Preparation and physical-chemical characteristics of functional food ingredient -zinc complex with egg protein fermentolisate

Abstract

The use of biotechnological approach, including obtaining of food protein fermentative hydrolysates, following their combination with essential microelements (ЕМ), allows to obtain new nutritional sources of these EM-obligate antioxidants (zinc, copper, manganese) in organic high-bioavailable form. In this research new nutritional source of zinc organic form as a complex with peptide fractions of fermentolysate of coagulated egg protein was obtained and was characterized by physical-chemical methods. Inhibitory activity of native egg protein lowered by 2 fold under coagulation with one-stage thermal processing (t = +88 °C). The proteolysis of coagulated egg protein was performed within two time intervals (2 and 5 hours) by enzymatic preparations, proteases of bacterium origin (neutral Protease B 2256, alkaline protease C 1986 and alkaline protease Protozim B). A molecular weight distribution of peptide fractions in obtained fermentolysates was characterized by the method of exclusion chromatography and nitrogen concentration was determined by Kjehldal method. Water-soluble phase, obtained by means of 5 hours fermentolysis using enzymatic preparation Protozim B, contained 85% of general nitrogen against original coagulated egg protein. The concentration of peptide fraction with the molecular weight 1.1-6.9 kD was 58% and less than 1.1 kD - 21%. This fermentolisate was used to obtain a complex with zinc. Zinc concentration in complex was 19 mg/g. Technological approach used in this work allowed to obtain a new high concentrated food source of zinc in organic form as an ingredient of specialized foods for microelement deficiency prevention is prospective.

Keywords:egg protein, zinc, enzymatic hydrolysates, complexes, functional food ingredients, functional foods

Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2017; 86 (2): 70-75. doi: 10.24411/0042-8833-2017-00035.

При дефиците или недостаточности в рационе чело­века эссенциальных микроэлементов (ЭМ) - облигатных пищевых антиоксидантов, в том числе цинка, повышается риск свободнорадикальной патологии, про­являющейся многочисленными болезнями и клиничес­кими синдромами [1, 2].

Выявление и количественная оценка недостаточной обеспеченности цинком довольно трудоемки, поскольку определение цинка в плазме крови позволяет обнару­жить лишь тяжелую степень его дефицита [3]. Тем не менее имеющиеся данные свидетельствуют о том, что неадекватная обеспеченность этим ЭМ (в основном вследствие его недостаточного поступления с пищей и/или низкой усвояемости в составе пищевых про­дуктов растительного происхождения) распространена в странах Юго-Восточной Азии, Африки, в ряде регио­нов Европы, а также в России [4-6].

Практическая реализация программ, направленных на диетическую профилактику и коррекцию мик­роэлементной недостаточности, предполагает, во-первых, обогащение эссенциальными микроэлемен­тами пищевых продуктов массового потребления, доступных для всех групп детского и взрослого на­селения, регулярно используемых в повседневном питании, и, во-вторых, широкое производство специализированной продукции, включающей диетические профилактические и лечебные продукты, биологи­чески активные добавки (БАД) к пище, продукты для питания спортсменов, детей раннего возраста, функциональные пищевые продукты [7]. Отнесение пищевого продукта к категории "функциональный" определяется наличием в его составе (в определен­ных количественных соотношениях) функциональных пищевых ингредиентов (ФПИ), потребление которых с позиций доказательной медицины способствует снижению риска развития алиментарно-зависимых заболеваний, сохранению и улучшению здоровья [8]. Качество ФПИ, как дополнительных концентрирован­ных источников ЭМ, прежде всего должно обеспечи­ваться их высокой усвояемостью и одновременно бе­зопасностью, а эффективность в полной мере должна отвечать требованиям доказательной медицины. Ис­пользование биотехнологического подхода, включа­ющего ферментативный гидролиз пищевых белков и последующее комплексирование с эссециальными микроэлементами (ЭМ) с незаполненной d-электрон-ной оболочкой, позволяет получать новые пищевые источники этих ЭМ - облигатных антиоксидантов (цинка, меди, марганца) в органической высокобиодоступной форме [1].

