Influence of meat semi-prepared foods produced with an addition of water having a reduced deuterium content on the indicators of the laboratory animals with the model of alloxan diabetes

Abstract

The paper presents the results of the study on the influence of water with a reduced deuterium content and the meat semi-prepared foods produced with its addition on the indicators of the laboratory animals with the model of alloxan diabetes. The effect of low concentrations of deuterium on the body weight dynamics was shown as well as the manifestation of glucosuria and ketonuria, and clinico-biological indicators of the animal's blood. The experiment was carried out during 42 days on male rats of Wistar stock, which were divided into 4 groups - 2 experimental, control (n=10) and intact (n=6), and consisted of three stages: adaptational, the stage of modeling of alloxan diabetes (a single intraperitoneal injection of alloxan monohydrate - 12 mg/100 g body weight) and dietic therapeutic. The animals of the experimental groups consumed water with a reduced deuterium content and standard vivarium diet or the meat minced semi-prepared products produced with its addition and cooked to culinary readiness. The control group consumed tap water and standard vivarium diet. In animals of the 1st group, which consumed the meat product, glucosuria persisted up to the 28th day (the 11th day after administration of alloxan), ketonuria up to the 34th day (the 17th day after modeling). In rats of the 2nd group, which consumed water with the decreased deuterium content, glucose in urea was not detected already on the 7th day after administration of alloxan, ketones on the 17th day after modeling of the disease, respectively. In animals of the control group, glucosuria and ketonuria persisted up to the end of the experiment. As a result of the investigations, the positive effect of water with a reduced deuterium content and the meat food produced with its use was established. It was manifested in a decrease of glucose level in the urea of the animals from the experimental groups compared to the control group on the 5th day of disease modeling and normalization on the 17th day of modeling. This experimentally demonstrated the possibility to use deuterium-depleted water in a meat product composition intended for nutrition of people with an impairment of carbohydrate metabolism for correction of metabolic processes.

Keywords:deuterium-depleted water, laboratory animals, alloxan diabetes, semi-prepared meat products, glucosuria, ketonuria

Вопр. питания. 2017. Т. 86. № 1. С. 64-71.

Сахарный диабет продолжает оставаться одной из наиболее значимых медико-социальных проблем мирового здравоохранения, ежегодно число заболев­ших увеличивается на 5-7%, удваиваясь за 15-17 лет. Главным принципом диетического питания при этой патологии является направленность на нормализацию метаболических нарушений. Основными показателями, свидетельствующими о состоянии компенсации при сахарном диабете, являются нормальные величины глюкозы крови натощак и в течение суток, а также отсутствие глюкозы в моче [1, 2]. Помимо гипергликемии заболевание проявляется глюкозурией и полиурией на фоне полидипсии, нарушениями жирового, белкового и минерального обмена и развитием осложнений. При диабете происходит усиленный кетогенез и наблюдает­ся положительная реакция на кетоновые тела, при этом существует корреляция между высокими уровнями глю­козы в крови и кетонами. Чем выше уровень глюкозы, тем вероятнее наличие кетонов.

Известны данные о влиянии воды с модифицирован­ным изотопным составом со сниженным содержанием дейтерия (легкая вода) на нормализацию процессов обмена, в том числе у людей, страдающих сахарным диабетом [3]. Положительный эффект от применения легкой воды заключается в нормализации углеводного и липидного обмена, проницаемости клеточных и лизосомальных мембран за счет улучшения работы различ­ных ферментных систем, в том числе отвечающих за транспорт ионов, глюкозы и инсулина в клетку. Легкая вода позволяет улучшить работу клеточных рецепторов и транспорт глюкозы в клетку за счет разблокирования части рецепторов и увеличения проницаемости клеточ­ных мембран для глюкозы. Это приводит к улучшению работы энергетических цепей в клетке, в том числе к увеличению уровня аденозинтрифосфата в мито­хондриях, следствием чего является снижение уровня глюкозы в крови, уменьшение глюкозурии, улучшение обменных процессов.

