Modification of vitamin-mineral diet composition as a model of adaptive potential reducing in laboratory animals

Abstract

This publication presents the results of research that was aimed at elaboration of adaptive potential reducing model, intended for toxicological experiments. Two series of research (with a duration of 70 days each) were conducted on Wistar rats. In the 1st series five groups of animals received diets with 100, 75,50,25 and 0% of vitamins B1, B2, B3, B6 and minerals(Fe3+ and Mg2+); in the 2nd series four groups of animals received diets with 21.37, 9.94, 4.62, 2.15% of this vitamins and minerals. In the 1st series of studies the intervals of maximum, medium and minimum content of essential nutrients in the diet was established; in the 2nd series the range of the lowest possible concentrations of these elements that provided the lowest level of adaptive potential and not causing the pathology development was determined. The certain set of hematological, biochemical, immunological and other indicators were investigated, this article analyzes the results of zoometric studies, mortality of animals, as well as the results of antioxidant status (activity of superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase, glutathione reductase and malondialdehyde content in red blood cells) studies. Based on the evaluation of the data which were obtained in the 1st series, it follows that a dose reduction of relevant essential nutrients to 25% didn't significantly affect the values of the studied indicators, and the complete elimination of these substances resulted in massive death of animals. In the 2nd series a significant differences between the groups were observed from the range of increased mortality (groups with 2.15 and 4.62% content of essential nutrients) to the range of deviations from central tendency of some parameters (group with 21.37% content). The data allowed to trace the dependence of these differences on the levels of vitamins and minerals in the diet. The results were used to determine threshold values of vitamins and minerals that provided the necessary reduction of the adaptive potential level in male and female rats. Taking into account the risk of pathology development, three dosages of essential substances have been established - optimal, marginal and submarginal, which provide consistent decline of adaptive potential of laboratory animals: 75, 30 and 19% for males and 75, 28 and 18% for females, respectively. The modification of vitamin and mineral composition of the diet can be used as a model of adaptive potential reduce in toxicological research.

Keywords:vitamin deficiency, adaptive potential, vitamin-mineral diet composition, laboratory animals, model experiment

Вопр. питания. 2016. № 6. С. 64-71.

В гигиенических исследованиях для выявления неблагоприятных воздействий на организм широко используются биомаркеры, такие как система антиоксидантной защиты, система ферментов метаболизма ксенобиотиков, ферменты мембран лизосом, иммунная система и др., составляющие основу адаптационного потенциала. При изучении малотоксичных объектов или объектов с неизвестной токсичностью, например новых видов пищевой продукции, полученных в том числе с использованием современных биотехнологий, такие исследования наиболее актуальны и необходимы для выявления возможного неблагоприятного действия анализируемого продукта. Как правило, прямого выра­женного влияния выявить не удается, поэтому одним из дополнительных подходов являются так называемые нагрузочные пробы, направленно снижающие адапта­ционный потенциал [1-3].

Одним из наиболее простых и эффективных способов снижения адаптационного потенциала организма лабораторных животных является модификация состава рациона [1, 2, 4-7]. Состав полусинтетического казе­инового рациона (ПКР), традиционно используемого в исследованиях по оценке безопасности новых видов пищевой продукции, учитывает все физиологические потребности крыс в пищевых веществах и включает в себя казеин, кукурузный крахмал, свиной жир и под­солнечное масло в качестве источников белка, углево­дов и жиров, витаминную и минеральную смеси. Имен­но витаминная и минеральная смеси представляются наиболее простыми и удобными компонентами рациона для формирования необходимых уровней адаптацион­ного потенциала у крыс.

Для целей данного исследования была выбрана мо­дель дефицита минеральных веществ - железа (Fe3+) и магния (Mg2+), и витаминов группы В - тиамина (В1), рибофлавина (В2), ниацина (В3), пиридоксина (В6), био­логическая роль которых определяет состояние адап­тационного потенциала [8-15]. В частности железо входит в состав цитохромов, участвующих в метаболизме ксенобиотиков, а также в состав каталазы - одного из ключевых ферментов системы антиоксидантной за­щиты [16]. Магний, входящий в состав кофакторов более 350 ферментов, регулирует окислительные про­цессы и выработку целого ряда цитокинов и других гуморальных факторов [17, 18], витамины группы В, являющиеся кофакторами оксидоредуктаз, обеспечи­вают энергией все биохимические процессы в организ­ме, в том числе процессы поддержания антиоксидан­тного статуса, составляющего основу адаптационного потенциала [12, 16].

