Influence of nanosized amorphous silica on assimilation of vitamins B1, B2 and B6 in rats

Abstract

Amorphous silica (SiO2) in the form of nanoparticles (NPs) is widely used as a food additive E551 in many enriched foods and food supplements. The aim of this study was to evaluate the effect of oral administration of SiO2 NPs on assimilation and metabolism of vitamins B1, B2 and B6 in laboratory rats. Amorphous SiO2 «Orisil-300 ®» was used with the size of the primary NPs 20-60 nm according to the electronic, atomic force microscopy and dynamic light scattering. The experiment was conducted on 8 groups of growing male Wistar rats (with initial body weight 70-80g) number, respectively, 7, 7, 10, 10, 12, 12, 14 and 16 animals. Animals of the 1st, 3rd, 4th and 5th groups received through­out the experiment balanced semi-synthetic diet. Animals of the 2nd group received a diet depleted of vitamins B1, B2 and B6 until day 21; animals of the 6th, 7th and 8th groups -the same diet from the 1st to the 21th day, and then, before the closure of the experiment, the diet provided with the indicated B vitamins at 100% of normal level. From day 22 of experiment and until the end at day 29 the animals of the 3rd and 6th groups received deionized water (placebo) through intragastric gavage; rat of the 4th and 7th groups -aqueous suspension of SiO2 dose of 1 mg/kg body weight /day, and the 5th and 8th group -100 mg/kg/day. Urinary excretion of thiamine, riboflavin, 4-pyridoxilic acid and liver and brain content of vitamins B1 and B2 (after acid and enzyme hydrolysis) were deter­mined by fluorimetric methods. It was found that rats in group 2 lagged in weight gain at day 21 significantly compared to group 1, and developed a marked deficiency of vitamins B1, B2 and B6 according to studied safety parameters. In groups from 6 to 8 at day 29 par­tial recovery was achieved in vitamin status. Administration of SiO2 to animal of groups 4 and 5, with normal consumption of B vitamins, had no significant effect on any param­eters of vitamin status in comparison to group 3. However, intragastric administration of SiO2 led in animals of groups 7 and 8 to an increase in the urinary excretion of vitamins B1 and B2 and lowering of their content in liver as compared to group 6. Administration of SiO2 had no effect on indices of vitamin B6 sufficiency. Possible reasons are discussed for the adverse lowering impact of SiO2 NPs on the availability of vitamins B1 and B2 and their increased clearance from the body.

Keywords:silica, nanoparticles, food additives, vitamin В1, vitamin В2, vitamin В6, safety, risk

Вопр. питания. 2016. № 6. С. 72-79.

Наноразмерный аморфный диоксид кремния (SiO2), известный под торговыми марками "Аэросил", "Орисил" и др., используется в качестве пищевой добавки Е551. Спецификация JECFA на данную пище­вую добавку не содержит прямых указаний на размер ее частиц [1], вследствие чего природа данного ком­понента как наноматериала часто не декларируется изготовителем продукции. Согласно ТР ТС 029/2012 "Требования безопасности пищевых добавок, аро­матизаторов и технологических вспомогательных средств" допускается использование Е551 в соста­ве таких видов пищевой продукции, как пряности (не более 30 г/кг), продукты, плотно обернутые фоль­гой (30 г/кг), продукты сухие порошкообразные, вклю­чая сахарную пудру (10 г/кг), сыры и их заменители (10 г/кг), соль и ее заменители (10 г/кг), ароматизаторы (50 г/кг), детские смеси (до 10 мг/кг), сухие инстантные каши для питания детей (до 2 г/кг). Аморфный SiO2 используется также в качестве вспомогательного компонента в большом числе биологически активных добавок к пище (БАД). Биологические свойства наночастиц (НЧ) SiO2, содержащихся в этой продукции, в настоящее время недостаточно изучены; имеются данные об их возможной токсичности при приеме с пищей [2-4].

Поскольку наноразмерный SiO2 имеет большую удель­ную площадь поверхности (более 175 м2/г, типично 300 или 380 м2/г, согласно ГОСТ 14922-77), для него характерна высокая адсорбционная способность в рас­чете на единицу массы. С учетом весьма низкой вса­сываемости НЧ SiO2 в кишке это создает возможность эффекта снижения биодоступности ряда микронутриентов в процессе их переваривания и всасывания за счет их адсорбции на этих НЧ. В частности это может быть характерно для водорастворимых витаминов группы В, присутствующих в БАД в свободном виде.