Облегченная по дейтерию вода в условиях формиро­вания в организме окислительного стресса способна приводить к уменьшению интоксикации и повышению антиоксидантного потенциала органов и тканей [4-6]. Введение в пищевой рацион легкой воды может уско­рять реакции изотопного обмена, стимулируя органы функциональной системы детоксикации (печень, почки) за счет влияния на термодинамические и термокинети­ческие показатели макромолекул (прежде всего белков, нуклеиновых кислот), изменяя скорость биохимических процессов в клетке [7, 8].

Мясные продукты, характеризующиеся высоким со­держанием животного белка с полным спектром неза­менимых и заменимых аминокислот, жирорастворимых витаминов и L-карнитина и отсутствием углеводов, должны присутствовать в рационе людей с наруше­ниями углеводного обмена. В то же время они имеют достаточно высокое содержание жира с преобладанием насыщенных жирных кислот и холестерина, а также калорийность, что может приводить к увеличению со­держания липидов в крови и прогрессированию забо­левания [9].

Цель работы - изучение влияния воды с пониженным содержанием дейтерия и мясных полуфабрикатов, из­готовленных c ее добавлением и предназначенных для оптимизации питания лиц с нарушением углеводного обмена, на показатели лабораторных животных с моде­лью аллоксанового диабета.

Материал и методы

Для проведения эксперимента в условиях экспери­ментального стенда ФГБНУ "Всероссийский научно-исследовательский институт мясной промышленности им. В.М. Горбатова" был выработан образец готовых мясных рубленых полуфабрикатов из модельного фарша с добавлением воды с пониженным содержанием дейте­рия (исходная концентрация дейтерия - 40 мг/л), которую получали на установке, разработанной в Кубанском го­сударственном университете [10].

Модельный фарш состоял из говядины (70%), рисовой муки (6%), изолята соевого белка (2,5%) и воды (21,5%). Изготовленные полуфабрикаты были доведены до ку­линарной готовности запеканием в пароконвектомате (UNOX XVC 205E, Италия) при 180°С в течение 15 мин. Готовность фиксировали при помощи температурного датчика, помещенного в центр продукта.

Данные о пищевой и биологической ценности полу­фабрикатов приведены в табл. 1.

Для исследования биокорригирующих свойств воды с пониженным содержанием дейтерия и мясных по­луфабрикатов, изготовленных с ее использованием, эксперимент проводили на крысах-самцах стока Вистар (n=36) с исходной массой тела 220±20 г, из которых было сформировано 4 группы:

1-я группа состояла из животных, в изокалорийный рацион которых вводили мясные рубленые полу­фабрикаты, приготовленные с использованием воды с пониженным содержанием дейтерия взамен части рациона в количестве 50% по содержанию белка (n=10).

2-я группа - животные, потреблявшие на протяже­нии всего эксперимента стандартный рацион вивария, в качестве питьевого компонента - воду с пониженным содержанием дейтерия (n=10);

3-я группа - животные, содержащиеся на стандартном рационе вивария, на протяжении всего эксперимента потреблявшие в качестве питьевого компонента очи­щенную водопроводную воду (n=10);

4-я группа - животные, содержащиеся на стандартном рационе вивария, на протяжении всего эксперимента потреблявшие очищенную водопроводную воду (интактная) (n=6).

Эксперимент был разделен на 3 этапа, на протяжении всего эксперимента животные потребляли исследуе­мые образцы в соответствии с вышепредставленной схемой.

I этап протяженностью 16 сут заключался в адаптации к рационам опытных животных 1-й и 2-й групп.

На II этапе длительностью 7 сут животным 1-й, 2-й и 3-й групп проводили моделирование аллоксанового диабета путем однократного внутрибрюшинного введе­ния аллоксана 1-водного ("Диаэм", РФ) в дозе 12 мг на 100 г массы тела [11-15].

III этап (длительностью 20 сут) заключался в изучении диетотерапевтического действия исследуемых образ­цов - воды с пониженным содержанием дейтерия и изго­товленных на их основе полуфабрикатов.

