Zero valent seleniumе nanoparticles bioavailability estimation in rats

AbstractBioavailability of zero valent selenium (Se) nanoparticles with average size 60 nm was measured in rats receiving selenium deficient diet. There was demonstrated that intragastric administration of Se nanoparticles resulted in dose-dependent increase of serum Se level, normalization of tissue thiol pools, immune status and hepatocytes apoptosis. Possibilities are discussed of Se nanoparticles use in nutrition as a source of this trace element.

Keywords:zero valent selenium, nanoparticles, rats, bioavailability

Селен (Se), являющийся биоантиоксидантом непрямого действия [ 9] и участвующий в построении ряда важных ферментов [3, 9, 19], поступает в организм с пищей в естественных условиях в форме содержащихся в пищевых белках аминокислот селеноцистеина и селенометионина. В качестве источников Se, применяемых при коррекции его дефицита и обогащении специализированных продуктов для энтерального питания и заменителей женского молока, наиболее часто используют неорганические соли - селенат и селенит натрия [4]. До недавнего времени было принято считать, что элементарный (нульвалентный) Se биодоступен для человека и животных в очень малой степени [2, 11]. Вместе с тем перевод этого вещества в форму наночастиц размером <100 нм, сопровождающийся резким возрастанием химического потенциала и реакционной способности [1], может, по-видимому, существенно изменить его биохимические свойства. Так, в некоторых работах недавно показано, что элементарный Se в виде наночастиц при введении в заведомо завышенных, нефизиологических количествах может усваиваться в организме мышей [16, 23]. Целью настоящего исследования было изучение биодоступности нульвалентного Se в составе наночастиц при их внутрижелудочном введении в нутритивно адекватных количествах крысам с алиментарной недостаточностью данного микроэлемента.

Материал и методы

Наночастицы (НЧ) Se были получены при помощи абляции массивной мишени элементарного (красного) Se квалификации х.ч. в деионизованной воде без добавления поверхностно-активных веществ. Методика генерации подробно описана в [18]. Использовался лазер на парах меди с длиной волны 510,6 нм, средней мощностью около 4 Вт и частотой повторения 15 нс величиной импульсов 15 кГц. После наработки достаточного количества наночастиц осуществлялась их фрагментация с помощью того же лазерного пучка, но в отсутствие мишени. Препарат НЧ был исследован методом трансмиссионной электронной микроскопии, с использованием электронного микроскопа CX100 ("Jeol", Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ. Фотографии в цифровой форме анализировали с помощью программы "Image Tool". Репрезентативная электронная микрофотография препарата и распределение наночастиц Se по размеру представлены на рисунке. Средний размер частиц составил 65,3±1,6 нм, диапазон изменений - от 8 до 218 нм, 90-й перцентиль - 100 нм; вид распределения был близок к нормальному.

Исследование проведено на 59 крысах самцах Вистар с исходной массой тела 50±2 г, полученных из питомника РАМН "Столбовая". Животные были разделены на 5 групп. На протяжении всего эксперимента крысы 1-й группы (контрольной) получали полноценный по основным пищевым веществам, а также макро- и микронутриентам общевиварный рацион (ОВР). Животные остальных 4 групп получали полусинтетический селендефицитный корм производства фирмы "MP Biomedicals" (США). Содержание Se в корме, по данным спектрофлюориметрического определения, составило 0,038 мкг/кг. Рационы и деионизованую воду животные получали в режиме свободного неограниченного доступа.

С 10-го дня эксперимента и на протяжении последующих 21 дня крысам 2-5-й (опытных) групп внутрижелудочно через зонд вводили: деионизованную воду (2-я группа); НЧ Se из расчета 0,04 мг Se на 1 кг массы тела (3-я группа); НЧ Se из расчета 0,4 мг/кг Se на 1 кг массы тела (4-я группа) или раствор селенита натрия (Na2SeO3) х.ч. в деионизованной воде из расчета 0,04 мг Se на 1 кг массы тела (5-я группа). Крыс всех групп еженедельно взвешивали на электронных весах с точностью ±0,5 г и определяли динамику прироста массы тела.

По окончании эксперимента животных обескровливали под эфирной анестезией, подвергали патолого-анатомическому вскрытию, определяли абсолютную массу печени, почек, селезенки, сердца, семенников, тимуса, легких, надпочечников путем взвешивания на электронных весах с точностью ±0,01 г.