Целью данного исследования является оценка вли­яния наноразмерного аморфного SiO2 на усвояемость и показатели обмена витаминов В1, В2 и В6 при совмест­ном введении лабораторным крысам на фоне адекват­ной обеспеченности организма и при их сочетанном дефиците.

Материал и методы

В работе использован химически чистый SiO2 амор­фный пирогенный "Орисил-300" с частицами нанометрового размера, удельной площадью поверхности 300 м2/г, соответствующий ГОСТ 14922-77. Продукт представлял собой рыхлый белый порошок, легко дис­пергируемый в воде под действием ультразвука с образованием стабильного прозрачного опалесцирующего коллоидного раствора. Характеристика этой формы SiO2 как наноматериала методами трансмиссионной элек­тронной и атомно-силовой микроскопии, спектроакустики и динамического лазерного светорассеяния была дана ранее [5].

В эксперименте использованы всего 88 растущих крыс-самцов линии Вистар c исходной массой тела 70-80 г, полученных из питомника "Столбовая". Живот­ные были разделены на 8 групп (1-8-я группы) общей численностью соответственно 7, 7, 10, 10, 12, 12, 14 и 16 особей.

Крыс содержали по 3 особи в клетке из полипропи­лена при 12/12-часовом режиме освещения и неограни­ченном доступе к воде. Животные 1, 3, 4 и 5-й групп на протяжении всего эксперимента получали сбалансиро­ванный полусинтетический рацион, соответствующий AIN-76. Животные 2-й группы получали с 1-х суток и до выведения из эксперимента такой же рацион, из кото­рого были исключены витамины В1 (в форме тиамин-пирофосфата), В2 (рибофлавин) и В6 (пиридоксин гид­рохлорид); животные 6, 7 и 8-й групп - такой же рацион с 1-х по 21-е сутки опыта, а далее, до выведения из эк­сперимента, рацион, снабженный указанными формами витаминов группы В до 100% от нормы [6]. Доза каждого из трех витаминов группы В при этом составила 6,75 мг на 1 кг массы сухих веществ рациона.

Начиная с 22-х суток опыта и до выведения из экс­перимента животные 3-й и 6-й групп получали внутрижелудочно через зонд деионизованную воду (плацебо), крысы 4-й и 7-й групп - водную суспензию SiO2, обрабо­танную ультразвуком (частота - 44 кГц, время - 5 мин, мощность - 2 Вт/см3, температура +2 оС) в дозе 1 мг на 1 кг массы тела в сутки в расчете на SiO2, а крысы 5-й и 8-й групп - такую же суспензию в дозе 100 мг/кг в сутки. В ходе эксперимента крыс ежесуточно взве­шивали на электронных весах с точностью ±1 г, фик­сировали заболеваемость, летальность, внешний вид, активность, состояние шерстяного покрова, стула, осо­бенности поведения.

Животных 1-й и 2-й групп выводили из эксперимента на 22-е сутки опыта, а 3-8-й групп - на 29-е сутки путем обескровливания под эфирной анестезией. За 1 сут до этого проводили сбор суточной мочи в обменных клет­ках. Отбирали образцы ткани печени для определения содержания витаминов. Массу внутренних органов оп­ределяли на аналитических весах с точностью ±0,1 г.

Содержание в моче тиамина [7], рибофлавина и 4-пиридоксиловой кислоты (4-ПК) [8] определяли флуориметрически. Содержание в печени и головном мозге витаминов В1 и В2 после проведения кислотно-ферментативного гидролиза определяли флуориметрически согласно [9].

Статистическая обработка результатов измерений включала построение вариационного ряда, расчет вы­борочного среднего (М), стандартной ошибки (m), проверку гипотезы о совпадении выборочных средних с использованием t-критерия Стьюдента, гипотезы об однородности распределения с использованием кри­терия one-way ANOVA, гипотезы о совпадении распре­деления выборок по группам с помощью непараметри­ческого критерия Манна-Уитни. Различия принимали достоверными на уровне значимости р<0,05.