Перспективным исходным пищевым белком - объек­том ферментолиза для последующего получения орга­нической формы цинка в качестве ФПИ является белок куриного яйца, обеспечивающий, как известно, питание эмбриона и обладающий биологической ценностью, превышающей этот показатель для большинства других пищевых белков [9]. Данные сравнительной оценки со­держания незаменимых аминокислот в белковой части яйца и в составе "идеального белка" по шкале ФАО/ ВОЗ свидетельствуют об отсутствии лимитирующих аминокислот в составе яичного белка. Переваривание сырого яичного белка в желудочно-кишечном тракте существенно снижается, поскольку в его составе со­держатся ингибитор сериновых протеиназ овомукоид (около 10%) и в существенно меньших количествах не­которые другие ингибиторы ферментов (овоингибитор, овостатин, цистатин). Соответственно сырой яичный белок не только плохо усваивается, но и может снижать усвояемость других белков пищи. Тепловая обработка снижает ингибиторную активность овомукоида, облег­чая его протеолиз in vitro [10].

Цель работы - представить результаты исследования, направленного на получение и физико-химическую ха­рактеристику нового пищевого источника органической формы цинка в виде комплекса этого ЭМ с пептидными фракциями ферментолизата коагулированного яичного белка.

Материал и методы

Образец коагулированного яичного белка был полу­чен его отделением от желтка, перемешиванием жид­кой белковой массы, подкислением лимонной кислотой с добавлением хлористого натрия (0,13 и 0,8% соответс­твенно), выдерживанием при комнатной температуре (24 °С) в течение 15 мин и последующей одностадийной тепловой обработкой смеси (нагревание до +88 °С при постоянном перемешивании). После этого была отде­лена жидкая фаза, а полученный коагулят охлажден и лиофильно высушен. Образец нативного яичного белка был получен его отделением от желтка и лиофильно высушен.

При проведении ферментативного гидролиза ис­пользовали протеазы бактериального происхождения: нейтральная протеаза В 2256 (продуцент - Bacillus licheniformis, активность 57775 ед/г, Ладыженский завод ферментных препаратов, Украина), щелочная протеаза С 1986 (продуцент - Acremonium, 77850 ед/г, Ладыжен­ский завод ферментных препаратов, Украина) и ще­лочная протеаза протозим В (активность 100 000 ед/г, "Микробиопром", Украина). Ферментативные актив­ности определены согласно [11].

Определение ингибиторной активности нативного и коагулированного яичного белка по отношению к трипсину из поджелудочной железы крупного рогатого скота ("Sigma", США) проведено согласно методике [12] c некоторыми модификациями. Навески 4,00 г нативного или коагулированного яичного белка диспер­гировали в объеме 36,0 см3 0,01М фосфатно-солевого буфера (рН 7,4) в течение 1 ч при постоянном переме­шивании при комнатной температуре (24 °С) с после­дующим центрифугированием (3000 об/мин, 15 мин, центрифуга 6В, Beckman, Германия) Для проведения реакции в пробирки вносили по 0,2 см3 супернатанта (в различных разведениях: 10-3200 раз), по 1,7 см3 0,1 М трис-HCl, рН 7,8 с 0,001 М Са2+ и 0,1 см3 0,01% раствора трипсина в 0,001 н. HCl. В пробу "бланк" вносили 0,2 см3 фосфатно-солевого буфера, 1,7 см3 трис-HCl буфера и 0,1 см3 раствора трипсина. Растворы термостатировали 10 мин при 37 °С, после чего вносили по 0,5 см3 1,09% раствора N-альфа-бензоил-DL-аргинин-р-нитроанилид гидрохлорид (БАПНА) в диметилформамиде. Через 30 мин реакцию останавливали добавлением 0,5 см3 0,5 н H2SO4. Определяли экстинкцию растворов при λ=405 нм против пробы "бланк".

Протеолиз коагулированного яичного белка прово­дили следующим образом: 2% водную взвесь коагу­лированного белка выдерживали в течение 2 ч на во­дяной бане при температуре +53-55 °С (в случае протеазы В и С) или при +57-59 °С в (случае протозима В). Затем вносили фермент в количестве 5,0% (по массе от навески белка) и при постоянном перемешивании проводили ферментативный гидролиз в течение 5 ч, поддерживая рН в диапазоне 7,1-7,3 (для протеазы В и протеазы С) или 7,4-7,6 (для протозима В) 5,0-процен­тным раствором KOH:NaOH (2:1). Аликвоты реакционной смеси отбирали через 2 ч от начала реакции и через 5 ч (окончание ферментолиза) Реакцию останавливали нагреванием смеси до 75 °С и выдерживанием при этой температуре в течение 30 мин. Затем ферментолизаты центрифугировали (3000 об/мин, 15 мин, центрифуга "Beckman J-6B", "Beckman", США), декантировали надосадок, промывали осадок дистиллированной водой и объединяли супернатанты. Количественно отбирали осадок. Осадок и супернатант лиофильно высушивали (лиофильная сушилка ЛС 500, "ПРОИНТЕХ-био", РФ) и по окончании процесса лиофилизации взвешивали сухие продукты.

