Development of methods for determining acrylamide in food products by gas-liquid chromatography

AbstractThe method of determination of acrylamide in various food (milk powder, potato chips, instant coffee) by gas-liquid chromatography after pre-bromination was developed. Studies have shown the possibility of using bromination of acrylamide to give it the necessary properties for better extraction, purification and detection. Also revealed the possibility of qualitative and quantitative determine a acrylamide in food by gas-liquid chromatography with detection by electron capture detector.

Keywords:acrilamide, gas-liquid Chromatography

Акриламид (2-пропенамид, CAS79-06-1, LD50 у мышей 170 мг/кг) широко используется в производстве пластмасс и в органическом синтезе. Данное вещество токсично, поражает преимущественно нервную систему, а также печень и почки, легко проникает через неповрежденную кожу, раздражает слизистые оболочки глаз, может способствовать повышению риска онкологических заболеваний [1, 7].

Токсичность акриламида обусловлена небольшой молекулярной массой, маленьким размером молекулы, высокой растворимостью в воде, а также относительно легким проникновением в организм человека через желудочно-кишечный тракт и кожу.

Акриламид не является нативным компонентом пищевых продуктов, не попадает в пищевые продукты из внешней среды и не используются в пищевой промышленности. Однако проведенные в 2002 г. шведскими учеными исследования показали возможность поступления акриламида в организм с пищевыми продуктами, в которых он образуется в процессе термической обработки [2, 4].

Основным механизмом образования акриламида в пищевых продуктах является взаимодействие углеводов и белков при повышенной температуре (так называемая реакция Майара, возможный механизм которой представлен на рис. 1 [4, 5]. Согласно этому, было предположено, что содержание акриламида должно быть наибольшим в продуктах, богатых углеводами и белками, подвергающихся при изготовлении воздействию высоких температур. Наибольшее содержание акриламида (мкг/кг) было обнаружено: в картофельных чипсах (50-2500), кукурузных хлопьях (100-850), крекерах (20-600), жареном картофеле (350-450), жареной кукурузе (100-300), бисквитах (10-650), кофе (100-400), халве (10-230), шоколаде (40-100) [2, 5].

Обнаружение значительного уровня акриламида указывает на его значительное содержание в пищевых продуктах, обусловливая необходимость разработки методик по его идентификации и количественному определению, а также установлению гигиенических нормативов по его содержанию в пищевых продуктах.

Рассматривая аналитические подходы к определению акриламида в пищевых продуктах, необходимо отметить, что акриламид представляет собой сложный объект для анализа: малый размер молекулы, а также растворимость преимущественно только в воде делают его извлечение из пищевых продуктов и очистку сложной нетривиальной задачей. Эта задача еще больше усложняется присутствием в матриксе продукта значительных количеств липидов, а также природных полимеров - белков и полисахаридов [3, 7-9].

В Российской Федерации сегодня отсутствуют какие-либо утвержденные методики определения акриламида в пищевых продуктах. Максимально допустимое его содержание в пищевых продуктах также не регламентировано. За рубежом определение акриламида проводят с помощью газовой и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Наиболее распространенные методы представлены в таблице; они характеризуются высокой чувствительностью и хорошей воспроизводимостью получаемых результатов.

Целью нашей работы была разработка методики количественного определения акриламида в пищевых продуктах методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ).

С нашей точки зрения, наиболее оптимальным для определения акриламида методом является ГЖХ с детектированием бромпроизводных акриламида на детекторе электронного захвата, что обусловлено физическими свойствами акриламида (малый размер молекулы, низкая температура кипения), высокой селективностью и чувствительностью данного метода, а также тем, что необходимое оборудование широко распространено. Бромпроизводные акриламида обладают лучшей растворимостью в органических растворителях, в частности в этилацетате, что позволяет экстрагировать эти производные в этилацетат. Также бромирование проводилось для улучшения определения акриламида с помощью электронозахватного детектора, поскольку данный вид детектора обладает повышенной чувствительностью к галогенпроизводным.

