Impact of streptozotocininduced hyperglycemia on anxiety level and physical fatigue of Wistar rats

Abstract

The aim of the study was to evaluate type 2 diabetes medicamental biomodel in 70-days experiment. Control group animals were provided with water ad libitum throughout the experiment, experimental group animals for the first two weeks were provided with 20% solution of fructose ad libitum instead of water. On the 15th day, experimental group animals (average body weight 257±8 g) were injected abdominally with streptozotocin (STZ) in dosage 40 mg/kg of body weight. For the next three weeks on the 22nd, 28th and 36th days, glucose level in blood taken from the tail vein was measured using portable electrochemical glucometer. On the 37th day animals with blood glucose level 11.0 mmol/L or higher were included in experimental group for further research. On the 44th and 60th day control measurements of glucose level were conducted. On the 70th day animals were taken out of experiment by decapitation under ether anesthesia.

The concentration of glucose, glycosylated hemoglobin, triglycerides, cholesterine, HLD and LDL were measured in blood serum. Additionally anxiety level of animals was evaluated before and after STZ injection using Elevated plusmaze.

The comparison of physical fatigue of control and experimental groups was performed using treadmill. On the 37th day blood glucose concentration of control group animals was 6.6±0.4 mmol/L. 33% of animals (13 of 40) with glucose level 11.0 mmol/L or higher formed the experimental group (average glucose level 16.2±1.3 mmol/L), other 27 rats had normal glucose level. The anxiety level of diabetic rats was higher than in control group. Diabetic rats showed significantly lower physical fatigue than control rats. On the 44th and 60th day of experiment glucose level in experimental rats from group 2 (15.5±1.4 и 14.8±1.2 mmol/L) was significantly higher than of control animals (7.0±0.5 и 6.8±0.3 mmol/L). Glycated hemoglobin level in blood serum of diabetic group (7.2±0.7%) was significantly higher than of control group (3.3±0.2%). This proves the progression of stable long-term hyperglycemia. According to results represented model can be used for initial experimental evaluation of tested antidiabetic biologically active substances.

Keywords:type 2 diabetes, biological modeling, drug-induced diabetes, streptozotocin, blood glucose, glycosylated hemoglobin, physical fatigue

Вопр. питания. 2015. № 6. С. 38-45.

Оценка эффективности и безопасности тестируемых биологически активных соединений в эксперименте является, как известно, необходимым этапом, предшествующим клиническим испытаниям их применения в составе специализированных диетических профилактических и/или лечебных продуктов, в частности она позволяет оптимизировать поиск микроингредиентов для пищевых специализированных продуктов антидиабетического действия.

Экстраполяции результатов, полученных при моделировании сахарного диабета (СД) 2 типа с ис- пользованием генетических линий лабораторных животных, на организм человека существенно более оправданна по сравнению с так называемыми медикаментозными моделями [1, 2]. Медикаментозные вмешательства при моделировании СД 2 типа априори не могут достаточно полно отражать процесс развития этого заболевания. Тем не менее, как отмечается в обзорной статье [3], выбор той или иной экспериментальной модели СД 1 или 2 типа во многом определяется целью исследования: тестированием фармакологической активности, генетическими исследованиями или выяснением механизмов развития заболевания.

В силу различных причин, в том числе и экономических, медикаментозные модели СД 2 типа, несомненно, сыграли и продолжают играть свою роль для оценки эффективности природных биологически активных соединений в терапии и профилактике данного заболевания. Для медикаментозного воспроизведения СД 2 типа, как известно, широко используется стрептозотоцин (СТЦ), действие которого выражается прежде всего в деструкции панкреатических β-клеток островков Лангерганса. Наряду с моделью стрептозотоцинового СД 2 типа разработаны и используются модели стрептозотоцинового СД 2 типа на грызунах, потребляющих рационы с высоким содержанием фруктозы. Инсулинорезистентность, нарушения углеводного и липидного обмена, часть диабетических симптомови осложнений у лабораторных грызунов индуцируются поступлением с пищей в течение относительно продолжительно времени большого количества фруктозы, которая может потребляться ad libitum с питьевой водой или рационом [4-6].