Результаты и обсуждение

Как следует из данных рис. 1 и 2, к 22-м суткам пре­бывания животных 2-й группы на рационе с исключени­ем витаминов В1, В2 и В6 у них развивались признаки дефицита этих витаминов, состоящие в достоверном (Р1-2<0,05) отставании в прибавке массы тела от жи­вотных 1-й группы, снижении экскреции рибофлавина и 4-пиридоксиловой кислоты (4-ПК) с мочой, содер­жания витамина В1 в печени, витаминов В1 и В2 в го­ловном мозге. Помимо этого у животных 2-й группы по сравнению с крысами 1-й группы отмечались дис­пропорции в относительной массе печени (1-я группа -3,52±0,20%, 2-я группа - 4,23±0,19%), почек (0,92±0,05 и 0,75±0,02% соответственно) и головного мозга (1,29±0,06 и 0,98±0,04% соответственно); р1-2<0,05 во всех случаях. Таким образом, пребывание крыс на рационе с исключением 3 витаминов группы В приводило в течение 21 сут к развитию выраженных симптомов их недостаточности (дефицита).

Как следует из данных рис. 3, крысы 6-8-й групп, также получавшие в течение 21 сут витаминдефицитный рацион, характеризовались таким же отставанием в прибавке массы от животных с 3-й по 5-ю группу, что и крысы 1-й группы от 2-й группы. Однако дальнейшее введение им на протяжении 7 сут добавки этих витами­нов приводило к быстрому увеличению скорости роста. Тем не менее отставание в массе тела от животных групп, получавших сбалансированный рацион, сохра­нялось (р3_6;4_7;5_8<0,05 на 8, 15, 21 и 28-е сутки опыта). Помимо этого, у животных 6 -8-й групп по сравнению с крысами 3-5-й групп к 29-м суткам сохранялись дис­пропорции в массе печени, почек и головного мозга, аналогичные тем, что имели место у животных 2-й груп­пы по сравнению с крысами 1-й группы (p3_6;4_7;5_8 в<0,05 на 29-е сутки опыта).

На рис. 4 и 5 приведены показатели, характеризую­щие состояние обмена витаминов группы В (экскреция с мочой и содержание в печени) у крыс с 3-й по 8-ю группу по завершении эксперимента, в зависимости от дозы потребляемого SiO2. Как видно из представлен­ных данных, введение SiO2 животным 4-й и 5-й групп, нормально обеспеченным витаминами группы В на протяжении всего эксперимента, не оказывало досто­верного влияния ни на один из изученных показателей витаминной обеспеченности по сравнению с животны­ми 3-й группы, получавшими путем зондового введения плацебо (деионизованную воду). В отличие от этого у животных 7-й и 8-й групп, которые испытывали де­фицит витаминов группы В в первые 21 сут, а далее получали их в количестве около 100% от нормы, внутрижелудочное введение SiO2 приводило к достоверным сдвигам в показателях витаминной обеспеченности по сравнению с крысами 6-й группы, находившимися на том же рационе, но получавшими внутрижелудочно плацебо. В случае витамина В1 отмечалось достовер­ное усиление его экскреции с мочой как при низкой, так и при высокой дозе вводимого наноматериала (p6-7,7-8<0,05) и достоверное снижение его содержания в печени при высокой дозе SiO2 (p6-8<0,05). Такая же картина наблюдается и для экскреции и содержания в печени витамина В2, за исключением того, что при низкой дозе наноматериала увеличение его экскреции оказывается недостоверным. На показатель обеспе­ченности витамином В6 (экскреция 4-ПК) внутрижелудочное введение SiO2 достоверного воздействия не оказывало. Не выявлено также никакого влияния приема SiO2 на содержание витаминов В1 и В2 в головном мозге, независимо от типа применявшегося рациона (данные не показаны).

