The complexes of copper, manganese and chromium with enzymatic hydrolysate of pig spleen: research in vitro

Abstract

This report describes the preparation and the results of physical and chemical analysis of complexes of enzymatic hydrolysate of pig spleen (EHPS) with manganese, copper and chromium. The complexes were prepared using schemes including the reaction of complexation of inorganic cations with EHPS-peptides structures and application of membrane technology. The process of microfiltration of the resulting mixtures was carried out in tangential flow and low molecular weight fractions were collected. Solutions of copper and manganese complexes with EHPS were subjected to nanofiltration to remove inorganic ions from the reaction mixture. The obtained preparations were lyophilic dried and the molecular weight distribution of the protein fractions in Cu-EHPS, MnEHPS and Cr-EHPS complexes was analyzed by exclusion medium pressure liquid chromatography. The percentage relation of fractions with specific molecular weight range was calculated by applying the weighted integration of chromatograms. The determination of copper, manganese and chromium levels in the complexes was performed by atomic absorption method. The content of microelements in the preparations is for copper 16.5±0.3 mg/g, for manganese – 24.9±0.5 mg/g and for chromium – 2.5±0.2 mg/g.

Keywords:essential microelements, enzymatic hydrolysate of pig spleen, membrane technology, complexation

Вопр. питания. 2016. № 1. С. 81-84.

Недостаточная обеспеченность организма эссенциальными микроэлементами (ЭМ), относящимися к пищевым антиоксидантам (селеном, медью, цинком, марганцем), представляет фактор риска свободнорадикальной патологии, проявляющейся многочисленными болезнями и клиническими синдромами. Соответственно обогащение рациона ЭМ антиоксидантного действия является одним из факторов оптимизации питания и используется при производстве широкого спектра специализированных пищевых продуктов, преимущественно профилактического и лечебного назначения. Это обстоятельство определяет необходимость получения новых пищевых источников ЭМ, легко усвояемых организмом, эффективных и безопасных, которые могут быть использованы в качестве пищевых ингредиентов в специализированных продуктах и биологически активных добавках (БАД) к пище, отвечающих одновременно требованиям высокой эффективности и безопасности. Использование в качестве пищевых источников ЭМ их комплексов с ферментативными гидролизатами белков было продемонстрировано в ряде наших предыдущих статей [1-6]. В последней из этой серии публикаций нами были охарактеризованы в опытах in vitro и in vivo ферментолизат белков селезенки свиньи (ФГСС) и его комплекс с цинком [2]. В данном кратком сообщении описано получение и приведены физико-химические свойства комплексов ФГСС с другими ЭМ d-группы периодической таблицы Д.И. Менделеева: марганцем, медью, хромом.

Материал и методы

Исходный ФГСС был предоставлен ООО "Петрохим" (Москва) и охарактеризован физико-химическими методами. Суммарное содержание частично расщепленных белков, пептидов и аминокислот (структуры с молекулярной массой менее 11,3 кД) составило около 75%. Около 1/3 части от этого количества составила фракция аминокислот и пептидов с молекулярной массой менее 2,4 кД.

Содержание золы и влаги в ФГСС составляло соответственно 10 и 5%.

Комплексы ФГСС с ЭМ получали согласно ранее разработанным и апробированным схемам [2], смешивая 25% водные растворы CuCl2×2H2O, MnCl2×4H2O и 10% водный раствор CrCl3×6H2O с водным раствором ФГСС. Весовые соотношения (в пересчете на массы сухих веществ) составили: 1/10 для CuCl2×2H2O/ФГСС и MnCl2×4H2O/ФГСС, 1/99 для CrCl3×6H2O/ФГСС. Реакции комплексообразования проводили согласно [7] при рН реакционной среды 7,0-7,1 в течение 1 ч при комнатной температуре и постоянном перемешивании. Затем осуществляли микрофильтрацию полученной смеси в тангенциальном потоке на установке "Минитан" ("Millipore", США; мембрана 0,65 мкм) и собирали низкомолекулярные фракции. Растворы комплексов меди и марганца с ФГСС подвергали нанофильтрации на лабораторной нанофильтрационной установке ("Владисарт", РФ). Полученные препараты лиофильно высушивали на сублимационной сушке ЛС-500 ("ПРОИНТЕХ", РФ). Анализ молекулярно-массового распределения белковопептидных фракций в составе Cu-ФГСС, Mn-ФГСС и Сr-ФГСС проводили методом эксклюзионной жидкостной хроматографии среднего давления на колонке "Супероза 12" (1,6×50 см) ("Pharmacia", Швеция) [7]. Процентное соотношение фракций с определенными интервалами молекулярных масс рассчитывали, применяя весовое интегрирование хроматограмм. Определение в составе комплексов содержания меди, марганца и хрома осуществляли атомно-абсорбционным методом [8].

Результаты и обсуждение

В таблице представлено распределение фракций, отвечающих определенным интервалам молекулярных масс в составе полученных комплексов.