Сочетанное действие СТЦ в низкой дозировке и высокофруктозного рациона позволяет в относительно короткий период времени индуцировать развитие СД 2 типа у крыс, как это показано в работе [7]. Эта модель, не требующая составления специального рациона, перспективна для предварительного скрининга антидиабетических препаратов. Для оценки эффективности новых биологически активных соединений в составе специализированных пищевых продуктов для лиц, страдающих СД 2 типа, представляет существенный интерес исследовать их влияние на такие показатели, как физическая работоспособность и тревожное поведение.

С этой целью в работе была осуществлена попытка охарактеризовать влияние введения крысам линии Вистар СТЦ и поступления с пищей большого количества фруктозы, моделирующих СД 2 типа, на уровень тревожности в тесте "Приподнятый крестообразный лабиринт" и физическую выносливость при тестировании животных на беговой дорожке.

Материал и методы

Эксперимент проводили на 50 крысах-самцах линии Вистар, полученных из питомника НЦБМТ РАМН "Столбовая". Исходная масса тела животных на начало эксперимента составила 199±1 г.

Животных разделили на 2 группы: контрольную группу составили 10 особей с массой тела 195±4 г, опытную - 40 крыс с массой тела 200±3 г (р>0,05).

Животные обеих групп на протяжении всего эксперимента получали ad libitum коммерческий гранулированный полноценный корм для содержания крыс и мышей ("Лабораторкорм", РФ).

Животные контрольной группы на протяжении всего эксперимента получали питьевую воду ad libitum. Животные опытной группы (n=40) на протяжении двух первых недель эксперимента вместо воды получали 20% раствор фруктозы, далее этих животных переводили на воду питьевую.

Ежесуточно на протяжении всего эксперимента контролировали потребление корма и жидкости животными обеих групп, 1 раз в неделю животных взвешивали.

На 15-е сутки эксперимента животным опытной группы (n=40) массой тела 257±8 г однократно внутрибрюшинно делали инъекцию раствора СТЦ в дозировке 40 мгм на 1 кг массы тела. СТЦ растворяли в 0,1 М цитратном буфере, pH 4,4. Объем вводимого раствора не превышал 1 мл. Животным контрольной группы массой тела 250±5 г вводили внутрибрюшинно цитратный буфер [8].

На 22, 29 и 36-е сутки эксперимента у всех животных отбирали кровь из хвостовой вены для определения уровня глюкозы в крови с помощью портативного электрохимического глюкометра ("ЭЛТА", РФ).

На 37-е сутки по результатам определения содержания глюкозы в крови отбирали животных с уровнем глюкозы не менее 11,0 ммоль/л для проведения дальнейшего эксперимента. Выбракованных животных подвергали декапитации под легким эфирным наркозом.

На 44-е и 60-е сутки производили забор крови из хвостовой вены животных всех групп для определения глюкозы. На 70-е сутки эксперимента животных выводили из эксперимента декапитацией под легким эфирным наркозом. У них отбирали кровь, часть из которой непосредственно в пробирку с заранее добавленным антикоагулянтом для определения гликированного гемоглобина. Измерение его концентрации осуществляли в течение 10 сут после отбора крови с использованием коммерческого набора "Гликогемотест" ("ЭЛТА", РФ). Оставшуюся кровь центрифугировали в течение 15 мин при 3000 об/мин, отбирали сыворотку и хранили при -20 °С. В сыворотке крови на автоматическом анализаторе "Konelab 20i" ("Thermo Scientific", Финляндия) определяли содержание триглицеридов, холестерина, липопротеинов высокой (ЛПВП) и низкой плотности (ЛПНП).

В ходе эксперимента дополнительно оценивали некоторые физиологические параметры в тестах "Приподнятый крестообразный лабиринт" и "Беговая дорожка".

Уровень тревожности животных в тесте "Приподнятый крестообразный лабиринт" оценивали на 14-е сутки эксперимента (за день до введения СТЦ) и на 37-е сутки после формирования группы диабетических животных для сравнительной оценки уровня тревожности животных опытной группы с крысами контрольной группы. Перемещение крыс регистрировали при помощи специализированной системы видеонаблюдения "Smart 3.0.04" ("Panlab Harvard Apparatus", Испания). Животное помещается в центр установки, в место пересечения "рукавов" платформы.