Все животные в группах содержались в сходных ус­ловиях при температуре 23±3 °С, влажности 45±5%, освещение - режим день/ночь: с 7.00 до 19.00. Рацион животных всех групп был сбалансирован по белку. В качестве стандартного рациона использовали концен­трированный комбикорм по ГОСТ Р 50258 (ООО "Лабораторкорм", РФ), содержание белка - 19%, жира - 5%, клетчатки - 4% (295 ккал/ 100 г).

На протяжении всего эксперимента вели наблюде­ние за состоянием животных (поедаемостью корма и потреблением воды, поведением, состоянием шерст­ного покрова и слизистых оболочек, физической ак­тивностью), уделяя особое внимание животным на II этапе эксперимента. Каждые 3-и сутки живот­ных взвешивали с помощью электронных техничес­ких весов Ohaus ("AdventurerPro", США) с точностью ±0,1 г, по результатам взвешиваний рассчитывали рацион.

На протяжении эксперимента проводили исследова­ния мочи на автоматическом анализаторе CL-50 ("HTI", США), используя тест-полоски UrineRS H10 ("HTI", США).

Продолжительность всего эксперимента составила 42 сут.

Животных выводили из эксперимента с помощью камеры для эвтаназии углекислым газом ("VetTech", Великобритания). После чего у животных из правого желудочка сердца отбирали кровь на общее клини­ческое и биохимическое исследования. Проводили патологоанатомическое вскрытие животных, макро­скопически оценивали состояние внутренних органов, определяли абсолютную массу печени, почек, селезен­ки, сердца путем взвешивания на электронных весах ("AcculabVicon", США) с точностью ±0,001 г, после чего рассчитывали относительную массу внутренних органов (в процентах от общей массы тела животного).

Общее клиническое исследование проб цельной крови проводили на полностью автоматическом гема­тологическом анализаторе Abacus junior vet 2.7 ("Diatron Messtechnik GmbH", Австрия), используя наборы реакти­вов компании "Diatron". В крови животных определяли 18 показателей. Биохимические показатели сыворотки крови определяли на автоматическом биохимическом анализаторе BioChem FS 360 ("HTI", США), используя наборы реактивов ("HighTechnology", США).

Для расчетов использовали программу Statistica 10. Результаты представлены в виде: взвешенное среднее значение ± стандартное отклонение. Статистическую достоверность рассчитывали с применением однопараметрического ANOVA-теста с применением критерия Дункана, в качестве значимого уровня выбрана вероят­ность 0,05.

Результаты и обсуждение

В течение всего эксперимента сохранность живот­ных была 100%. Поедаемость исследуемых мясных рубленых полуфабрикатов была полная. Наблюде­ния за животными не выявили никаких отклонений от нормы в физиологическом состоянии на I этапе экс­перимента - состояние животных находилось в пре­делах физиологической нормы. Крысы были подвиж­ны и активны; мышцы в тонусе; тактильная реакция сохранена; шерсть плотно прилегает к телу, невзъерошенная, гладкая, чистая, блестящая, кожный пок­ров эластичный, без нарушения целостности; видимые слизистые оболочки бледно-розового цвета, истече­ний и других признаков воспалительных реакций нет. Глаза ярко-красного цвета. Акты мочеиспускания и дефекации находились в пределах физиологической нормы.

При моделировании сахарного диабета, начиная со 2-х суток после введения аллоксана, было отмечено снижение двигательной активности, первичная поли­дипсия и полифагия.

Известно, что после введения аллоксана содержа­ние глюкозы в крови повышается, через 24-36 ч после начала эксперимента у подопытных крыс развива­ются все симптомы заболевания: глюкозурия, гипер­гликемия, полидипсия, полифагия и полиурия, через 30-45 дней повышается гематокрит, время свертывания крови и лимфы у крыс сокращается, а их вязкость повы­шается. В это же время у крыс появляется глюкозурия, приводящая к усиленному мочеотделению и как следс­твие к уменьшению плазменной части крови и сгущению крови. У крыс c аллоксановым диабетом содержание общего белка в лимфе и плазме крови снижается, повы­шается активность ферментов аспартатаминотрансферазы (АСТ) и аланинаминотрансферазы (АЛТ). Данные показатели свидетельствуют об активации цитолитических процессов в печени и поджелудочной железе животных [16-17].