Высокое содержание в составе этих комплексов свободных аминокислот, коротко- и среднецепочечных пептидов способствует эффективному комплексированию ЭМ. Чтобы исключить возможные остаточные количества неорганических солей меди и марганца, использовали нанофильтрацию.

Ее использование снижает относительное содержание в препаратах низкомолекулярных структур.

При этом практически полностью удаляются из конечного продукта не связанные с пептидной матрицей неорганические ионы [4]. Cледует отметить, что чрезмерно высокое содержание низкомолекулярных пептидов и свободных аминокислот может негативно влиять на органолептические свойства комплекса как пищевого ингредиента, придавая ему горький вкус. Для комплексов хрома с белковым ферментолизатом стадию нанофильтрации не применяли, поскольку использованное соотношение 1/99 для CrCl3×6H2O/ФГСС априори обеспечивает очень высокую степень связывания хрома.

Содержание меди в комплексах Cu-ФГСС без нанофильтрации и после нанофильтрации составило соответственно 20,7±0,4 и 16,5±0,3 мг/г, марганца в комплексах Mn-ФГСС без нанофильтрации - 22,4±0,4 мг/г и после нанофильтрации - 24,9±0,5 мг/г, содержание хрома в составе Сr-ФГСС - 2,5±0,2 мг/г.

Таким образом, нами получены и физико-химически охарактеризованы комплексы, представляющие органические формы марганца, меди и хрома. Представленные результаты подтверждают эффективность использования биотехнологического подхода для получения новых пищевых источников указанных ЭМ в органической форме. Они свидетельствуют, что наряду с биотехнологическими процессами культивирования биомассы простейших микроорганизмов в средах, обогащенных неорганическими соединениями переходных металлов, для широкомасштабного получения новых пищевых источников этих микроэлементов в органически связанной форме может быть эффективно использована их способность к комплексообразованию со свободными аминокислотами и пептидами, входящими в состав ферментативных гидролизатов пищевых белков.

Использование современных ферментных препаратов и мембранных технологий позволяет получать гидролизаты пищевых белков с заданными физико-химическими свойствами и их комплексы с ЭМ. Очевидны перспективы использования последних в качестве пищевых источников вышеперечисленных ЭМ. Расширение ассортимента на основе недорогого животного сырья (селезенки свиньи) пищевых источников ЭМ актуально в плане стоящей перед отечественной пищевой промышленностью проблемы замещения импортных специализированных пищевых продуктов и БАД к пище, используемых для профилактики и/или коррекции микроэлементной недостаточности.

Литература

1. Баяржаргал М., Зилова И.С., Зорин С.Н., Гмошинский И.В. и др. Сравнительная оценка биодоступности органической и неорганической форм цинка in vivo // Вопр. питания. 2008. Т. 77, № 1. С. 34-37.

2. Зорин С.Н. Ферментативные гидролизаты пищевых белков и органические комплексы эссенциальных микроэлементов на их основе // Вопр. питания. 2009. Т. 78. № 6. С. 60-66.

3. Зорин С.Н., Баяржаргал М., Гмошинский И.В., Мазо В.К. Комплексная оценка органических форм эссенциальных микроэлементов цинка, меди, марганца и хрома в опытах in vitro и in vivo // Вопр. питания. 2007. Т. 76. № 5. С. 74-79.

4. Зорин С.Н. Получение и физико-химическая характеристика комплексов эсенциальных микроэлементов (цинк, медь, марганец, хром) с ферментативными гидролизатами пищевых белков // Микроэлементы в медицине. 2007. Т. 8, вып. 1. С. 53-55.

5. Мазо В.К., Зорин С.Н., Баяржаргал М., Гмошинский И.В. и др. Новые пищевые источники эссенциальных микроэлементов. Сообщение 6. Получение и физико-химическая характеристика новых пищевых источников цинка, меди, марганца, хрома и селена // Вопр. дет. диетологии. 2005. Т. 3. № 5. С. 19-21.

6. Мазо В.К., Зорин С.Н., Гмошинский И.В. Новые пищевые источники эссенциальных микроэлементов. Сообщение 3. Влияние комплексов эссенциальных микроэлементов с ферментативными гидролизатами сывороточных белков коровьего молока на степень сенсибилизации и протекание реакции анафилаксии у лабораторных животных // Вопр. дет. диетологии. 2004. Т. 2. № 4. С. 12-14.

7. Зорин С.Н, Сидорова Ю.С., Зилова И.С., Мазо В.К. Комплекс цинка с ферментолизатом белка селезенки свиньи - исследование in vivo // Вопр. питания. 2014. Т. 83. № 5. С. 58-63.

8. Руководство по методам анализа качества и безопасности пищевых продуктов / под ред. И.М. Скурихина, В.А. Тутельяна. М. : Брандес-медицина, 1998. С. 183-185.