The effect of various levels of chitosan in rat diet on vitamins assimilation under their combined deficiency

AbstractThe effect of chitosan inclusion in the semi-synthetic diet of rats at a dose of 0,24 and 0,9% of dry weight on vitamin assimilation under combined moderate and deep deficiency has been studied. Four-week introduction of chitosan did not have a significant effect on levels of vitamins C, B1, B2 and A in the liver of animals, on vitamin B2 blood plasma concentration and thiamine and riboflavin urinary excretion regardless of the degree of vitamin deficiency intensity. The significantly decrease of vitamin E blood plasma concentration has been observed at high dose of chitosan in the diet under moderate vitamin deficiency, whereas under deep deficit such reduction has been detected even at a low dose. Thus, long-term chitosan inclusion in the diet under existing polyhypovitaminosis can lead to the deterioration of the sufficiency with fat-soluble vitamins.

Keywords:vitamin deficiency, vitamin A, vitamin E, vitamin В1, vitamin В2, vitamin C, liver, blood plasma, rats

Питание современного человека характеризуется недостаточным количеством пищевых волокон [5]. В качестве дополнительного источника пищевых волокон (высокомолекулярных полисахаридов) часто используется хитозан (Х), получаемый из хитина панцирей ракообразных обработкой сильными кислотами и щелочами. Х - групповое название веществ, получаемых при обработке хитина щелочами и имеющих различную степень дезацетилирования и деполимеризации. Х является поликатионным адсорбентом, он связывает холестерин и жирные кислоты в просвете кишечника и тем самым препятствует их всасыванию [13].

В ряде работ показано, что Х обладает способностью связывать жиры и жирорастворимые витамины [16], т.е. он может ухудшать в организме усвоение последних и увеличивать их экскрецию с фекалиями [15]. Описана способность Х в кислой среде взаимодействовать с некоторыми витаминами и образовывать комплексы с рибофлавином [18] и коферментной формой тиамина - тиаминдифосфатом [19].

Содержание крыс в течение 2-4 нед на высокожировом рационе (20% кукурузного масла) с включенном в него Х в дозе 5% приводит к достоверному снижению в крови и печени животных уровня витамина Е [14, 21]. Включение в корм кур-несушек Х в течение 1,5 мес сопровождается уменьшением содержания в целом яйце витаминов А, Е и лютеина [2]. В то же время при проведении слепых плацебо-контролируемых исследований с участием добровольцев, страдающих гиперхолистеринемией и ожирением, влияния Х, используемого в течение 4-8 нед, на содержание в крови исследуемых витаминов

(А, Е, D) не выявлено на фоне оптимальной обеспеченности указанными витаминами [17, 20].

Учитывая, что в настоящее время среди населения России довольно часто встречается полигиповитаминоз [3], целью настоящего исследования, выполненного на лабораторных животных, было изучение влияния Х, включенного в их рацион, на степень усвоения витаминов в условиях умеренного и глубокого дефицита витаминов.

Материал и методы

Исследования были выполнены на крысах - самцах линии Вистар с исходной массой тела 70-80 г, полученных из питомника НЦБМТ РАМН "Столбовая". Животные были произвольно разделены на несколько групп (по 8-9 крыс в каждой); они получали полусинтетический рацион, содержащий 20% казеина, 66,4% кукурузного крахмала, 9% жира (смесь подсолнечного масла и лярда - 1:1), 3,5% солевой смеси [11]. На протяжении всего эксперимента животные находились в клетках из полимерного материала (полистирола) по 2-3 особи при приглушенном естественном освещении (средняя продолжительность светового дня составила 7,5 ч), относительной влажности воздуха от 40 до 60%, температуре 23±2 °С. Животные получали корм ad libitum (средневзвешенное количество - 16,5 г/сут) и имели постоянный доступ к воде. Еженедельно проводили контроль массы тела лабораторных животных. Продолжительность эксперимента составила 28 дней.

Животные контрольной группы (8 крыс) получали полноценный полусинтетический рацион, содержащий 0,1% смеси водорастворимых витаминов и викасола, 0,9% смеси жирорастворимых витаминов (D,L-α-токоферола ацетата, холекальциферола и пальмитата ретинола) в подсолнечном масле. Животные опытных групп находились на том же рационе, что и контрольной, за исключением витаминов. Умеренный и глубокий дефицит витаминов вызывали у них уменьшением в 2 или 5 раз количества добавляемых в корм витаминных смесей.