Наблюдение за динамикой изменения массы тела лабораторных животных в ходе эксперимента (рис. 1) показало, что на I этапе животные всех групп, в том числе крысы опытных 1-й и 2-й групп, увеличи­вали вес в среднем от 2 до 7 г/сут начиная с 1-х суток. На этапе моделирования аллоксанового диабета у животных 1-3-й групп отмечена выраженная потеря массы тела, наиболее интенсивно она снижалась у крыс 2-й группы, потреблявших воду с пониженным содер­жанием дейтерия. При наблюдении за животными на III этапе эксперимента была выявлена стабилизация массы тела у животных 1-й и 2-й групп, при этом у крыс 2-й группы, которым спаивали воду с пониженным со­держанием дейтерия, отмечалось менее выраженное увеличение массы тела.

Прибавка массы тела животных на I этапе (17 сут) составили: в 1-й группе крыс, потреблявших образцы мясных продуктов, - 61,2%, у животных 2-й группы, потреблявших воду с пониженным содержанием дейте­рия, - 54,3%, у животных 3-й и 4-й групп - 61,3 и 59,9% соответственно. На II этапе (7 сут) прирост массы тела животных составил: в 1-й группе животных - 1,3%, у жи­вотных 2-й группы - -0,2%, у животных 3-й группы - 0,1%, у интактных животных 4-й группы - 9,4%. Прибавка массы тела животных на III этапе (20 сут) составила у жи­вотных 1-й и 2-й групп - 17,6 и 16,2%, 3-й группы - 16,0%, у интактных животных 4-й группы - 20,7%.

Снижение массы тела животных объясняется разви­тием диабетического состояния - нарушением водно-минерального обмена и преобладанием катаболических реакций над анаболическими. Более выраженное снижение массы тела у животных, потреблявших воду с пониженным содержанием дейтерия, связано со свойст­вами воды - способностью изменять скорость биоката­литических процессов в клетках органов и оказывать некоторое стрессовое воздействие на организм [4].

Сравнительный анализ содержания кетонов и глю­козы в моче показал, что в процессе развития пато­логического состояния изменяются концентрации оце­ниваемых показателей (рис. 2). При этом у животных 1-3-й групп глюкозурия и кетонурия отмечалась уже на 2-е сутки после введения аллоксана (18-е сутки эк­сперимента) - содержание глюкозы в моче достигало 28 ммоль/л, кетонов - до 1,5 ммоль/л соответственно. Стоит отметить, что у животных 3-й группы глюкозурия и кетонурия сохранялась на протяжении всего этапа моделирования, содержание глюкозы у крыс данной группы достигло максимальных значений на 21-е сутки эксперимента (5-е сутки моделирования соответственно).

У животных 1-й группы, потреблявших мясной продукт, глюкозурия сохранялась до 28-х суток (11-е сутки после введения аллоксана), кетонурия - до 34-х (17-е сутки после моделирования). У крыс 2-й группы, потреб­лявших воду с пониженным содержанием дейтерия, на 2-е сутки после введения аллоксана содержание глюкозы в моче составило 2,5 ммоль/л, на 5-е сутки до­стигало 28 ммоль/л. При этом глюкоза в моче животных 2-й группы не детектировалась уже на 7-е сутки после введения аллоксана, кетоны - на 17-е сутки после моде­лирования заболевания соответственно.