Предполагается, что оно будет стремиться к исследованию незнакомого окружения, при этом вступая в борьбу с врожденным страхом открытого пространства, а также высоты (на открытых плечах). Время пребывания крысы в лабиринте составило 5 мин. Система "Smart" фиксировала количество переходов из одной зоны в другую, процент посещения зон, время, проведенное в рукавах [9].

Беговую нагрузку моделировали, используя 5-полосную беговую дорожку "Treadmill LE8710R" ("Panlab Harvard Apparatus", Испания) с регулируемой скоростью и наклоном. В ходе эксперимента животных принуждали к бегу воздействием электрического тока при помощи электрода, помещенного на нижнем конце дорожки на электрической решетке (сила тока может варьировать от 0 до 2 мА). Измеряемые параметры - общая протяженность пройденного расстояния, полное время шока для каждого животного, количество контактов с электрической решеткой. Система включает программное обеспечение "SeDaCom" (Испания), позволяющее не только выводить результаты на экран компьютера, но и контролировать ход эксперимента. На 37-е сутки эксперимента животные контрольной группы и животные опытной группы с индуцированным СТЦ СД 2 типа преступили к тренировкам на беговой дорожке. Животных подвергали физической нагрузке через каждые 2 дня на протяжении 30 сут. Продолжительность тренировки составляла 10 мин. Минимальная скорость движения ремня беговой дорожки - 8 см/c, максимальная - 17 см/с. Минимальную и максимальную скорости постепенно увеличивали до соответственно 16 и 20 см/с, угол наклона беговой дорожки всегда был равен нулю [10].

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета программ "SPSS Statistics 20", используя непараметрический ранговый критерий Манна-Уитни и критерий Стьюдента. Критический уровень значимости нулевой статистической гипотезы (p) принимали равным 0,05.

Результаты

Общее состояние всех животных по внешнему виду, качеству шерстного покрова, поведению и скорости роста при ежедневном осмотре на протяжении первых 2 нед эксперимента не отличалось. Прирост массы тела животных контрольной и опытной групп за первые 2 нед эксперимента достоверно между группами не различался, составил соответственно 28,4±3,4 и 28,6±1,9% и соответствовал скорости роста, характерной для животных данного вида и возраста.

Было отмечено достоверно более высокое потребление раствора фруктозы животными опытной группы (74,1±4,0 мл/сут) по сравнению с животными контрольной группы, получавшими воду (47,5±0,6 мл/сут). Животные опытной группы достоверно меньше потребляли корм (19,1±1,2 г/сут) по сравнению с животными контрольной группы (28,4±0,6 г/сут).

На 15-е сутки эксперимента масса тела животных контрольной группы составила 250±5 г и достоверно не отличалась от массы тела опытных животных (257±8 г).

На рис. 1 приведен график изменения массы тела животных обеих групп за 3-недельный промежуток времени после инъекции СТЦ (опытная группа) или воды (контрольная группа). Не было выявлено достоверных изменений массы тела животных опытной группы по сравнению с крысами контрольной группы.

После введения СТЦ проводили мониторинг уровня глюкозы, на рис. 2 приведена динамика изменения содержания глюкозы в крови животных контрольной и опытной групп на 22, 29 и 36-е сутки после введения инъекции.

На 22-е сутки эксперимента, через 7 сут после введения СТЦ по результатам измерения глюкозы крови животных было выявлено, что у 50% животных (20 из 40 животных) уровень глюкозы был выше 11 ммоль/л, таких животных принято относить к диабетическим. Различная индивидуальная чувствительность крыс к индукции гипергликемии путем введения СТЦ, сочетающегося с потреблением рациона с высоким содержанием фруктозы, проявилась в том, что только у половины животных уровень глюкозы в крови превысил 11 ммоль/л. Полученный результат качественно согласуется с данными ряда публикаций [11, 12, 14, 16]. К 29-м суткам эксперимента уровень глюкозы выше 11 ммоль/л был отмечен у 15 из 40 животных, к 36-м суткам количество животных с концентрацией глюкозы крови выше 11 ммоль/л составило 13 из 40 животных. Тенденция к снижению уровня глюкозы после 3 нед с момента введения СТЦ также отмечалась другими исследователями [13, 15, 16].