Животным группы с умеренным дефицитом витаминов в корм добавляли смесь витаминов в количестве 50% от содержания в полноценном рационе для крыс (0,05% смеси водорастворимых витаминов и викасола, 0,45% смеси жирорастворимых витаминов). Животным группы с глубоким дефицитом витаминов витаминную смесь добавляли в рацион в количестве 20% от содержания в рационе крыс контрольной группы. Животные с умеренным дефицитом витаминов были подразделены на 3 подгруппы: подгруппа с умеренным дефицитом без добавления Х (УД), а также с добавлением в рацион Х из расчета 40 мг на 1 крысу в сутки (подгруппа УД+Х1) и 150 мг на 1 крысу в сутки (подгруппа УД+Х2). Животные с глубоким дефицитом витаминов были также подразделены на 3 подгруппы: без добавления Х (подгруппа ГД), с добавлением в 40 мг/сут (подгруппа ГД+Х1) и 150 мг/сут (подгруппа ГД+Х2) на 1 крысу. При проведении исследований Х использовали в виде порошка (производство компании "Натуральные ингредиенты", РФ, с размером частиц не более 180 мкм). Дозы Х, добавляемого к рациону крыс, рассчитывали в соответствии с рекомендациями по выбору доз фармакологических средств, используемых в I фазе клинических исследований, проводимых в стационарных условиях, а также с учетом массы животных [8] и величин, соответствующих адекватному и верхнему допустимому уровню его потребления в составе биологически активных добавок к пище для человека [6].

За 20 ч до окончания экспериментов крыс помещали в метаболические клетки для сбора мочи, лишая пищи и предоставляя воду без ограничения. После окончания опытов предварительно наркотизированных животных умерщвляли путем декапитации и подвергали патолого-анатомическому вскрытию. Кровь, собранную после декапитации животного в пробирки (с гепарином), центрифугировали в течение 15 мин при 1500 об/мин, отбирали плазму и хранили при -20 °С. Печень, взятую сразу после вскрытия животного, взвешивали, определяли ее абсолютную (в г) и относительную (в %) массу, затем готовили гомогенаты печени.

В плазме крови и экстракте гомогенатов печени методом ВЭЖХ [7, 10] определяли содержание витаминов А (ретинол и пальмитат ретинола) и Е (токоферолы). В печени, моче и плазме крови с помощью флюориметрического метода [7, 9, 10] также выявляли содержание витаминов В1 и В2. Одновременно в печени крыс колориметрическим методом [12] исследовали содержание аскорбиновой и дегидроаскорбиновой кислоты, микробиуретовым методом - содержание белка, спектрофотометрическим - содержание креатинина.

Полученные данные были подвергнуты статистической обработке с помощью компьютерных пакетов "Статистика" и "SPSS Statisticа для Windows" (версия 18.0). Для выявления статистической значимости различий непрерывных величин использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни и непараметрический критерий Краскелла-Уоллеса для независимых переменных. Различия между анализируемыми показателями считали достоверными при уровне значимости р≤0,05.

Результаты и обсуждение

Содержание крыс на экспериментальных рационах с пониженным содержанием витаминов привело у них к концу эксперимента к развитию дефицита витаминов разной степени выраженности. Глубокий дефицит витаминов у крыс, получавших 1/5 часть того количества витаминов, которое содержалось в рационе животных контрольной группы, подтверждалось некоторым замедлением их роста, причем масса тела животных, а также абсолютная и относительная масса печени не подвергались изменениям (табл. 1). Однако в печени животных наблюдалось снижение содержания витаминов Е и В1 (1,8-2,2 раза), витамина А (в 8,5 раз) и витамина В2 (на 18%) по сравнению с показателями в контрольной группе (табл. 2). На основании этого можно заключить, что низкое содержание в рационе крыс витаминов (1/5 часть от количества в контрольной группе), привело к развитию у них глубокого дефицита водо- и жирорастворимых витаминов, т.е. возникновению выраженного полигиповитаминоза. При этом показатели у животных, получавших 1/2 часть витаминов, заняли промежуточное положение (табл. 2).

В табл. 3 представлены данные о содержании витамина В1 в печени крыс и витамина В2 в печени и плазме крови. Включение в рацион крыс с глубоким дефицитом витаминов (подгруппа ГД+Х1) Х в дозе, соответствующей адекватному уровню его потребления, сопровождалось тенденцией к уменьшению содержания в печени витамина В1 на 21% (в расчете на 1 г сырой печени) или на 30% (при расчете на целый орган), или на 26% (при расчете содержания общего тиамина на количество белка). В то же время зависимости содержания витамина В1 в печени от применяемой дозы Х выявлено не было.