Гематологические исследования в конце эксперимента показали, что у животных 3-й группы по отношению к интактным животным (4-я группа) отмечалось уве­личение содержания лейкоцитов за счет лимфоцитов (на 73,8 и 96,0%), смеси моноцитов, эозинофилов, базофилов и незрелых клеток. При этом у 62,5% жи­вотных выявлялся выраженный лейкоцитоз и лимфоцитоз; увеличение однородности популяции эритроцитов (уменьшении ширины распределения эритроцитов) при относительной неизменности концентрации эритроци­тов, гемоглобина, среднего объема эритроцита и сред­него содержания гемоглобина в эритроците на фоне увеличения концентрации тромбоцитов и тромбокрита (до 24% соответственно). У животных 1-й и 2-й групп от­мечалась схожая тенденция, однако менее выраженная: концентрация гранулоцитов, лимфоцитов, тромбоцитов и тромбокрит находилось в пределах физиологических значений (см. табл. 2).

При анализе результатов биохимического исследо­вания сыворотки крови в конце эксперимента (табл. 3) у животных 1-3-й групп выявлена гипергликемия, наи­более выраженная у крыс 3-й группы (у 37,5% живот­ных концентрация глюкозы в сыворотке крови дости­гала 14,5 ммоль/л). Уровень глюкозы у животных 1-й и 2-й групп был выше показателей интактных животных на 38% и соответствовали верхней границе физиоло­гической нормы. Полученные результаты коррелируют с данными литературы: при моделировании аллоксанового диабета максимальный уровень гипергликемии отмечается на 3-4-е сутки после введения аллоксана, совпадая по срокам с разрушением 70-80% β-клеток островков Лангерганса, а уже на 9-е сутки начала моде­лирования концентрация глюкозы в крови опытных жи­вотных снижается ввиду способности β-клеток подже­лудочной железы крыс и мышей восстанавливать свою численность и структурно-функциональное состояние при аллоксановом диабете [19].

У животных 1-3-й групп отмечено повышение уровня мочевины, креатинина, активности щелочной фосфатазы, АЛТ и АСТ, что свидетельствует об усилении глюконеогенеза, характерного для развития диабети­ческого состояния, и активации цитолитических про­цессов в печени и поджелудочной железе животных (см. табл. 3).

Таким образом, по результатам эксперимента можно отметить следующее. У животных опытных групп (мо­дель аллоксанового диабета) отмечались признаки вос­палительного процесса. Результаты клинического ана­лиза крови в конце эксперимента отражали повышение содержания лейкоцитов, лимфоцитов, моноцитов. Для остальных показателей выявлены колебания в пределах их биологической вариабельности. Введение в рацион животных с моделью диабета в качестве питьевого ком­понента воды с пониженным содержанием дейтерия как на I, так и на II этапе эксперимента не оказало сущест­венного влияния на показатели крови.

Установлено положительное воздействие воды с по­ниженным содержанием дейтерия и мясного продукта, изготовленного с ее применением, на организм лабо­раторных животных. Протекторное воздействие воды с пониженным содержанием дейтерия, в том числе в составе мясного продукта, на организм лаборатор­ных животных проявляется в снижении глюкозурии на 5-е сутки моделирования заболевания и нормализа­ции содержания в моче глюкозы и кетонов на 17-е сутки после введения аллоксана, что, по-видимому, свиде­тельствует о возможности применения легкой воды для коррекции метаболических процессов людей с наруше­нием углеводного обмена.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда, проект № 15-16-00008.

Литература

1. Мирошниченко Л.А., Золоедов В.И., Волынкина А.П., Кулакова С.И. Влияние диетотерапии с использованием подсолнечного масла и масла амаранта на показатели иммунной реактивности у больных сахарным диабетом типа 2 // Вопр. питания. 2009. Т. 78, № 4. С. 30-36.

2. Балаболкин М. И. Патогенез и механизм развития ангиопатий при сахарном диабете // Кардиология. 2000. № 10. С. 74-87.

3. Тимаков А.А., Турова Е.А., Головач А.В., Акимов Б.К. Способ лече­ния больных сахарным диабетом. Пат. РФ № 2270017. Опубл. 20.02.2006. Заявка № 2004120854/14.

4. Лисицын А.Б., Барышев М.Г., Басов А.А., Барышева Е.В., Быков И.М., Дыдыкин А.С. и др. Воздействие воды со сниженным содержа­нием дейтерия на организм лабораторных животных при раз­личном функциональном состоянии неспецифических защит­ных систем // Биофизика. 2014. Т. 59, № 4. С. 757-765.