Целью данного исследования стало определение маргинальных уровней этих эссенциальных веществ в рационе, с одной стороны, обеспечивающих физио­логические потребности экспериментальных животных, с другой стороны, снижающих адаптационный потен­циал и, как следствие, повышающих чувствительность к токсическому воздействию.

Материал и методы

Эксперименты длительностью -70 дней каждый про­водили на крысах линии Вистар. Исходная масса тела самцов составила 77-90 г, самок - 71-80 г; возраст ~30 дней.

Проведены 2 серии исследований: 1-я серия -на 5 группах животных, получавших рационы со 100, 75, 50, 25 и 0% содержанием витаминов В1, В2, В3, В6, а также минеральных веществ - Fe3+ и Mg2+ (1-5-я груп­пы соответственно); 2-я серия - на 4 группах животных, получавших рационы с 21,37, 9,94, 4,62, 2,15% содер­жанием соответствующих витаминов и минеральных веществ (6-9-я группы соответственно). Эксперимен­тальные рационы, представляющие собой полусинте­тический казеиновый рацион [19, 20] с модифицирован­ным составом витаминно-минеральных смесей (табл. 1), крысы получали на протяжении всего срока исследований. Всего в экспериментах были использованы 220 самок и 220 самцов крыс линии Вистар (100+100♀ в 1-й серии, 120+120♀ во 2-й серии).

Крыс содержали в пластиковых клетках (в каждой по 2 особи) с древесной подстилкой, в отапливаемом (температурный режим +21-23 °С) и вентилируемом помещении с естественным освещением, доступ к корму и воде - ad libitum. В течение экспериментов вели на­блюдения за поедаемостью корма и общим состоянием животных. Массу тела измеряли еженедельно, пост-мортальную некропсию и отбор материала для иссле­дований у животных 1-4-й и 6-7-й групп проводили на 70-й день экспериментов, соответствующий стадии взрослого половозрелого организма, характеризую­щегося стабильными физиолого-биохимическими по­казателями (~100-й день жизни животных). Животные 5-й группы были подвергнуты эвтаназии на 56-й день эксперимента в связи с началом массовой гибели живот­ных, при этом из-за невозможности отбора необходимого для исследований количества крови (низкая масса тела и высокая свертываемость крови) у крыс этой группы не были определены показатели, материалом для исследо­вания которых являлась кровь. Умершие животные были подвергнуты постмортальной некропсии для определе­ния причин смерти. Животные 8-9-й групп также были подвергнуты эвтаназии на 56-й день эксперимента.

В 1-й серии исследований были установлены интер­валы максимального, среднего и минимального содер­жания в рационе соответствующих эссенциальных нутриентов; во 2-й серии определен диапазон минимально возможного содержания этих веществ, обеспечиваю­щий наименьший уровень адаптационного потенциала и не вызывающий развития патологии (в данном слу­чае первыми симптомами развития патологии, которые можно было выявить при динамическом наблюдении за животными, являлись значительное снижение массы тела и впоследствии смертность животных).

Был изучен целый ряд показателей, включающий зоометрические, гематологические и биохимические показатели, показатели системы антиоксидантной защиты, показатели, характеризующие резистент­ность организма (бактерицидная и лизоцимная ак­тивность крови, содержание иммуноглобулинов и цитокинов), показатели, характеризующие активность процессов апоптоза, показатели, характеризующие гормональный статус, также проведены морфологические исследования внутренних органов. В данной статье проанализированы результаты зоометрических исследований, включая показатели динамики массы тела и поедаемости корма, показатели смер­тности животных, а также результаты исследований антиоксидантного статуса (активность ферментов системы антиоксидантной защиты эритроцитов -супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы и содержание продуктов перекисного окисления липидов - малонового диальдегида в гемолизатах эритроцитов (1:1) по [21]. Активность ферментов измеряли на биохимическом анализаторе StatFax1904+ ("Awareness Technology", США), содержание малонового диальдегида - на спек­трофотометре SmartSpec 3000 ("BioRad", США).