При увеличении дозы Х в 3,75 раза наблюдалось снижение уровня витамина В1 в печени на 10-17%; при расчете содержания витамина на 1 г белка оно достигало уровня тенденции. Однако была выявлена тенденция к снижению в 1,8 раза количества тиамина, выводимого с мочой (табл. 4). При глубоком сочетанном дефиците витаминов достоверного влияния Х на уровень витамина В1 в печени и экскрецию с мочой в зависимости от его дозы в рационе не выявлено.

Введение в рацион Х при обеих используемых нами дозах не отразилось на содержании витамина В2 в печени, плазме крови крыс и экскреции рибофлавина с мочой (табл. 3, 4). Полученные результаты согласуются с данными об отсутствии влияния потребления Х курами-несушками на содержание витамина В2 в целом яйце, сыворотке крови, печени и бедренной скелетной мышце [1, 2] и не подтвердили предположение об ухудшении усвоения витаминов В1 и В2, высказанное на основании обнаруженной in vitro способности Х образовывать в кислой среде комплексы с рибофлавином и тиаминдифосфатом [18, 19].

Таблица 1. Масса тела и печени крыс, получавших хитозан, на фоне разного содержания витаминов в полусинтетическом рационе (М±m)

Таблица 2. Содержание витаминов в сырой печени крыс, получавших различные дозы витаминов (мкг/г сырой ткани) (М±m)

Таблица 3. Содержание витаминов группы В в печени и плазме крови крыс с различной глубиной дефицита витаминов, получавших хитозан (М±m)

Таблица 4. Экскреция витаминов с мочой у крыс с различной глубиной дефицита витаминов, получавших хитозан (М±m)

Таблица 5. Содержание витамина С в печени крыс с различной глубиной дефицита витаминов, получавших хитозан (М±m)

Известно, что крысы способны синтезировать витамин С, поэтому в экспериментальные полусинтетические рационы крыс аскорбиновую кислоту не добавляют. В наших опытах включение в корм животных Х в обеих дозах не отражалось как на суммарном содержании всех форм аскорбиновой кислоты, так и на уровне дегидроаскорбиновой кислоты (табл. 5). При умеренном полигиповитаминозе включение Х в рацион крыс в дозах, используемых в наших опытах, также не влияло на уровень ретинола в плазме крови животных. На фоне глубокого дефицита витаминов введение в корм крыс в высокой дозы Х (подгруппа ГД+Х2) сопровождалось лишь тенденцией (рис. 1, а)к снижению содержания ретинола в плазме крови (на 20% по сравнению с показателем, выявленным у животных контрольной группы, не получавших Х). Заметного влияния Х на уровень витамина А в печени крыс также не обнаружено (рис. 1, б).

Х, введенный в рацион животных, оказывает влияние и на содержание α-токоферола в сыворотке крови и печени. Причем дозозависимый эффект Х в отношении α-токоферола в плазме крови обнаруживается лишь у крыс с умеренно выраженным полигиповитаминозом (рис. 2, а). В крови этих животных концентрация α-токоферола при большей дозе Х (0,9% в рационе) выявляется только на уровне 61,8% от концентрации, обнаруженной у крыс, не получавших Х. На фоне глубокого дефицита витаминов достоверное снижение содержания витамина Е (в 1,5 раза) в крови происходило даже при низкой дозе Х. В печени животных влияние различных доз Х на содержание α-токоферола было менее ярким. Оно проявлялось только при высокой дозе Х у крыс с умеренным дефицитом витаминов и заключалось в снижении в органе содержания α-токоферола на 15% (рис. 2, б). Наши данные о снижении под влиянием Х уровня α-токоферола в крови согласуются с опубликованными [14, 21], но несколько расходятся с выводами об уменьшении его уровня в печени. Это, возможно, объясняется более низкой дозой Х (в 5,6 раза) использованной цитируемыми авторами.

Рис. 1. Зависимость уровня витамина А в плазме крови (мкг/дл) (а) и печени (мкг) (б) крыс от дозы хитозана в рационе на фоне полигиповитаминоза разной степени выраженности (1 - 20%, 2 - 50%)

Рис. 2. Зависимость уровня α-токоферола в плазме крови (а) и печени (б) крыс от дозы хитозана в рационе на фоне полигиповитаминоза разной степени выраженности (1 - 20%, 2 - 50%)

Исследование, в котором мы изучали влияние включения в рацион крыс Х в дозе 0,24 и 0,9% от сухой массы корма на усвоение витаминов на фоне умеренно или глубоко выраженного полигиповитаминоза показало, что включенный в рацион Х не оказывает достоверного влияния на уровень витаминов С, В1, В2 и А в печени животных, витамина В2 в плазме крови и экскрецию тиамина и рибофлавина с мочой. При этом степень глубины дефицита витаминов не влияет на действие Х. Однако это положение не относится к витамину Е: при умеренно выраженном полигиповитаминозе достоверное снижение концентрации витамина Е в плазме крови обнаруживают только при высокой дозе Х в рационе, тогда как в случае глубокого полигиповитаминоза снижение содержания витамина Е в крови выявляется уже при низкой дозе Х.