В аликвотах гидролизатов оценивали молекулярно-массовое распределение методом эксклюзионной хроматографии согласно [13] [колонка Супероза 12, 1,0x30 см, ("Serva", Германия), элюент 0,2 М NaCl, ско­рость элюирования 0,4 см3/мин, длина волны проточного УФ-детектора УФ132 - 280 нм, программа для обработки данных "Мультихром 3.1"]. Хроматограммы интегриро­вались весовым методом в диапазоне молекулярных масс от свободного до полного объема хроматографической колонки.

Комплекс цинка с ферментативным гидролизатом коагулированного белка, полученного с использова­нием протеазы В, получали по методике [14] с не­значительными модификациями. К осветленному ферментолизату при комнатной температуре добавляли 10% водный раствор ZnCl2 в соотношении по сухим веществам 20:1. Реакцию при постоянном перемешивании проводили в течение 60 мин при рН 7,0-7,1 при комнатной температуре (24 °С). По окончании инкубации полученную смесь осветляли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 мин, супернатант лиофильно высушивали.

Содержание азота в образцах яичного белка и его ферментолизатов определяли по методу Къельдаля [15] и содержание белка рассчитывали, используя коэф­фициент 6,25. Содержание цинка в составе комплекса с ферментолизатом определяли атомно-абсорбционным методом [16].

Авторы выражают благодарность старшему науч­ному сотруднику лаборатории пищевых биотехноло­гий и специализированных продуктов ФГБУН "ФИЦ питания и биотехнологии" С.Н. Зорину за помощь в работе.

Результаты и обсуждение

Вследствие мягких условий коагуляции ингибирующая активность яичного белка по отношению к панкре­атическому трипсину снизилась в 2 раза. Однако даже такое относительно незначительное снижение ингибиторных свойств яичного белка способствовало доста­точно эффективному одностадийному проведению протеолиза in vitro, о чем свидетельствуют представленные в таблице результаты сравнительной количественной оценки молекулярно-массового распределения пептид­ных фракций ферментолизатов коагулированного яич­ного белка, полученных с использованием трех различ­ных ферментативных препаратов.

Увеличение времени протеолиза с использованием протеазы С от 2 ч до 5 ч практически не влияло на уве­личение содержания фракций пептидов с молекулярной массой ниже 2,6 кДа, а при использовании протеазы В и протозима В этот показатель возрастал соответственно на 6% и 3%. Ферментолиз в течение 5 ч (в за­висимости от выбранного ферментного препарата) поз­волял перевести в водорастворимую фазу 52% (при использовании протеазы С), 69% (при использовании протеазы В) и 85% (при использовании протозима В) общего азота относительно исходного коагулирован­ного яичного белка. Для получения комплекса с цинком был выбран полученный в результате 5-часового рас­щепления коагулированного яичного белка протозимом В ферментолизат № 3, содержащий в своем составе 58% пептидных фракций в интервале молекулярных масс 6,9-1,1 кДа и 21% фракций с молекулярной массой менее 1,1 кДа. Высокая степень расщепления пептидных связей в ферментолизате определила эффективность связывания цинка, содержание которого в комплексе составило 19 мг/г.

Добавление цинка в составе ФПИ в 100 г пищевого продукта в количестве, обеспечивающем не менее 30% от его суточной потребности, является отличительным признаком функционального пищевого продукта с высо­ким содержанием цинка [8]. Ожидаемый благоприятный эффект при систематическом приеме функциональных пищевых продуктов с высоким содержанием цинка связан с тем, что этот ЭМ способствует нормализации кислотно-щелочного баланса. В соответствии с выше­изложенным содержание полученного комплекса цинка с гидролизатом № 3 в качестве ФПИ может составлять всего 0,2% и не влиять на органолептические свойства продукта.

Ферментолизаты яичного белка находят все более широкое применения при создании новых видов специ­ализированных пищевых продуктов [17, 18]. Использо­вание одностадийного гидролитического расщепления яичного белка с помощью ферментного препарата Flavopro 786MDP позволило получить высокоусвояемый ферментолизат, лишенный горького вкуса [19]. Тем не менее в доступной литературе нам не встречались публикации, свидетельствующие об использовании комплексов ферментолизатов яичного белка с ЭМ в качестве ФПИ.