Рис. 1. Возможный механизм образования акриламида из глюкозы и аспарагина в ходе реакции Майяара

Материал и методы

Газохроматографическое определение проводили на газовом хроматографе "Agilent 7890A" (США) с хроматографической колонкой "Supelcowax" (60 м, 0,53 мм, 1 мкм) (США). Газовый хроматограф оснащен электронозахватным ("Agilent") и масс-селективным (Finnigan Trace DSQ II) (США) детекторами, которые работали поочередно.

Центрифугирование образцов проводили на центрифугах: "Rotina 38" (ФРГ) и "Eppendorf 5418" (ФРГ), встряхивание - в шейкере "Biosan OS-10" (США).

В процессе подготовки пробы использовались следующие реактивы: бидистиллированная вода, гексан х.ч., этилацетат х.ч., калия бромид х.ч., калия бромат х.ч., кислота серная х.ч., натрия тиосульфат ч., натрия сульфат х.ч., триэтиламин (≥99%; импортный).

Объекты исследования

Для разработки методики были выбраны следующие объекты: чипсы картофельные (как объект, заведомо содержащий акриламид в концентрации >0,5 мг/кг), сухое молоко (как объект со сложной матрицей, не содержащий акриламид в пределах обнаружения существующих методик), кофе растворимый (как сильноокрашенный объект с содержанием акриламида в концентрациях <0,5 мг/кг).

Приготовление стандартного раствора

Стандартный образец акриламида (≥99%) был получен от фирмы "Merck Schuchardt OHG" (США).

Около 50 мг акриламида (навеска с точностью 0,1 мг) отвешивали в мерную колбу объемом 50 мл. Добавляли 20 мл дистиллированной воды и перемешивали до полного растворения. После этого объем доводили до метки дистиллированной водой и перемешивали (основной раствор, концентрация 1 мг/мл). 1 мл основного раствора переносили в мерную колбу на 100 мл, доводили дистиллированной водой до метки и перемешивали (рабочий раствор, концентрация 10 мкг/мл).

Приготовление контрольных образцов

Контрольные образцы готовили с целью оценки метрологических характеристик методики. Для этого к навеске сухого молока (предварительно проверенного на отсутствие акриламида) добавляли акриламид до концентраций от 0,005 до 5,0 мг/кг.

Методы, применяемые для определения акриламида в Европе [5]

Подготовка пробы Экстракция

Из твердых объектов акриламид экстрагировали дистиллированной водой (к 2,0 г продукта добавляли 20 мл дистиллированной воды). После экстракции полученный раствор подвергали центрифугированию (5000 об, 10 мин) и отбирали 15 мл прозрачного слоя.

Полученный таким образом экстракт содержал значительное количество белка и жира, что потребовало введения операций по их удалению.

Удаление белков и жиров

Для удаления жиров 15 мл водного экстракта, полученного указанным выше способом, обезжиривали 15 мл гексана 2 раза. Предварительно нами была проведена проверка отсутствия потерь акриламида в этих условиях. Полученные данные показали, что акриламид нерастворим в гексане и не может переходить в гексан в указанных условиях.

Для осаждения белков к очищенному от жиров водному экстракту добавляли 50% серную кислоту до рН<1. Выбор серной кислоты был обусловлен также необходимостью ее присутствия в образце для последующего бромирования. Денатурированные белки удаляли центрифугированием.

Бромирование

К 10 мл очищенного водного экстракта добавляли калия бромид (5 г) и перемешивали до полного растворения. После этого добавляли раствор калия бромата (0,2 М), перемешивали, помещали в холодильник на 90 мин.

Экстракция

К полученному раствору добавляли 10 мл этилацетата, встряхивали в течение 30 мин, центрифугировали. Слой этилацетата отбирали.

Рис. 2. Хроматограмма образца картофельных чипсов

Рис. 3. Хроматограммы образцов сухого молока (нижняя линия - без добавок, акриламид не обнаружен; верхняя линия - с добавкой акриламида на уровне 1,0 мг/кг)

Очистка этилацетатного экстракта

После бромирования образуется неустойчивое дибромпромпроизводное, которое постепенно переходит в более устойчивое монобромпроизводное. Для ускорения этого перехода в полученный экстракт добавляли триэтиламин (0,2 мл на 10 мл этилацетатного извлечения).