Полученные данные обработаны методами парамет­рической статистики: характер распределения коли­чественных признаков определен с помощью х2-критерия Пирсона, равенство дисперсий - с помощью F-критерия Фишера. Достоверность различий средних величин, удовлетворяющих условиям нормального рас­пределения и равенству дисперсии, оценена методом f-критерия Стьюдента. Критический уровень значи­мости (p) принят равным 0,05 [22-26].

При анализе выживаемости животных использовали Х2-критерий, в качестве нулевой статистической гипо­тезы принят F1(x)=F2(x), где Fi - функция распределения i-генеральной совокупности, из которой извлечена вы­борка.

Для характеристики стабильности изучаемых по­казателей было использовано понятие центральной тенденции (в качестве мер центральной тенденции применялись среднее арифметическое, среднее геомет­рическое, среднее гармоническое, мода, медиана).

Результаты и обсуждение

В 1-й серии исследований общее состояние крыс 1-4-й групп было удовлетворительным, по внешнему виду, качеству шерстного покрова, поведению разницы между группами не отмечено. В течение первых 3 нед эксперимента динамика массы тела самцов 1-4-й групп не имела статистически значимых различий, начиная с 28-го дня масса тела самцов 1-2-й групп была до­стоверно выше (на 6-8%), чем у крыс 3-4-й групп. При этом поедаемость корма самцами 1-3-й групп была примерно одинаковой и составляла ~18-19 г/крысу в сутки, тогда как поедаемость корма самцами 4-й груп­пы была несколько ниже и составляла ~14-15 г/крысу в сутки. Масса тела самок 1-4-й групп не имела значимых различий между группами на протяжении всего экспе­римента, поедаемость корма составляла ~17-18 г/крысу в сутки.

Общее состояние крыс 5-й группы было неудовлетво­рительным, отмечены ухудшение качества шерстного покрова (облысения), склонность к кровотечениям (сли­зистые оболочки носа и глаз), снижение поедаемости корма (~10-12 г/крысу в сутки у самцов и ~11-13 г/крысу в сутки у самок). Начиная с 35-го дня эксперимента зафиксированы случаи гибели животных 5-й группы (к 56-му дню эксперимента смертность самцов состав­ляла 25%, самок - 30%). При проведении постмортальной некропсии выявлены патологические изменения, характерные для кахексии: истощение висцеральной и подкожной жировой ткани, атрофия всех групп ске­летных мышц, уменьшение размеров внутренних орга­нов и др. Масса тела самцов и самок 5-й группы была значительно ниже, чем масса тела крыс 1-4-й групп (на 14-й день исследований на 9-14%, на 56-й день -на 62-69% соответственно, p<0,05).

При изучении массы внутренних органов, гематоло­гических, биохимических показателей, а также пока­зателей системы антиоксидантной защиты был отме­чен ряд незначительных различий между группами, не выходящий за пределы физиологических колебаний, характерных для самцов и самок крыс линии Вистар данного возраста. Не выявлено явных закономерностей изменения оцениваемых параметров в зависимости от уровней содержания витаминов и минеральных ве­ществ в рационе, однако 4-я группа характеризова­лась большей нестабильностью центральной тенден­ции, причем у самцов она была более выражена, чем у самок.

На основании анализа данных, полученных в 1-й серии исследований, следует, что уменьшение дозы соответст­вующих эссенциальных веществ до 25% существенно не сказывалось на значениях изученных показателей, а полное исключение этих веществ влекло за собой массовую гибель животных. Полученные данные легли в основу дизайна эксперимента 2-й серии, предназна­ченного для выявления диапазона минимально воз­можного (от 0 до 25%) содержания в рационе витаминов и минеральных веществ, не приводящего к развитию патологии и обеспечивающего наименьший уровень адаптационного потенциала. Следует отметить, что при расчете дозировок витаминов и минеральных веществ в рационе в 1-й серии эксперимента был использован принцип линейной зависимости, тогда как во 2-й серии -принцип степенной зависимости (показательная функ­ция). Такой подход позволял при минимальном числе экспериментальных групп получить достаточное коли­чество информации, в том числе о влиянии сверхнизких дозировок на рост и развитие крыс. В качестве исходной точки расчета дозировок было использовано значе­ние, не превышающее 25% и являющееся четвертой степенью от наименьшего значения, которое должно было быть выше 1. Проведенный расчет позволил оп­ределить соответствующие крайние значения как 21,37 и 2,15% (21,37=2,154) и промежуточные значения как 4,62 и 9,94%, являвшиеся производными второй (2,152) и тре­тьей (2,153) степени от наименьшего показателя.