Таким образом, очевидна перспективность масшта­бирования использованного в работе технологического подхода для получения в промышленных условиях вы­сококонцентрированного пищевого источника цинка в органической форме, в качестве микроингредиента специализированных пищевых продуктов для профи­лактики микроэлементной недостаточности.

Исследование выполнено при финансовой поддержке гранта Российского научного фонда (проект № 16-16-04047).

Литература

1. Мазо В.К., Гмошинский И.В., Ширина Л.И. Новые пищевые источники эссенциальных микроэлементов-антиоксидантов. М. : Миклош, 2009. 208 с.

2. Мазо В.К., Гмошинский И.В., Скальный А.В., Сысоев Ю.А. Цинк в питании человека: физиологические потребности и био­доступность // Вопр. питания. 2002. Т. 71, № 3. С. 46-51.

3. Hotz С., Brown K. Assessment of the risk of zinc deficiency in populations and options for its control // Food Nutr. Bull. 2004. Vol. 25. P. S99-S199.

4. Epstein M.M., Kasperzyk J.L., Andmn O., Giovannucci E.L. et al. Dietary zinc and prostate cancer survival in a Swedish cohort // Am. J. Clin. Nutr. 2011. Vol. 93, N 3. P. 586-593.

5. Rubio C., Gutmrrez A.J., Revert C., Reguera J.I. et al. Daily dietary intake of iron, copper, zinc and manganese in a Spanish popula­tion // Int. J. Food Sci. Nutr. 2009. Vol. 60, N 7. P. 590-600.

6. Вильмс Е.А., Турчанинов Д.В., Турчанинова М.С. Микроэлементозы у детского населения мегаполиса: эпидемиологическая характеристика и возможности профилактики // Педиатрия. 2011. Т. 90, № 1. С. 96-101.

7. Пищевые ингредиенты в создании современных продуктов питания / под ред. В.А. Тутельяна, А.П. Нечаева. М. : ДеЛи плюс, 2014. 520 с.

8. ГОСТ Р 55577-2013. Продукты пищевые функциональные; информация об отличительных признаках и эффективности. М. : Стандартинформ, 2014. 16 с.

9. Пищевая и биологическая ценность яиц и яичных продуктов : справочник / под. общ. ред. В.И. Фисинина. Сергиев Посад : ВНИТИП, 2013. 28 с.

10. Баяржаргал М., Розанцев Э.Г., Зорин С.Н., Бурдза Е.А. и др. Двухстадийный ферментативный гидролиз белков куриного яйца // Хранение и переработка сельхозсырья. 2005. № 4. С. 34-36.

11. ГОСТ 20264.2-88. Препараты ферментные. Методы опре­деления протеолитической активности (с изменением N 1). М. Государственный комитет СССР по стандартам, 1988. 11 с.

12. Биохимические методы исследования в клинике/ под ред. А.А. Покровского. М. : Медицина, 1969. С. 206-208.

13. Зорин С.Н., Баяржаргал М. Получение ферментативных гидролизатов пищевых белков с использованием некоторых ком­мерческих ферментных препаратов и различных схем про­ведения гидролиза // Биомед. химия. 2009. Т. 55, вып. 1. С. 73-80.

14. Сидорова Ю.С., Зорин С.Н., Мазо В.К., Арнаутов М.В. и др. Новый источник органических форм цинка // Вопр. питания. 2011. Т. 80, № 6. С. 72-75.

15. ГОСТ 10846-91. Зерно и продукты его переработки. Метод опре­деления белка. М. : Стандартинформ, 2009. 7 с.

16. ГОСТ 30178-96 Сырье и продукты пищевые. Атомно-абсорбционный метод определения токсичных элементов. М. : Стандартинформ, 2010. 7 с.

17. Ruiz B. Debut of cutting edge and healthy egg products in Spain [Электронный ресурс]. Электрон. текстовые дан. Испания, 2015. URL: http://www.wattagnet.com/articles/24567-debut-of-cutting-edge-and-healthy-egg-products-in-spain.

18. Zambrowicz A., Eckert E., Bobak L., Dabrowska A. et al. Biological activity of peptides derived from de-fatted egg yolk granules hydrolysed with serine protease from Y. lipolytica yeast // Worlds Poultry Sci. J. 2015. Vol. 71, suppl. 1. Egg Meat Simposia. Book of Abstracts. P. 135.

19. Garces-Rimona M., Sandovalb M., Molinaa E., Lоpez-Fandiсoa R. Egg protein hydrolysates: New culinary textures // Int. J. Gastronomy Food Sci. 2016. Vol. 3. P. 17-22. Вопр. питания. 2017. № 2. С. 15-17.