По результатам измерения концентрации глюкозы в крови животных на 37-е сутки из эксперимента было выведено 27 (67,5%) из 40 животных опытной группы, уровень глюкозы у которых был ниже 11 ммоль/л. 13 животных с уровнем глюкозы не менее 11,0 ммоль/л отобрали для проведения дальнейших экспериментов. Эти крысы составили 2-ю опытную группу животных с индуцированным СД 2 типа с массой тела 275±5 г и уровнем глюкозы крови 16,2±1,3 ммоль/л. Масса тела животных контрольной группы (n=10) составила 308±7 г, уровень глюкозы крови - 6,6±0,4 ммоль/л, оба показателя статистически достоверно отличались от соответствующих показателей 2-й опытной.

В табл. 1 представлены результаты определения глюкозы крови на 44-е и 60-е сутки эксперимента.

Уровень глюкозы крови в оба срока у 2-й опытной группы был статистически достоверно выше данного показателя у животных контрольной группы. Следует отметить, что концентрация глюкозы у 2-й опытной группы на 44-е сутки не отличалась достоверно от данного показателя на 60-е сутки, что говорит об относительной устойчивости вызванной введением СТЦ гипергликемии.

На 70-е сутки эксперимента масса тела животных 2-й опытной группы составила 295±9 г, что статистически достоверно ниже массы тела животных контрольной группы (335±9 г, р0,05). В табл. 2 представлена относительная масса органов животных обеих групп.

Относительная масса печени и почек у животных с индуцированным СТЦ СД 2 типа была достоверно увеличена по сравнению с животными контрольной группы.

В табл. 3 представлены результаты определения показателей липидного обмена. Как видно из представленных данных, статистических различий параметров для обеих групп не обнаружено.

Уровень гликированного гемоглобина в сыворотке крови животных 2-й опытной группы с индуцированным СД 2 типа был достоверно выше по сравнению с контрольными животными (рис. 3), что подтверждает длительную и достаточно устойчивую гипергликемию, так как концентрация гликированного гемоглобина в крови отражает содержание глюкозы в крови за длительный период.

На воспроизведенной модели СД 2 типа, вызванной введением СТЦ и кормлением высокоуглеводным рационом, нами были получены результаты, характеризующие уровень тревожности и физическую выносливость тестируемых крыс.

Не выявлено достоверных различий уровня тревожности животных обеих групп до введения СТЦ.

Время, проведенное в закрытых рукавах лабиринта, для контрольной и опытной групп составило соответственно 207,0±18,2 и 206,2±12,0 с, в открытых рукавах лабиринта - соответственно 32,8±6,7 и 34,6±7,7 с и в центре лабиринта - соответственно 40,5±3,0 и 39,8±4,6 с. Различия между группами недостоверны.

На 37-е сутки эксперимента проводили повторное тестирование на крестообразном приподнятом лабиринте для сравнительной оценки влияния введения СТЦ в дозе 40 мг на 1 кг массы тела животных на поведение и уровень тревожности животных с индуцированным СТЦ диабетом по сравнению с животными контрольной группы.

На рис. 4 отражено среднее время, проведенное в закрытых, открытых рукавах и в центре лабиринта для контрольной и 2-й опытной групп.

Полученные данные свидетельствовали о повышенном уровне тревожности животных с индуцированным СТЦ диабетом по сравнению с контрольными животными.

Результаты тренировок на беговой дорожке показали достоверно более высокий уровень физической выносливости у животных контрольной группы по сравнению с животными с индуцированным СД 2 типа, о чем свидетельствовали данные об изме- рении среднего количества контактов с токовой решеткой. Результаты представлены на рис. 5.

На протяжении всех тренировок различия, наблюдаемые у опытной группы животных по сравнению с контрольной группой, достоверны согласно критерию Стьюдента и критерию Манна-Уитни (р≤0,05).

Выводы

1. В результате проведенного в течение 70 сут исследования in vivo была воспроизведена модель СД 2 типа при использовании крыс линии Вистар с индуцированной гипергликемией.