Во 2-й серии исследований общее состояние крыс 6-й и 7-й групп было удовлетворительным, по внешне­му виду, поведению и качеству шерстного покрова не выявлено разницы между группами. В течение первых 5 нед эксперимента динамика массы тела самцов и самок 6-й и 7-й групп не имела статистически значимых различий, начиная с 35-го дня масса тела крыс 6-й группы была достоверно выше (самцов - на 10%, самок - на 8%), чем у крыс 7-й группы (рис. 1а). Поедаемость корма самцами 6-й группы составляла ~19 г/крысу в сутки, самками - ~18 г/крысу в сутки, тогда как поедаемость корма крысами 7-й группы составляла ~16 г/крысу в сутки у самцов и самок.

Общее состояние крыс 8-й и 9-й групп было неудов­летворительным, отмечены ухудшение качества шерст­ного покрова, склонность к кровотечениям, снижение поедаемости корма: у самцов и самок 8-й группы этот показатель составлял ~14 г/крысу в сутки, 9-й группы -~12 г/крысу в сутки. Начиная с 45-го дня эксперимента зафиксированы случаи гибели животных 8-й группы (к 56-му дню эксперимента смертность самцов со­ставляла 30%, самок - 37%) и 9-й группы (56 и 53% соответственно). Масса тела крыс 8-й и 9-й групп была значительно ниже, чем у животных 6-й и 7-й групп (на 21-й день исследований более чем на 5%, на 56-й день - более чем на 40%, р<0,05) (рис. 1б).

При изучении результатов гематологических, биохи­мических и др. исследований был отмечен ряд значи­мых различий между группами, демонстрировавших явные закономерности отклонения от центральной тенденции в зависимости от уровней содержания вита­минов и минеральных веществ в рационе. Так, показатели системы антиоксидантной защиты и перекисного окисления липидов эритроцитов проявляли линейные изменения (повышения концентрации) в ряду пониже­ния содержания эссенциальных веществ в рационах (табл. 2).

На основании полученных результатов была сфор­мирована графическая оценочная шкала "доза-риск" (рис. 2), которая была использована для определения пороговых значений витаминов и минеральных ве­ществ, обеспечивающих необходимое снижение уровня адаптационного потенциала у самцов и самок. При пос­троении графика были заданы следующие ключевые условия: уровень риска развития патологии выше 50% принимался в случае выявления достоверных различий выживаемости животных в группах (по критерию χ2) для данной дозы эссенциальных веществ, уровень риска от 50 до 25% - в случае выявления системных различий по ряду показателей, уровень риска менее 5% - в случае отсутствия системных различий (см. рис. 2).

Анализ графиков позволил определить пороговые значения содержания в рационе изученных веществ: их содержание в количестве менее 9% соответствовало уровню риска выше 50%, в количестве 9-12% - уровню риска от 50 до 25%, в количестве 13-24% - уровню риска выше 5%, в количестве выше 25% - уровню риска менее 5%.

С учетом степени риска развития патологии были уста­новлены 3 дозировки эссенциальных веществ, с опреде­ленной степенью условности обозначенные как оптималь­ная, маргинальная и субмаргинальная, обеспечивающие последовательное снижение адаптационного потенци­ала у лабораторных животных: 75, 30 и 19% для самцов и 75, 28 и 18% для самок соответственно.

Таким образом, предложенная модификация витамин-но-минерального состава рационов может быть исполь­зована в качестве модели снижения адаптационного потенциала крыс в токсикологических исследованиях при изучении объектов с неизвестной токсичностью, в частности новых видов пищевой продукции.

Работа поддержана Российским научным фондом (грант № 16-16-00124)

Литература

1. Голиков С.Н., Саноцкий И.В., Тиунов Л.А. Общие механизмы токсического действия. М. : Медицина, 1986. 280 с.

2. Саноцкий И.В., Уланова И.П. Критерии вредности в гигиене и токсикологии при оценке опасности химических соединений. М. : Медицина, 1975. 328 с.