Как следует из результатов эксперимента, внутри-желудочное введение крысам наноразмерного SiO2 приводит к таким изменениям показателей обеспе­ченности и экскреции витаминов В1 и В2, которые можно интерпретировать как повышенное вымывание этих витаминов из организма на фоне пищевого вос­становления их предварительно нарушенной обеспе­ченности. Предположение о том, что наноразмерный SiO2 препятствует кишечной абсорбции этих нутриентов, не подтверждается полученными эксперимен­тальными данными, поскольку в этом случае, напро­тив, следовало бы ожидать, снижения их экскреции с мочой. Одним из объяснений данного явления может быть токсическое действие НЧ SiO2 на почки животных, следствием чего могла стать нарушенная реабсорбция обоих витаминов в почечных канальцах. Сочетание увеличенной экскреции витаминов группы В с мочой и сниженных системных показателей их обеспечен­ности ранее наблюдали у детей с дисметаболическими нефропатиями [10]. Однако в случае с животными, подвергнутыми пероральному воздействию наноразмерного SiO2, токсическое воздействие на почки, по-видимому, маловероятно ввиду отсутствия изменений в интегральных показателях (массе органа) и марги­нальных, находящихся в пределах нормы для животных данной линии, пола и возраста, сдвигах в показате­лях уровня мочевины, мочевой кислоты и креатинина в крови при дозе наноматериала вплоть до 100 мг на 1 кг массы тела [5, 11]. В работе [2] не установлено гистопатологических изменений в почках крыс, получавших НЧ аморфного SiO2 в течение 84 сут в очень высоких дозах (до 2500 мг на 1 кг массы тела).

Альтернативное объяснение выявленных эффектов может состоять в ускорении процессов обмена вита­минов группы В на системном уровне у животных, получавших наноразмерный SiO2. Согласно имеющимся в литературе данным [2], небольшие количества НЧ аморфного SiO2, поступающего с пищей, могут вса­сываться в кишечнике и накапливаться во внутренних органах, в частности в печени. Как показали дан­ные подострого 92-суточного эксперимента по включению аморфного наноразмерного SiO2 в рацион крыс, этот компонент мог оказывать системное токсичес­кое воздействие на организм, маркерами которого являлись общее содержание цитохрома Р450 печени, активности некоторых его изоформ, а также глутатионтрансферазы и лизосомальных арилсульфатаз [11]. Наблюдались сдвиги в состоянии Т-клеточного звена иммунитета, состоящие в повышении числа цитотоксических Т-клеток при снижении количества Т-хелперов, резком возрастании продукции фактора некроза опухолей α [4]. Последний, как известно, наряду со мно­жеством иммунорегуляторных функций оказывает вы­раженный прямой катаболический эффект в отношении клеток скелетных мышц и жировой ткани [12]. Развитие катаболической реакции может сопровождаться уско­рением процессов окисления углеводов, аминокислот и жирных кислот, что сопровождается функциональным напряжением ферментных систем энергетического об­мена и дыхательной цепи, ключевыми компонентами которых являются тиаминзависимые ферменты и флавиновые оксидоредуктазы. Следствием этого может быть интенсификация метаболизма витаминов В1 и В2, что отражается в снижении их стационарного уровня в печени и усилением их вымывания из организма. При­мечательно, что эти эффекты наглядно проявляются у животных с нестабильным уровнем обеспеченности этими витаминами на фоне их алиментарного восста­новления после развившегося дефицита, но не у крыс, нормально обеспеченных ими на протяжении всего эксперимента.

Что же касается отсутствия увеличения экскреции 4-ПК у животных, получавших SiO2, это может быть следстви­ем повышенного в 7-й и 8-й группах выведения из орга­низма рибофлавина, что приводило к относительному ухудшению обеспеченности витамином В2 по сравнению с 6-й группой, получавшей плацебо. Известно, что коферментные формы витамина В2 участвуют в метаболизме пиридоксина. В частности ФМН-зависимая пиридоксам ин(пиридоксин)фосфатоксидаза превращает пиридоксамин в пиридоксальфосфат, ФАД-зависимая альдегидоксидаза окисляет пиридоксаль до 4-ПК, экскретируемой с мочой. Ранее подобный эффект у крыс наблюдали при алиментарном дефиците витамина В2 [13-15].

Таким образом, показатели, характеризующие обмен витаминов В1 и В2 в организме, являются чувстви­тельными маркерами токсического действия НЧ SiO2 в условиях развивающегося дефицита и последующего алиментарного восстановления обеспеченности орга­низма этими витаминами. Потребление НЧ SiO2 приводит к снижению показателей обеспеченности витамина­ми В1 и В2 и усилением их вымывания из организма. С учетом известных данных о том, что дефицит вита­минов группы В, в частности рибофлавина, может по­вышать чувствительность организма к разнообразным токсическим воздействиям [16], поступление с пищей НЧ SiO2 на фоне этого алиментарного дефицита может рассматриваться как источник агрегированного риска здоровью.