2. У животных с индуцированным диабетом выявлен повышенный уровень тревожности по сравнению с контрольными животными в тесте "Приподнятый крестообразный лабиринт".

3. Согласно результатам тренировок на беговой дорожке показан достоверно более низкий уровень физической выносливости у животных с индуцированным СД 2 типа по сравнению с животными контрольной группы.

4. Воспроизведенная модель может быть использована для предварительной экспериментальной оценки влияния тестируемых биологически активных веществ антидиабетического действия. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 14-36-00041)

Литература

1. Мазо В.К., Мурашев А.Н., Сидорова Ю.С., Зорин С.Н. и др. Генетические модели диабета типа 2 на крысах для оценки эффективности минорных биологически активных веществ пищи // Вопр. питания. 2014. Т. 83, № 6. С. 25-31.

2. Sos Skovso. Modeling type 2 diabetes in rats using high fat diet and streptozotocin // J. Diabetes Invest. 2014. Vol. 5, Issue 4. P. 349-358.

3. Aileen J.F. King The use of animal models in diabetes research // Br. J. Pharmacol. 2012. Vol. 166, N 3. P. 877-894.

4. Olatunji L.A., Okwusidi J.I., Soladoye A.O. Antidiabetic effect of anacardium occidentale stem-bark in fructose-diabetic rats // Pharm. Biol. 2005. Vol. 43, N 7. P. 589-593.

5. Potel J. Evaluation of the chronic complications of diabetes in a high fructose diet in rats // Indian J. Biochem. Biophys. 2009. Vol. 46. P. 66-72.

6. Zohreh Elahi-Moghaddam, Morteza Behnam-Rassouli, Naser Mahdavi-Shahri Comparative study on the effects of type 1 and type 2 diabetes on structural changes and hormonal output of the adrenal cortex in male Wistar rats // J. Diabetes Metab. Dis. 2013. Vol. 12. P. 9.

7. Wilson R.D. Fructose-fed streptozotocin-injected rat: аn alternative model for type 2 diabetes // Pharmacol. Rep. 2012. Vol. 64. P. 129-139.

8. Islam M.S., Wilson R.D. Experimentally induced rodent models of type 2 diabetes // Methods Mol. Biol. 2012. Vol. 933. P. 161-174.

9. Rodgers R.J., Cole J.C. The elevated plus-maze: pharmacology, methodology and ethology // Ethology and Psychopharmacology / eds S.J. Cooper, C.A. Hendrie. Chichester : John Wiley and Son Ltd, 1994. P. 9-44.

10. Rahmati M., Movahedin M. Treadmill training modifies KIF5B motor protein in the STZ-induced diabetic rat spinal cord and sciatic nerve // Arch. Iranian Med. 2015. Vol. 18, N 2. P. 94-101.

11. Srinivasan K., Viswanad B., Asrat L. et al. Combination of high-fat diet-fed and low-dose streptozotocin-treated rat: a model for type 2 diabetes and pharmacological screening // Pharmacol. Res. 2005. Vol. 52. P. 313-320.

12. Якимова Т.В., Насанова О.Н., Мелешко М.В., Буркова В.Н. Метаболические эффекты экстракта крапивы при модели сахарного диабета // Бюл. сибир. мед. 2011. № 5. С. 116-120.

13. Wilson R.D., Islam M.S. Fructose-fed streptozotocin-injected rat: an alternative model for type diabetes // Pharmacol. Rep. 2012. Vol. 64, N 1. P. 129-139.

14. Байрашева В.К. Моделирование сахарного диабета и диабетической нефропатии в эксперименте // Современные проблемы науки и образования. 2015. № 4. 11 с.

15. Doan Viet Binh, Nguyen Thi Kim Dung, Le Thi Bich Thao, Nguyen Bich Nhi, Phan Van Chi. Macro- and microvascular complications of diabetes induced by high-fat diet and low-dose streptozotocin injection in rats model // Int. J. Diabetes Res. 2013. Vol. 2, N 3. P. 50-55.

16. Kumar C., Kumar R., Nehar S. Induction of type-II diabetes by high fructose diet and low dose of intraperitoneal injection of streptozotocin in albino rats // Int. J. Pharm. Res. Scholar. 2014. Vol. 3, N 1-1. P. 196-202.