3. Братусь А.С., Новожилов А.С., Платонов А.П. Динамические сис­темы и модели биологии. М. : Физматлит, 2010. 400 с.

4. Сидорова Ю.С., Бекетова Н.А., Вржесинская О.А., Коденцова В.М. и др. Влияние витаминной обеспеченности на протекание обще­го адаптационного синдрома у растущих крыс // Вопр. питания. 2014. Т. 83, № 5. С. 20-25.

5. Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Бекетова Н.А., Сото С.Х. и др. Микроэлементный и антиоксидантный статус крыс при полигиповитаминозе // Вопр. биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2013. Т. 11, № 2. С. 64-68.

6. Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Мазо В.К. Витамины и окис­лительный стресс // Вопр. питания. 2013. Т. 82, № 3. С. 11-18.

7. Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Бекетова Н.А., Сото С.Х. и др. Биохимические показатели плазмы крови и некоторые пара­метры антиоксидантого статуса крыс при полигиповитаминозах разной степени // Бюл. экспер. биол. 2012. № 10. С. 439-442.

8. Коденцова В.М. Витамины. М. : МИА, 2015. 408 с.

9. Кравченко Л.В., Аксенов И.В., Трусов Н.В., Гусева Г.В. и др. Вли­яние поливитаминной недостаточности на активность фермен­тов метаболизма ксенобиотиков в печени крыс // Вопр. питания. 2012. Т. 81, № 2. С. 28-33.

10. Кукес В.Г., Ребров В.Г., Стародубцев А.К., Булаев В.М. и др. Вита­мины и микроэлементы в клинической фармакологии / под ред. В.А. Тутельяна. М. : Палея-М, 2001. 560 с.

11. Тутельян В.А., Спиричев В.Б., Суханов Б.П., Кудашева В.А. Микронутриенты в питании здорового и больного человека. М. : Колос, 2002. 424 с.

12. Human vitamin and mineral requirements. Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultation. Geneva : World Health Organization, 2004. 341 p

13. Guardia M. de la. Handbook of Mineral Elements in Food. Valencia, 2015. 792 p.

14. Frisancho R.A. Human Adaptation and Accommodation. Michigan : University of Michigan Press, 1993. 532 p.

15. Thimann K.V. Vitamins and Hormones. London : Academic Press, 1980. Vol. 37. 353 p.

16. Human vitamin and mineral requirements. Report of a Joint FAO/ WHO Expert Consultation. Bangkok : World Health Organization, 2001. 286 p.

17. Yang W., Lee J. Y., Nowotny M. Making and breaking nucleic acids: two-Mg2+-ion catalysis and substrate specificity // Mol. Cell. 2006. Vol. 22. P. 5-13.

18. Bobkowski W., Nowak A., Durlach J. The importance of magnesium status in the pathophysiology of mitral valve prolapse // Magnes. Res. 2005. Vol. 18, N 1. P. 35-52.

19. Тышко Н.В., Жминченко В.М., Пашорина В.А., Селяскин К.Е. и др. Сравнительная характеристика влияния экспериментальных рационов на рост и развитие крыс // Вопр. питания. 2011. Т. 80, № 5. С. 30-38.

20. Benevenca N., Calvert C., Eckhert C. et al. Nutrient Requirements of Laboratory Animals. Washington : National Academy Press, 1995. 192 p.

21. Медико-биологическая оценка безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхожде­ния: Методические указания (МУ 2.3.2.2306-07). М. : Федераль­ный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2008. 21 с.

22. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. М. : Медиа Сфера, 2006. 312 с.

23. Scott I., Mazhindu D. Statistics for Health Care Professionals. London : SAGE Publications Ltd., 2005. 241 p.

24. Юнкеров В.И., Григорьев С.Г. Математико-статистическая обра­ботка данных медицинских исследований. СПб.: ВМедА, 2002. 266 с.

25. Медик В.А., Токмачев М.С., Фишман Б.Б. Статистика в медицине и биологии: руководство : в 2 т. / под ред. Ю.М. Комарова. Т. 1. Теоретическая статистика. М. : Медицина, 2000. 412 с.

26. Хромушкин В.А., Китанина К.Ю., Хромушкин О.В., Федоров С.Ю. Совершенствование алгоритма алгебраической модели конс­труктивной логики // Вестн. новых медицинских технологий. 2015. Т. 22, № 2. С. 11-19.