The effect of water with modified isotope (D/H) composition on the reproductive function and postnatal development in rats

AbstractReproductive parameters and postnatal progeny development were evaluated in 4 generations of Wistar rats treated with deuterium depleted water (DDW): parental (F0), first (F1), second (F2) and third (F3). The experiment was carried out on 2 groups of animals: experimental group consumed DDW (50 ppm) and control group consumed purified tap water (150 ppm). Experiment was consist of a preparatory stage, the stage of studying the F0, F1, F2 reproductive parameters and F1, F2, F3 postnatal progeny development Reproductive parameters was assessed by F0, F1, F2 fertility index and F1, F2, F3 offspring viability and development. Fertility index was assessed as the male's ability to fertilize females in the percentage of pregnant females/fertilized males to the total number females and males placed together for mating. Offspring maturing were evaluated by pups viability, development of physical and sexual parameters, emotional and locomotors reflexes within the 1st month of life. Group 1 fertility index in F0 females was 100%, in F1 and F2 females - 99%, in males all generations - 89-100%. Group 1 F1, F2 and F3 offspring viability was high. Number of pups in group 1 F2 offspring was higher by 20% than in group 2. Pups of the 1st group F1, F2 and F3 were less intensively gained weight from the 1st to the 21st day of life compared with group 2, the final weight of the animals in group 1 was higher than in group 2 by 4-6% from 25th to 30th days of life. Assessment of physical parameters development as well as emotional and locomotors reflexes formation did not reveal any difference between group 1 and group 2 F1, F2 and F3 offspring. Obtained results confirmed that DDW did not effect on rat fertility, viability and development of offspring.

Keywords:reproduction and postnatal development, water, deuterium, rats

Вопр. питания. 2016. № 5. С. 36-43.

Качество воды, являющейся важным компонентом рациона человека, определяется санитарно-гигие­ническими показателями и регулируется на регио­нальном, национальном и международном уровнях. В Российской Федерации в питьевой воде нормируются органолептические и некоторые физико-химические параметры, а также содержание вредных химических веществ. Однако предельно допустимые концентрации (ПДК) установлены не для всех химических элементов и их соединений.

Концентрация тяжеловодородной воды 1HD16O и тя­желокислородной воды 1H218O в воде пресноводных источников составляет примерно 330 мг/л и 2 г/л соответственно, что сопоставимо с содержанием мине­ральных солей в питьевой воде или даже превышает их предельно допустимые нормы [1]. Стоит отметить, что при длительном воздействии на организм минимальных концентраций дейтерия, превышающих ПДК, могут воз­никать патологические изменения или заболевания на любых сроках жизни настоящего и последующего поко­лений. Если рассматривать дейтерий как микроэлемент, входящий в состав не только воды, но и важнейших органических соединений, по значимости его влияние на живые системы можно поставить на одно из первых мест [2].

Специфическое влияние на биологические про­цессы низких концентраций дейтерия воды доказано многими исследованиями [3, 4]. При употреблении воды с пониженным содержанием дейтерия происхо­дит снижение его концентрации в жидкостях и тканях организма [5], изменяется окислительный метабо­лизм [6]. Также показано, что под воздействием воды с модифицированным изотопным (D/H) составом у млекопитающих наблюдаются позитивные измене­ния функциональной активности ряда органов и систем: изменяется скорость метаболических процессов в центральной нервной системе [7], гормональная регуляция, функционирование системы детоксикации [8], активизируются неспецифические защитные системы, повышается устойчивость систем организма к токси­ческим соединениям, в том числе к химиопрепаратам [9-13]. Имеются данные о стимулирующем действии воды с пониженным содержанием дейтерия на рост микроорганизмов [4, 14].

Однако, несмотря на столь широкий интерес и нали­чие различных положительных эффектов влияния низ­ких концентраций дейтерия воды на живые системы раз­личного уровня организации, по-прежнему нет ответа на вопрос о влиянии данного фактора на генеративную функцию (гонадотоксическое, эмбрио-, фетотоксическое и тератогенное действие) животных.

Цель работы - проведение сравнительного исследо­вания репродуктивной функции и постнатального раз­вития крыс, получавших воду с модифицированным D/H составом (пониженное содержание тяжелых изотопов водорода).