Характеристика наночастиц элементарного Se методом просвечивающей электронной микроскопии: а - репрезентативная микрофотография, увеличение  12 000; б - распределение наночастиц по размеру

Ось абсцисс - диаметр по большой оси эллипсоида, нм; ось ординат - число частиц в интервале ±7 нм. Сплошной линией указана кривая нормального распределения частиц.

Se в сыворотке крови и в печени определяли микрофлюориметрическим методом [5]. Гематологические показатели (число эритроцитов, гематокрит, средний объем эритроцита, содержание и концентрацию Hb в эритроците), общее количество лейкоцитов, лейкоцитарную формулу, общее количество тромбоцитов определяли на гематологическом анализаторе "Coulter ACTTM 5 diff OV" (фирма "Beckman Coulter", США). Апоптоз клеток печени изучали на проточном цитофлюориметре "FC 500" (фирма "Beckman Coulter International S.A.", Австрия) по методу [10]. Для этого получали суспензию гепатоцитов с помощью автоматической системы для механической гомогенизации ткани "BD Medimachine" (фирма "Becton Dickenson and Company",США). Гепатоциты (концентрация клеток 1106 см-3) окрашивали конъюгированным с флюорохромом (FITC) аннексином V (AnV-FITC) и витальным красителем 7-аминоактиномицином (7-AAD) (фирма "Beckman Coulter Int.", США). Иссеченные кусочки печени и клеточную суспензию в процессе обработки хранили на льду. Результаты представляли в виде процентного соотношения живых клеток и гепатоцитов, находящихся на разных стадиях апоптоза в расчете на 10 тыс. просчитанных объектов в каждом образце. Клеточное звено иммунного статуса крыс определяли методом прямого иммунофлюоресцентного окрашивания лимфоцитов цельной крови с использованием панели моноклональных антител, конъюгированных с флюоресцентными красителями FITC, PC7, APC (IO Test, Beckman Coulter, США) и лизирующего/фиксирующего набора реагентов ImmunoPrep (Beckman Coulter, США). Активность глутатионпероксидазы плазмы крови (GPX) определяли ферментативным спектрофотометрическим методом согласно [8]. Всасывание в кровь введенного перорального белкового антигена - куриного овальбумина изучали иммуноферментным методом [17].

Статистическую обработку результатов измерений проводили с помощью пакета программ SPSS 18.0, используя непараметрический ранговый критерий Манна-Уитни. Различия признавали достоверными при р<0,05.

Результаты и обсуждение

Абсолютный и относительный приросты массы тела животных во всех опытных группах на протяжении всего эксперимента не различались (р>0,05 при попарном сравнении всех групп по данным недельных прибавок массы тела). В целом за 30 дней опыта прирост массы крыс в опытных группах составил соответственно 60±4, 58±3, 51±4 и 57±5% от исходного (без достоверных различий между группами). Выявленные различия относительной массы некоторых внутренних органов (печени, почек, селезенки, семенников) были незначительными по величине и не могли быть однозначно соотнесены ни с формой, ни с дозой добавки Se.

Как следует из данных табл. 1, минимальный уровень Se в сыворотке крови отмечался у животных 2-й группы. По мере увеличения дозы НЧ Se его концентрация в сыворотке крови нарастала и при дозе 0,4 мг/кг массы тела значительно превышала уровень, наблюдавшийся у крыс 1-й группы, находившихся на ОВР. Вместе с тем у животных, получавших добавку селенита натрия, практически тот же уровень Se сыворотки отмечается уже при дозе НЧ Sе в 10 раз меньшей, т.е. при 0,04 мг/кг.

Уровень Se в ткани печени практически не отличался от наблюдавшегося у крыс, получавших ОВР и селенодефицитный корм с добавкой наночастиц 0,04 мг/кг. В то же время у животных 2-й группы выявлена некоторая тенденция к снижению содержания Se в печени, свидетельствующая об уменьшении запасов микроэлемента в депо организма. У животных, получавших 10-кратно увеличенную дозу наночастиц или селенит натрия, этот показатель резко (более чем 2-кратно) и достоверно (p<0,001) возрастал. Различия в динамике накопления Se в крови и печени, по-видимому, связаны с тем, что концентрация Se в сыворотке крови зависит от селенопротеинов, экспрессия которых определяется нутритивным статусом этого микроэлемента. Указанное различие представляет лабильный показатель обеспеченности, в то время как уровень Se в ткани печени отражает, скорее, состояние его консервативного тканевого депо [14, 21].