5. Джимак С.С., Басов А.А., Барышев М.Г. Распределение дейтерия в биологических жидкостях и внутренних органах: влияние воды с пониженным содержанием дейтерия на градиент D/H и процессы адаптации // Докл. АН. 2015. Т. 465, № 2. С. 245-248.

6. Джимак С.С., Басов А.А., Федулова Л.В., Дыдыкин А.С., Быков И.М., Арцыбашева О.М. и др. Коррекция метаболических процессов у крыс при хроническом эндотоксикозе с помощью реакций изотопного (D/H) обмена // Известия РАН. Сер. биол. 2015. № 5. С. 518-527.

7. Басов А.А., Быков И.М., Барышев М.Г., Джимак С.С., Быков М.И. Концентрация дейтерия в пищевых продуктах и влияние воды с модифицированным изотопным составом на показатели свободнорадикального окисления и содержание тяжелых изотопов водорода у экспериментальных животных // Вопр. питания. 2014. Т. 83, № 5. С. 43-50.

8. Джимак С.С., Барышев М.Г., Басов А.А., Тимаков А.А. Влияние воды со сниженным содержанием дейтерия на изотопный состав лиофилизированных тканей и морфофункциональные показатели организма у крыс из разных поколений // Биофизи­ка. 2014. Т. 59, вып. 4. С. 749-756.

9. Деревицкая О.К., Солдатова Н.Е. Проектирование состава мясных полуфабрикатов для функционального питания при диабете // Мясная индустрия. 2015. № 2. С. 33-35 .

10. Фролов В.Ю., Барышев М.Г., Болотин С.Н., Джимак С.С. Способ получения биологически активной питьевой воды с понижен­ным содержанием дейтерия. Пат. РФ № 2438765 с приоритетом от 25.05.2010. Опубл. 10.01.2012. Заявка № 2010121324/05

11. Миронов А.Н., Бунатян Н.Д. Руководство по проведению докли­нических исследований лекарственных средств. Ч. 1. М. : Гриф и К, 2012. 944 с.

12. Корженевский Д.А., Селищева А.А., Савельев С.В. Определение содержания эндогенного аллоксана в крови человека// Биомед. химия. 2009. Т. 55, вып. 3. С. 343-349.

13. Волчегорский И.А., Рассохина Л.М., Мирошниченко И.Ю. Антиоксиданты при экспериментальном сахарном диабете // Пробл. эндокринол. 2008. Т. 54, № 5. С. 43-50.

14. Баранов В.Г, Соколоверова И.М., Гаспарян Э.Г. и др. Эксперимен­тальный сахарный диабет. Роль в клинической диабетологии. Л. : Медицина, 1983. 240 с.

15. Гати Моханнад, Федорин Д.Н., Полякова-Семенова Н.Д. Физиолого-биохимические аспекты адаптации крыс к условиям аллоксанового диабета // Фундам. исслед. 2013. № 11-3. С. 465-469.

16. Черкасова О.П., Кузнецова Н.В., Пальчикова Н.А., Селятицкая В.Г. Активность адренокортикальной системы при эксперименталь­ном диабете у крыс // Экспер. диабетол. 2011. № 2. С. 37-40.

17. Демченко Г.А., Булекбаева Л.Э., Абдрешов С.Н., Балхыбекова А.О. Функциональное состояние лимфатической системы при экспе­риментальном диабете // Соврем. наукоемкие технологии. 2010. № 2. С. 82-84.

18. Evans G.O., George A. Animal Clinical Chemistry: A Practical Handbook for Toxicologists and Biomedical Researchers. 2nd ed. UK : CRC Press, 2009. 368 р.

19. Золотарева С.Н., Мубаракшина О.А. Окислительный стресс и антиоксидантный статус при экспериментальном аллоксановом диабете // Материалы Международной научно-практи­ческой конференции "Свободные радикалы, антиоксиданты и здоровье животных". Воронеж, 2002. С. 47-52.