Материал и методы

Исследования выполнены на 4 поколениях крыс стока Вистар (90 взрослых животных и 547 крысят): родитель­ском (F0), первом (F1), втором (F2) и третьем (F3). Экс­перимент состоял из подготовительной стадии, стадии изучения репродуктивной функции крыс поколений F0, F1, F2 и постнатального развития крыс поколений F1, F2, F3. Подготовительная стадия предназначалась для выведения животных (поколение F1), получавших воду с модифицированным D/H составом на протяжении всего срока онтогенетического развития организма. Исходную колонию крыс [поколение F0, самцы и самки массой тела (248±14) г], полученную из филиала "Андреевка" ФГБУН НЦБМТ ФМБА (Московская область, Солнечно­горский район, п. Андреевка) и прошедшую карантин на протяжении 10 сут, произвольно разделяли на 2 группы. На протяжении всего срока исследований животные 1-й группы потребляли воду с модифицированным D/H составом, крысы 2-й группы - очищенную водопро­водную воду. Адаптацию исходной колонии крыс (F0) -замену питьевого компонента рациона на воду с мо­дифицированным D/H составом - осуществляли на протяжении 20 сут, после чего проводили спаривание. Для оплодотворения самок (в каждой группе n=10) подсаживали к самцам в соотношении 2:1 на 14 сут. В период спаривания возраст крыс составлял 100­110 сут. Крысят отсаживали от материнских животных на 30-й день жизни; для продолжения эксперимента отбирали потомство от разных самок (с целью ран­домизации исследований и исключения возможности инцеста).

Репродуктивную функцию оценивали по фертильности поколений животных F0, F1 и F2 и характеру постнатального развития потомства F1, F2 и F3. Фертильность оценивали по способности к оплодотворению самок и самцов в процентном соотношении забеременевших самок/оплодотворивших самцов к общему количест­ву ссаженных самок/самцов. При этом беременность обеих или одной самки подтверждала фертильность самца. В случае, если ни одна из самок не беременела, самец считался нефертильным, а обе самки - потенци­ально фертильными.

Характер постнатального развития потомства F1, F2 и F3 оценивали в течение первого месяца жизни по числу живых и мертвых новорожденных, динамике зоометрических показателей (масса тела), общему физи­ческому развитию (срок отлипания ушных раковин, по­явления первичного волосяного покрова, прорезывания резцов, открытия глаз, опускания семенников, открытия влагалища), эмоционально-двигательному поведению и способности к координации движений [16]. Массу тела крысят измеряли с помощью электронных технических весов Ohaus ("Adventurer Pro", США) с точностью (±0,1) г, на 2, 7, 14, 21, 28 и 30-е сутки жизни. Определяли сред­ний размер помета, число живых и мертвых новорож­денных, вычисляли выживаемость с 0-го по 5-й день жизни (отношение числа крысят, доживших до 5-го дня, к числу родившихся живыми) и с 6-го по 25-й день жизни (отношение числа крысят, доживших до 25-го дня, к числу доживших до 6-го дня), соотношение самцов и самок [17, 18]. В течение эксперимента также учитыва­ли потребление воды с модифицированным D/H соста­вом (в пересчете на животное).

Воду с модифицированным D/H составом получали на разработанной в Кубанском государственном уни­верситете установке, остаточное содержание дейтерия 50 мг/л [15]. В качестве исходной для получения питье­вой воды для поения 2-й группы животных с природной концентрацией дейтерия (150 мг/л) использовали воду, полученную на установке водоподготовки EMD Millipore RiOs™ 50. Минерализацию воды осуществляли путем добавления в нее минеральных солей для получения физиологически полноценного минерального соста­ва (минерализация 314-382 мг/л: гидрокарбонаты -144-180, сульфаты - <1, хлориды - 60-76, кальций - 6, магний - 3, натрий - 50-58, калий - 50-58). Темпера­тура воды для поения взрослых животных составляла 10-12 °С, молодняка - 15-20 °С соответственно.

В период проведения эксперимента животных со­держали в стандартных условиях вивария при свобод­ном доступе к воде и пище в пластмассовых клетках TECNIPLAST тип IV S, в которые помещали не более 6 крыс (в соответствии с нормами размещения живот­ных) [19]. Условия содержания животных были стан­дартизированы: температура - (20±3) °С, влажность -(48±2)%, освещение режим день/ночь (с 6.00 до 18.00/ с 18.00 до 6.00). В качестве подстила использовали бе­резовую стружку. На протяжении всего эксперимента животные потребляли стандартный концентрированный комбикорм по ГОСТ Р 50258.