Таблица 1. Показатели, характеризующие обеспеченность селеном крыс 1-5-й групп

Как следует из данных табл. 2, активность GPX в плазме крови крыс 1-5-й групп достоверно не различалась. Небольшое нарастание активности фермента у животных 3-й и 4-й групп по сравнению со 2-й группой имело характер тенденции (без статистического подтверждения). Эти результаты согласуются с представленными в литературе [19] о высокой степени консерватизма показателя активности данной формы GPX, претерпевающей значительное снижение, как правило, только при глубокой степени дефицита Se, которая, по-видимому, не была достигнута в ходе настоящего эксперимента. Вместе с тем, как следует из табл. 2, концентрация тканевых тиолов печени (представленных у крысы главным образом глутатионом) была достоверно понижена во 2-й группе (недостаточность Se) и полностью восстанавливалась до контрольного уровня во всех группах, получавших добавки Se. Показатель всасывания белкового антигена (овальбумина), по некоторым данным, отрицательно коррелирующий у крыс со статусом Se и восстановленного глутатиона [6, 7], в группах, получавших добавки Se, достоверно не отличался от показателя у животных 1-й и 2-й групп (см. табл. 2).

Исследование гематологических показателей животных 1-5-й групп показало, что все изученные параметры находились в пределах нормальных значений для данного пола и возраста животных. Различий, которые могли бы быть соотнесены с формой и дозой вводимых препаратов Se, не выявлено. Вместе с тем результаты оценки иммунного статуса, полученные методом проточной цитофлюориметрии (табл. 3), показали, что относительное содержание T-хелперов (CD3+CD4+) и иммунорегуляторный индекс (отношение CD4+/CD8+) были достоверно и резко снижены у животных 2-й группы (с дефицитом Se). Одновременно относительное число цитотоксических T-лимфоцитов (CD3+CD8+) в этой группе было столь же резко повышено. У крыс всех групп, получавших обе формы Se, в том числе НЧ (независимо от дозы последних) все эти показатели практически полностью возвращались к норме и недостоверно отличались от таковых в 1-й (контрольной) группе, что согласуется с данными литературы о влиянии обеспеченности Se на состояние системы иммунитета [13].

Исследование апоптоза клеток печени (табл. 4) выявило достоверное снижение относительного числа живых клеток в гейте гепатоцитов и повышение процента гепатоцитов в состоянии апоптоза у животных 2-й группы (с дефицитом Se). У всех крыс, получавших внутрижелудочно Se, относительное содержание клеток в состоянии апоптоза в гейте гепатоцитов было достоверно ниже (в 4-й группе наблюдалась лишь тенденция к снижению) по сравнению с таковыми в контрольной и Se-дефицитной группах.

Таблица 2. Уровень небелковых тиолов печени, активность глутатионпероксидазы (GPX) плазмы крови и всасывание антигенного овальбумина (ОВА) у крыс, потреблявших селенодефицитный рацион и получавших различные добавки Se

Таблица 3. Показатели лимфоцитов периферической крови, характеризующие иммунологический статус крыс 1-5-й групп

Таблица 4. Показатели апоптоза гепатоцитов у крыс 1-5-й групп

Таким образом, полученные результаты показывают, что наночастицы элементарного Se, введенные в желудочно-кишечный тракт крыс, у которых была обнаружена недостаточность этого микроэлемента, могут усваиваться организмом, хотя, возможно, и несколько менее эффективно, чем селенит натрия. Вопрос о механизмах усвоения нульвалентного Se в организме в настоящее время далек от разрешения. Известно, что превращение селеноцистеина пищи в анион гидроселенида (основная метаболизируемая форма этого элемента в синтезе специфических селенопротеинов) осуществляется под действием фермента селеноцистеинлиазы через промежуточное образование нульвалентного Se [12, 19]. Это указывает на существующую в принципе возможность метаболизации нульвалентного Se, которая может протекать только гетерофазно (с учетом полной нерастворимости этой валентной формы Se в биологическом окружении) и резко ускоряться в наночастицах, обладающих наиболее высокой удельной поверхностью.