Условия хроматографического разделения и детектирования

Были подобраны следующие условия газохроматографического разделения: 140 °C - 1 мин, далее 5 °C/мин - до 220 °C, изотерма 33 мин, газ-носитель - азот (4 мл/мин). Параметры работы электронозахватного детектора: температура 300 °С, поток поддува - 30 мл/мин.

Время удерживания монобромпроизводного акриламида в этих условиях составило 18,5 мин. По приготовленным контрольным пробам ориентировочная чувствительность метода составляет <0,005 мг/кг. Полученные хроматограммы представлены на рис. 2 и 3.

Результаты и обсуждение

Изучение продуктов бромирования акриламида

При использовании ГЖХ с масс-спектрометрическим детектором было показано, что образующийся при бромировании дибромпропанамид при действии триэтиламина переходит в монобромпропенамид. При этом было обнаружено, что:

- при бромировании акриламида образуются только дибромпропанамид и монобромпропенамид;

- после добавления триэтиламина к продуктам бромирования акриламида обнаруживается только монобромпропенамид;

- акриламид, не подвергшийся бромированию, в экстракте не обнаружен (он либо не экстрагируется в этилацетат, либо бромирование проходит полностью);

- в качестве сопутствующих веществ были обнаружены кротоновая кислота, ксилол, метилбензальдегид и ряд других веществ, указывающих на необходимость дополнительной очистки исходных реактивов.

Метрологические характеристики методики

Для оценки некоторых метрологических характеристик метода было проведено исследование серии контрольных образцов (на основе сухого молока) с содержанием акриламида в диапазоне от 0,005 до 5,0 мг/кг. Результаты проведенных исследований показали, что существующая методика имеет следующие метрологические характеристики: чувствительность 0,005 мг/кг (соотношение сигнал/шум не менее чем 1 к 3), пределы количественного определения от 0,01 мг/кг (соотношение сигнал/шум не менее чем 1 к 10) до 5,0 мг/кг (р=0,998).

Определение акриламида в картофельных чипсах и растворимом кофе

Для количественного определения акриламида в картофельных чипсах и растворимом кофе был использован метод добавок. Содержание акриламида в исследованных образцах картофельных чипсов составило 3,2 мг/кг, в образцах растворимого кофе - 0,23 мг/кг, что соответствует данным аналогичных исследований [2, 5].

Проведенные исследования показали возможность использования бромирования акриламида с целью придания ему необходимых свойств для лучшей экстракции, очистки и детектирования. Также выявлена возможность качественного и количественного определения акриламида в пищевых продуктах методом ГЖХ с детектированием на детекторе электронного захвата. Обнаруженное в образцах пищевой продукции содержание акриламида является токсикологически значимым, что делает необходимым проведение дальнейших исследований с целью возможной разработки гигиенического норматива.

Литература

1. Багрянцева О.Н., Шатров Г.Н., Хотимченко С.А. // Вопр. питания. - 2010. - Т. 79, № 1. - С. 4-12.

2. Acrylamide. The toxicological evaluation of compounds on the agenda. Evaluation of certain food contaminants: sixtyfourth report of the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives. - Geneva, 2005. - Р. 8 -26.

3. Castle L . // J. Agricultur. Food Chemistry. - 1993. - Vol. 41. - P. 12 6 1-12 6 3 .

4. Dhiraj A., Shetty V., Shetty K. // Innovat. Food Science Emerg. Technolog. - 2003. - Vol. 4. - P. 331-338.

5. Health implications of acrylamide in food: report of a joint FAO/WHO consultation. - Geneva, 2002. - 32 р.

6. Klapp C . // The Lancet. - 2002. - Vol. 360. - P. 64-71.

7. Nemoto S., Takatsuk S.,Sasaki K. et al. // Shokuhin Eiseigaku Zasshi. - 2002. - P. 371-376.

8. Wenzl T., Beatriz de la Calee M., Anklam E. Overview on analytical methods for the determination of acrylamide in food products. - London: Science, 2003. - 148 p.

9. Zhu Y., Li G., Duan Y. et. al. // Food Chemistry. - 2008. - Vol. 109. - P. 899-908.