Эксперименты проводили в соответствии с требо­ваниями приказа Минздрава России от 19.06.2003 № 267 "Об утверждении правил лабораторной практи­ки", Правил лабораторной практики (GLP), Хельсинк­ской декларации (2000) и Директив Европейского сооб­щества 86/609 EEC.

Результаты приведены в виде Р25-75 (25-й и 75-й процентили) и min-max (минимальное и максимальное зна­чение измеряемой величины), а также в долях (процен­тах) или в абсолютных числах.

Статистическую обработку проводили с использо­ванием пакета программ Statistica 10.0. Характер рас­пределения количественных признаков определяли с помощью χ2-критерия, равенство дисперсий - с помо­щью критерия Левена. Достоверность различий средних величин, удовлетворяющих условиям нормального рас­пределения и равенству дисперсий, оценивали мето­дом однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Для сравнения количественных признаков, не удов­летворяющих условиям нормального распределения и равенству дисперсий, использовали непараметри­ческий аналог для независимых выборок - U-критерий Манна-Уитни. Критический уровень значимос­ти нулевой статистической гипотезы (р) принимали равным 0,05 [18].

Результаты и обсуждение

Наблюдение в процессе проведения эксперимента показало, что общее состояние животных F0-F3 было удовлетворительным. По внешнему виду, поведенческим реакциям, скорости роста, в том числе физическо­му развитию, эмоционально-двигательному поведению и способности к координации движений опытные живот­ные не отличались от контрольной группы и соответство­вали нормам для животных данного вида и возраста.

Поедаемость корма составляла 13,5-29,8 г/сут на крысу (для самцов) и 12,6-25,8 г/сут (для самок). В период адаптации животных F0 потребление воды с модифицированным D/H составом составило 24,8± 2,2 мл/сут (самки) и 27,4±1,8 мл/сут (самцы), у живот­ных 2-й группы - 22,9±3,4 и 25,8±2,4 мл/сут для самок и самцов соответственно. В период беременности и лактации животных F0 потребление воды возрастало в 1-й группе с 32,9 до 43,6 мл/голову, во 2-й - с 35,6 до 44,7 мл/голову. Потребление воды с модифициро­ванным D/H составом животных F1 и F2 колебалось в пределах 32,9-33,1 мл/голову в период беременности и 44,9-46,5 мл/голову - в период лактации. Живот­ные F1 и F2 контрольной группы в период беременнос­ти потребляли 33,9-34,7 мл воды/голову, лактации -45,5-46,7 мл/голову соответственно. В период адап­тации к воде с модифицированным D/H составом жи­вотные набирали в среднем 0,8-1,9 г/сут, животные 2-й группы - 1,2-2,2 г/сут (рис. 1).

Эффективность спаривания, демонстрирующая фертильность экспериментальных животных, составила: 100% - для самок и самцов поколения F0 1-й и 2-й групп, 90% - для самок 1-й группы поколений F1 и F2, 70 и 80% - для самок 2-й группы поколений F1 и F2 соот­ветственно (рис. 2). Фертильность самцов 1-й и 2-й групп поколений F1 и F2 составляла 89-100% соответственно. При данных условиях эксперимента эффективность спаривания соответствовала ожидаемой - количество неоплодотворивших самцов и незабеременевших самок находилось в пределах физиологической нормы. При этом определенной тенденции не отмечено, следова­тельно, данные являлись случайными, не были связаны с влиянием каких-либо внешних факторов. Смертности, связанной с родами, у самок поколений F0, F1 и F2 не зарегистрировано.

Сравнительный анализ данных постнатального раз­вития потомства в опытной и контрольной группах по­казал высокую выживаемость в поколениях F1, F2 и F3 (табл. 1). Соотношение самцов и самок в каждом поко­лении в 1-й и 2-й группах различалось, при этом отме­ченные колебания не имели определенной тенденции и не выходили за пределы значений, характерных для крыс данной линии.