Использованная нами экспериментальная модель отражает ситуацию, типичную для питания современного человека, когда на фоне недостаточного потребления витаминов рацион начинают обогащать пищевыми волокнами в дозах, соответствующих верхнему допустимому уровню потребления в составе биологически активных добавок к пище. Как показано в данной работе, 4-недельное включение Х в рацион крыс на фоне полигиповитаминоза может привести к дальнейшему ухудшению обеспеченности витамином Е, а при более длительном сроке - и другими жирорастворимыми витаминами [2]. Это действие Х, препятствующее усвоению в организме некоторых витаминов, следует учитывать при обогащении рациона пищевыми волокнами, которые в больших количествах могут ухудшать обеспеченность организма отдельными витаминами [4].

Литература

1. Бекетова Н.А., Вржесинская О.А., Коденцова В.М. и др. // Вопр. питания. - 2007. - Т. 76, № 5. - С. 39-42.

2. Вржесинская О.А., Филимонова И.В., Коденцова О.В. и др. // Вопр. питания. - 2005. - № 3. - С. 28-31.

3. Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Спиричев В.Б. // Вопр. питания. - 2010. - Т. 79, № 3. - С. 68-72.

4. Погожева А.В., Коденцова В.М., Вржесинская О.А. и др. // Вопр. питания. - 2010. - Т. 79, № 1. - С. 34-39.

5. Роль пищевых волокон в питании человека / Под ред. В.А. Тутельяна, А.В. Погожевой, В.Г. Высоцкого. - М.: Фонд "Новое тысячелетие", 2008. - 325 с.

6. Рекомендуемые уровни потребления пищевых и биологически активных веществ. Методические рекомендации МР 2.3.1.1915-04. - М.: Госсанэпиднормирование Российской Федерации, 2004. - 36 с.

7. Руководство по методам анализа качества и безопасности пищевых продуктов / Под ред. И.М. Скурихина, В.А. Тутельяна. - М.: Брандес-Медицина, 1998. - 340 с.

8. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. Р.У. Хабриева. - 2-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 2005. - 832 с.

9. Руководство Р 4.1.1672-03 "Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище. - М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004. - 240 с.

10. Спиричев В.Б., Коденцова В.М., Вржесинская О.А. и др. Методы оценки витаминной обеспеченности населения: Учебно-методическое пособие. - М.: ПКЦ Альтекс, 2001. - 68 с.

11. Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов Методические указания. МУ 1.2.2520-09. (утв. Роспотребнадзором 05.06.2009).

12. Шпаков А.Е. // Лаб. дело. - 1967. - № 5. - С. 305-307.

13. Хитозан per os от пищевой добавки - к лекарственному средству / Под ред. Р.А.А. Муццарелли. - Н. Новгород: Вектор-ТиС, 2001. - 372 с.

14. Deuchi K., Kanauchi O., Shizukuishi M., Kobayashi E. // Biosci. Biotechnol. Biochem. - 1995. - Vol. 59. - P. 1211-1216.

15. Kimura Y., Nagata Y., Buddington R.K. // J. Nutr. - 2004. - Vol. 134. - P. 135-142.

16. Park S.I., Zhao Y. // J. Agric. Food Chem. - 2004. - Vol. 52, N 7. - P. 1933-1939.

17. Pittler M.H., Abbott N.C., Harkness E.F., Ernst E. // Eur. J. Clin. Nutr. - 1999. - Vol. 53. - P. 379-381.

18. Rodrigues M.R., Oliveira H.P., Lacerda F.V. // Int. J. Food Sci. Nutr. - 2011. - Vol. 62, N 3. - P. 195-199.

19. Rojanarata T., Opanasopit P., Techaarpornkul S. et al. // Pharm. Res. - 2008. - Vol. 25, N 12. - P. 2807-2814.

20. Tapola N.S., Lyyra M.L., Kolehmainen R.M. et al. // J. Am. Coll. Nutr. - 2008. - Vol. 27, N 1. - P. 22-30.

21. Yao H.T., Lii C.K., Chou R.H. et al. // J. Agric. Food Chem. - 2010. - Vol. 58, N 8. - P. 5187-5193.