfural in espresso coffee: influence of technological factors // J. Agric. Food Chem. 2010. Vol. 58, N 23. P. 12 221-12 229.

12. Liu Y., Kitts D. D. Confirmation that the Maillard reaction is the prin­ciple contributor to the antioxidant capacity of coffee brews // Food Res. Int. 2011. Vol. 44, N 8. P. 2418-2424.

13. Lopez de Lerma N., Peinado J., Moreno J., Peinado R. A. Antioxidant activity, browning and volatile Maillard compounds in Pedro Ximenez sweet wines under accelerated oxidative aging // LWT Food Sci. Technol. 2010. Vol. 43, N 10. P. 1557-1563.

14. Carrieri G., De Bonis M.V., Pacella C., Pucciarelli A., Ruocco G. Mod­eling and validation of local acrylamide formation in a model food during frying // J. Food Eng. 2009. Vol. 95, N 1. P. 90-98.

15. Gokmen V., Senyuva H. Z. Study of colour and acrylamide formation in coffee, wheat flour and potato chips during heating // Food Chem. 2006. Vol. 99, N 2. P. 238-243.

16. Mestdagh F., De Wilde T., Delporte K., Van P. C., De Meulenaer B. Impact of chemical pre-treatments on the acrylamide formation and sensorial quality of potato crisps // Food Chem. 2008. Vol. 106, N 3. P. 914-922.

17. Agilent Technologies (PN: 5980-1193EN) Rapid, Accurate, Sensitive, and Reproducible HPLC Analysis of Amino Acids / пер. на русский язык: В. Панкратов, Д. Янович. Минск, 2006. 10 с.

18. Полумбрик М.О., Литвяк В.В., Ловкис З.В., Ковбаса В.Н. Углеводы в пищевых продуктах. Минск : ИВЦ Минфина, 2016. 592 с.

19. Щербаков В.Г., Лобанов В.Г., Прудникова Т.Н., Минакова А.Д. Био­химия. СПб. : ГИОРД, 2003. 440 с.

20. Нечаев А.П., Траубенберг С.Е., Кочеткова А.А. и др. Пищевая химия / под ред. А.П. Нечаева. СПб. : ГИОРД, 2001. 592 с.

21. Давидянц С.Б. Темное царство меланоидинов // Химия и жизнь. 1980. 3. С. 44-48.

22. Johnson A.P., Cleaves H.J., Dworkin J.P., Glavin D.P., Lazcano A., Bada J.L. The Miller volcanic spark discharge experiment // Science. 2008. Vol. 322. P. 404.

23. Bada J.L., Lazcano A. Prebiotic soup - revisiting the Miller experi­ment // Science. 2003. Vol. 300. P. 745-746.