Комплексная оценка морфофункциональных показа­телей постнатального онтогенеза потомства крыс поз­волила выявить некоторые различия. Анализ динамики массы тела детенышей трех поколений обоих экспери­ментальных групп не выявил значимых колебаний в пер­вые 30 сут. Однако отмечено, что детеныши F1, F2 и F3, родители которых потребляли воду с модифицирован­ным D/H составом (1-я группа), на протяжении первых 20 сут менее интенсивно прибавляли в весе, чем жи­вотные этих поколений 2-й группы. При этом начиная с 25-х по 30-е сутки масса тела детенышей 1-й группы поколений F1, F2 и F3 превышала в среднем на 4-18% показатели животных 2-й группы. Прирост массы тела за этот период у животных 1-й группы достигал: для F1 и F2 - 20%, F3 - 25% по сравнению с таковым у детенышей 2-й группы (F1 - 8%, F2 - 10%, F3 - 15% соот­ветственно). Наиболее выражена данная тенденция у поколения F3 (табл. 2).

Наблюдение в динамике за крысятами 1-й и 2-й групп F1, F2 и F3 показало отсутствие достоверных отличий в физическом развитии с первых суток после рождения (табл. 3). Также не выявлено достоверных отличий в скоро­сти созревания сенсорно-двигательных рефлексов и физических параметров крысят опытной группы F1, F2 и F3 в сравнении с контрольными группами животных (табл. 4).

При исследовании эмоционально-двигательного по­ведения и способности к тонкой координации движений было зафиксировано, что переворачивались в свобод­ном падении все крысята обеих групп с 16-х суток жизни (см. табл. 4).

На основании полученных экспериментальных дан­ных можно сделать вывод, что при формировании изотопного градиента за счет реакций D/H-обмена, обусловливающих достоверное снижение содержания дейтерия в плазме и в тканях печени, почек и сердца [12, 13], сопровождающееся умеренной стимуляцией процессов свободнорадикального окисления, отражающего активацию функционирования прооксидантной системы организма и повышение его адаптационных возможностей, не оказывает влияния на генеративную функцию организма животных.

Заключение

На основании выполненных исследований необхо­димо отметить, что по внешнему виду, поведенческим реакциям, скорости роста, в том числе физическому развитию, эмоционально-двигательному поведению и способности к координации движений опытные жи­вотные не отличались от контрольной группы и соответствовали нормам для животных данного вида и возраста. Смертности, связанной с родами у самок опытных и контрольных групп F0, F1 и F2 не зарегистрировано. Сравнительный анализ данных постнатального развития потомства в опытной и конт­рольной группах показал высокую выживаемость в поколениях F1, F2 и F3. Эффективность спаривания, демонстрирующая фертильность животных в опытных и контрольных группах, не имела достоверных отличий. При данных условиях эксперимента эффективность спаривания соответствовала ожидаемой - количест­во неоплодотворивших самцов и незабеременевших самок находилось в пределах физиологической нормы. Выживаемость потомства, средняя величина поме­тов у крыс опытных и контрольных групп также не имели достоверных отличий. Соотношение самцов и самок в каждом поколении в группах незначительно различалось, при этом отмеченные колебания не имели определенной тенденции и не выходили за пределы значений, характерных для крыс данной линии.

Комплексная оценка морфофункциональных показа­телей постнатального онтогенеза потомства крыс поз­волила выявить некоторые различия. Анализ динамики изменения массы тела животных F1, F2 и F3 не выявил значимых колебаний в первые 14 сут. У детенышей F1, F2 и F3 опытной группы отмечено менее интенсив­ное увеличение массы с 1-х по 21-е сутки, что связано с большим количеством крысят в помете. При этом масса тела животных опытной группы (F1, F2 и F3) на­чиная с 25-х по 30-е сутки превышала показатели конт­рольных животных на 4-18% Наблюдение в динамике за крысятами опытной и контрольной групп F1, F2 и F3 показало отсутствие достоверных отличий в физическом развитии с первых суток после рождения. Также не выявлено изменений в скорости созревания сенсорно-двигательных рефлек­сов и физических параметров крысят опытной группы F1, F2 и F3 в сравнении с контрольными группами жи­вотных.

Таким образом, результаты проведенных исследова­ний свидетельствуют о том, что вода с модифициро­ванным D/H составом не оказывает патологического влияния на фертильность и плодовитость крыс, выжи­ваемость и развитие потомства.

Исследование выполнено в рамках гранта Российского научного фонда (проект № 15-16-00008).

Литература

1. Bowen G.J., Winter D.A., Spero H.J., Zierenberg R.A. et al. Stable hydrogen and oxygen isotope ratios of bottled waters of the world // Rapid Commun. Mass Spectrom. 2005. Vol. 19. Р. 3442-3450.