При решении вопроса о выборе пищевого источника Se следует учитывать, что биодоступность его неорганических солей (селенатов и селенитов), является, по-видимому, максимальной [2]. Вместе с тем высокая токсичность неорганических соединений Se значительно ограничивает возможность их использования. В этом отношении гораздо лучшие перспективы для профилактики недостаточности Se имеют его органически связанные формы (селенометионин, селенсодержащая спирулина, автолизат селеносодержащих дрожжей), которые обладают несколько меньшей усвояемостью и менее токсичны, чем неорганические соли Se [4]. В этом ряду возможных источников Se находятся, как следует из полученных данных, и наночастицы нульвалентного Se, токсичность которых, согласно работам [15, 20, 22], ниже, чем у его неорганических производных. Настоящая работа частично выполнена за счет средств Федерального бюджета по государственному контракту с Минобрнауки России в рамках Федеральной целевой программы "Развитие инфраструктуры наноиндустрии в Российской Федерации на 2008-2011 гг.".

Литература

1. Верников В.М., Арианова Е.А., Гмошинский И.В. и др. // Вопр. питания. - 2009. - Т. 78, № 2. - С. 4-17.

2. Гмошинский И.В., Мазо В.К. // Вопр. питания. - 2006. - Т. 75, № 5. - С. 15-21.

3. Гмошинский И.В., Мазо В.К., Тутельян В.А., Хотимченко С.А. Сб. науч. тр. "Экология моря". - Севастополь: Национальная академия наук Украины, 2000. - Вып. 54. - С. 5-19.

4. Гмошинский И.В., Мазо В.К. // Medicina Altera. - 1999. - № 4. - С. 18-22.

5. Голубкина Н .А. // Журн. аналитической химии. - 1995. - Т. 50, № 8. - С. 492-497.

6. Голубкина Н.А., Гмошинский И.В., Зорин С.Н. и др. // Вопр. питания. - 1998. - Т. 67, № 3. - С. 18-22.

7. Голубкина Н.А., Мазо В.К., Зорин С.Н. и др. // Вопр. мед. химии. - 2000. - Т. 46. № 1. - С. 22-27.

8. Ивахненко В.И., Мальцев Г.Ю., Васильев А.В., Гмошинский И.В. // Вопр. питания. - 2007. - Т. 76, № 5. - С. 11-17.

9. Селен в организме человека: метаболизм, антиоксидантные свойства, роль в канцерогенезе / Под ред. В.А. Тутельяна, В.А. Княжева, С.А. Хотимченко и др. - М.: Изд-во РАМН, 2002. - 260 с.

10. Хайдуков С.В., Зурочка А.В. Вопросы современной проточной цитометрии: клиническое применение. - Челябинск, 2008. - 112 с.

11. Combs G.F., Garbisu C., Yee B.C. et al. // Biol. Trace Elem. Res. - 1996. - Vol. 52, N 3. - P. 209-225.

12. Deagen J.T., Butler J.A., Beilstein M.A. et al. // J. Nutr. - 1987. - Vol. 117, N 1. - P. 91-98.

13. Hoffmann P.R., Berry M.J. // Mol. Nutr. Food Res. - 2008. - Vol. 52, N 11. - P. 1273-1280.

14. Janghorbani M., Martin R.F., Kasper L.J. et al. // Am. J. Clin. Nutr. - 1990. - Vol. 51. - P. 670-677.

15. Jia X., Li N., Chen J. // Life Sci. - 2005. - Vol. 76, N 17. - P. 19 8 9 - 2 0 0 3 .

16. Peng D., Zhang J., Liu Q., Taylor E.W. // J. Inorg. Biochem. - 2007. - Vol. 101, N 10. - P. 1457-1463.

17. Stuart C.A., Twistelton R., Nicholas M.K. et al. // Clin. Allergy. - 1984. - Vol. 14, N 6. - P. 533-535.

18. Shafeev G.A. Nanoparticles: New Research / Ed. Simone Luca Lombardi. - New York: Nova Science Publishers, 2008. - 978 р.

19. Sunde R .A. // Annu. Rev. Nutr. - 1990. - Vol. 10. - P. 451-474.

20. Wang H., Zhang J., Yu H. // Free Radic. Biol. Med. - 2007. - Vol. 42, N 10. - P. 1524-1533.

21. Waschulewski I.H., Sunde R.A. // J. Nutr. - 1988. - Vol. 118, N 3. - P. 367-374.

22. Zhang J., Wang H., Yan X., Zhang L. // Life Sci. - 2005. - Vol. 76, N 10. - P. 1099-1109.

23. Zhang J., Wang X., Xu T. // Toxicol. Sci. - 2008. - Vol. 101, N 1. - P. 22-31.