Литература

1. Silicon Dioxide, Amorphous. Rome : JECFA, 1973-1992. 2 p. URL: http://www.fao.org/food/food-safety-quality/scientific-advice/jecfa/jecfa-additives/en/.

2. Van der Zande M., Vandebriel R.J., Groot M.J., Kramer E. et al. Subchronic toxicity study in rats orally exposed to nanostructured silica // Part. Fibre Toxicol. 2014. Vol. 11. P. 8.

3. Зайцева Н.В., Землянова М.А., Звездин В.Н., Саенко Е.В. Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности водной суспензии нанодисперсного диоксида кремния, синтезированного мето­дом жидкокристаллического темплатирования // Анализ риска здоровью. 2013. № 1. С. 65-72.

4. Шумакова А.А., Ефимочкина Н.Р., Минаева Л.П., Быкова И.Б. и др. Токсикологическая оценка наноструктурного диоксида кремния. III. Микроэкологические, гематологические показатели, состояние системы иммунитета // Вопр. питания. 2015. Т. 84, № 4. С. 55-65.

5. Шумакова А.А., Арианова Е.А., Шипелин В.А., Сидорова Ю.С. и др. Токсикологическая оценка наноструктурного диоксида кремния. I. Интегральные показатели, аддукты ДНК, уровень тиоловых соединений и апоптоз клеток печени // Вопр. питания. 2014. Т. 83, № 3. С. 52-62.

6. Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Бекетова Н.А., Кошелева О.В. и др. Эффективность разных доз витаминов для коррекции полигиповитаминоза у крыс // Бюл. экспер. биол. 2014. Т. 157, № 5. С. 626-629.

7. Коденцова В.М., Сокольников А.А. Исаева В.А. Сравнительная оценка биохимических критериев обеспеченности организма тиамином // Вопр. мед. химии. 1993. Т. 39, № 3. С. 50-53.

8. Спиричев В.Б., Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Бекетова Н.А. и др. Методы оценки витаминной обеспеченности населения. М. : ПКЦ "Альтекс", 2001. 68 с.

9. Вржесинская О.А., Коденцова В.М., Спиричев В.Б, Алексеева И.А. и др. Оценка рибофлавинового статуса организма с помощью различных биохимических методов // Вопр. питания. 1994. Т. 63, № 6. С. 9-12.

10. Гордеева Е.А., Вржесинская О.А., Коденцова В.М., Харитончик Л.А. и др. Обеспеченность витаминами В2 и В6 детей с дизметаболическими нефропатиями: патогенетическая роль дефицита // Вопр. соврем. педиатрии. 2004. Т. 3, № 6. С. 32-34.

11. Шумакова А.А., Авреньева Л.И., Гусева Г.В., Кравченко Л.В. и др. Токсикологическая оценка наноструктурного диоксида кремния II. Энзимологические, биохимические показатели, состояние системы антиоксидантной защиты // Вопр. питания. 2014. Т. 83, № 4. С. 58-66.

12. Tisdale M.J. Catabolic mediators of cancer cachexia // Curr. Opin. Support Palliat. Care. 2008. Vol. 2, N 4. P. 256­261.

13. Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Сокольников А.А., Бекетова Н.А. и др. Влияние обеспеченности рибофлавином на обмен водорастворимых витаминов // Вопр. мед. химии. 1993. Т. 39, № 5. С. 29-33.

14. Коденцова В.М., Якушина Л.М., Вржесинская О.А., Бекето­ва Н.А. и др. Влияние обеспеченности рибофлавином на метаболизм витамина В6 // Вопр. питания. 1993. № 5. С. 32­36.

15. Коденцова В.М. Экскреция с мочой витаминов и их метаболитов как критерий обеспеченности витаминами организма чело­века // Вопр. мед. химии. 1992. Т. 38, № 4. С. 33-37.

16. Pussa Т. Principles of Food Toxicology. 2nd ed. Boca Raton; London; New York : CRC Press, 2014. P. 55.