2. Мухачев В.М. "Живая" вода. М. : Наука, 1975. 143 с.

3. Kirkina A.A., Lobyshev V.I., Lopina O.D., Doronin Y.K. et al. Isotopic effects of low concentration of deuterium in water on biological systems // Biophysics. 2014. Vol. 59, N 2. P. 326-333.

4. Samkov A.A., Dzhimak S.S., Barishev M.G., Volchenko N.N. et al. The effect of water isotopic composition on Rhodococcus erythropolis biomass production // Biophysics. 2015. Vol. 60, N 1. P. 107-112.

5. Dzhimak S.S., Barishev M.G., Basov A.A., Timakov A.A. Influence of deuterium depleted water on freeze dried tissue isotopic compo­sition and morphofunctional body performance in rats of different generations // Biophysics. 2014. Vol. 59, N 4. Р. 614-619.

6. Basov A.A., Baryshev M.G., Dzhimak S.S., Bykov I.M. et al. The effect of consumption of water with modified isotope content on the param­eters of free radical oxidation in vivo // Fiziol. Zh. 2013. Vol. 59, N 6. P. 49-56.

7. Fernandes De Lima V.M. Modulation of CNS excitability by water movement. The D2O effects on non-linear neuron-glial dynamics // J. Biophys. Chem. 2011. Vol. 2, N 3. P. 353-360.

8. Lisicin A.B., Barishev M.G., Basov A.A., Barisheva E.V. et al. Influence of deuterium depleted water on the organism of laboratory animals in various functional conditions of nonspecific protective systems // Biophysics. 2014. Vol. 59, N 4. Р. 620-627.

9. Avila D.S., Somlyai G., Somlyai I., Aschner M. Anti-aging effects of deuterium depletion on Mn-induced toxicity in a C. elegans model // Toxicol. Lett. 2012. Vol. 211. P. 319-324.

10. Somlyai G., Gyongyi Z., Budan F., Szabo I. et al. Deuterium depleted water effects on survival of lung cancer patients and expression of Kras, Bcl2 and Myc genes in mouse lung // Nutr. Cancer. 2013. Vol. 65, N 2. P. 240-246.

11. Cong F., Zhang Y., Sheng H., Ao Z. et al. Deuterium-depleted water inhibits human lung carcinoma cell growth by apoptosis // Exp. Ther. Med. 2010. Vol. 1. P. 277-283.

12. Басов А.А., Быков И.М., Барышев М.Г., Джимак С.С. и др. Концентрация дейтерия в пищевых продуктах и влияние воды с модифицированным изотопным составом на показатели свободнорадикального окисления и содержание тяжелых изотопов водорода у экспериментальных животных // Вопр. питания. 2014. Т. 83, № 5. С. 43-50.

13. Джимак С.С., Басов А.А., Федулова Л.В., Дыдыкин А.С. и др. Коррекция метаболических процессов у крыс при хроническом эндотоксикозе с помощью реакций изотопного (D/H) обмена // Изв. РАН. Сер. биол. 2015. № 5. С. 518.

14. Назаров Н.М., Синяк Ю.Е., Ефременко Е.Н., Степанов Н.А. и др. Влияние легкоизотопной воды на рост бактериальной культуры // Авиакосм. и экол. мед. 2011. Т. 45, № 3. С. 63-66.

15. Фролов В.Ю., Барышев М.Г., Болотин С.Н., Джимак С.С. Способ получения биологически активной питьевой воды с пониженным содержанием дейтерия. Пат. РФ № 2438765 с приоритетом от 25.05.2010. Опубл. 10.01.2012. Заявка № 2010121324/05.

16. Миронов А.Н. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Ч. 1. М. : Гриф и К, 2012. 944 с.

17. Тышко Н.В., Жминченко В.М., Пашорина В.А., Селяскин К.Е. и др. Оценка влияния ГМО растительного происхождения на развитие потомства крыс в трех поколениях // Вопр. питания. 2011. Т. 80, № 1. С. 14-28.

18. Тышко Н.В., Селяскин К.Е., Мельник Е.А., Пашорина В.А. и др. Оценка репродуктивной функции крыс при раздельном и сочетанном воздействии алиментарного и токсического факторов // Вопр. питания. 2012. Т. 81, № 1. С. 33-43.

19. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 8th ed. Washington, DC : The National Academies Press, 2011. 248 р.