Toxicological evaluation of nanosized colloidal silver, stabilized with polyvinylpyrrolidone. I. Characterization of nanomaterial, integral, hematological parameters, level of thiol compounds and liver cell apoptosis

Abstract

Nano-sized colloidal silver (NCS) is currently one of the most widely used nanomaterials in medicine and consumer’s products. Nanoparticles (NPs) of silver, in addition to the direct exposition through products may expose human via various environmental objects. The aim of the study is to assess the safe doses of silver NP received orally. The investigated NCS contained silver NPs with diameter of 10–60 nm, predominantly with a nearly spherical form stabilized with polyvinylpyrrolidone (PVP). The experiment was performed during 92 days in 5 groups of male Wistar rats (n=15 in each group), receiving a balanced semisynthetic diet. Animal of group 1 (control) received vehicle (deionized water) intragastrically for 30 days and then with food, groups from 2nd to 4th – PVP and groups from 3rd to 5th NCS, in doses respectively, 0.1; 1.0 and 10 mg/kg body weight (b.w.) in terms of silver. The dose of PVP in groups from 2nd to 5th did not differ, amounting to 200 mg/kg b.w. During the experiment, the weight gain, skin condition, activity, stool, cognitive function were assessed. At the end of the feeding period weight of internal organs, intestinal wall permeability to protein macromolecules, liver thiols, standard values of blood erythrocytes, leukocytes and platelets, hepatocyte apoptosis by flow cytometry were studied. These results suggest that in terms of weight gain, lung relative mass, average erythrocyte volume, hemoglobin content and concentration in erythrocytes, the relative proportion of lymphocytes and neutrophils adverse changes have been observed at a dose of 10 mg NPs per kg of b.w. At lower levels of exposure (0.1 and 1.0 mg/kg b.w.) some specific changes were also observed (in terms of thiols pool in liver, cognitive function, relative abundance of monocytes, the number of dead hepatocytes), which, however, did not possess an unambiguous dependence on the dose. Possible mechanisms of the toxic action of the NCS have been discussed.

Keywords:silver, nanoparticles, toxicity, rats, hematology, apoptosis

Вопр. питания. 2015. № 6. С. 46-57.

Наноразмерное коллоидное серебро (НКС) в настоящее время - один из наиболее широко применяющихся в медицине и быту продуктов нанотехнологий [1]. Области его использования включают медицинские препараты, перевязочные материалы, дезинфицирующие средства, лакокрасочную продукцию, текстиль, фильтры для воды, упаковочные материалы, косметическую продукцию, биологически активные добавки к пище [2-4]. Годовой объем производства НКС в 2011 г. в мире превысил 500 т в пересчете на серебро [5]. В Российской Федерации по состоянию на 2015 г. зарегистрировано 132 наименования потребительской продукции, содержащей наночастицы (НЧ) серебра, из которой преобладающую долю (90 видов) составляют косметические изделия. Помимо непосредственного воздействия в составе продукции, НЧ серебра могут экспонировать население через различные объекты окружающей среды, куда они поступают в результате утилизации содержащих НКС материалов и изделий. Так, при их сжигании на мусороперерабатывающих предприятиях большая часть НЧ серебра накапливается в золе и шламах систем очистки сточных вод [5, 6], откуда может поступать на поля в составе удобрений, смываться в водоемы и накапливаться в различных водных и почвенных организмах [5]. Предполагается, что население в целом подвергается экспозиции НЧ серебра преимущественно при пероральном и эпикутанном пути поступления [7], тогда как для работников предприятий, выпускающих продукцию с НКС, преобладает ингаляционная экспозиция [8].

При этом известно, что, помимо широко известного антимикробного действия [9], НКС обладает токсическими эффектами в отношении клеток эукариот в культуре [10-13], водных и почвенных организмов [13, 14], лабораторных животных при ингаляционном [15, 16], эпикутанном [17] и пероральном [18-21] введении. Механизм нанотоксичности серебра, по современным представлениям, состоит в их способности проникать через биологические барьеры организма [22], накапливаться в клетках и высвобождать в них в высоких локальных концентрациях ионы Ag+ под действием окислителей [23, 24], в том числе эндогенных. Этот механизм действия получил в литературе название "эффекта троянского коня" [25]. Одновалентное серебро является клеточным ядом ввиду его способности необратимо ингибировать ферменты и мембранные транспортеры, содержащие тиоловые группы [14]. Применительно к НЧ серебра оценки их токсических доз для млекопитающих противоречивы [13], что может быть обусловлено различиями в размерах частиц, составе покрытия их поверхности, недостаточной длительностью экспериментов и ограниченным набором изучаемых биомаркеров токсичности.

Среди выпускаемых в настоящее время материалов, содержащих НЧ серебра, наибольший практический интерес представляет НКС, стабилизированное поливинилпирролидоном (ПВП). Преимуществами этого стабилизатора являются его высокая эффективность в сочетании с низкой токсичностью для человека (ПВП является разрешенной пищевой добавкой Е1201, а также безопасно используется в составе инфузионных растворов - кровезаменителей). Данная статья является первой в цикле работ, цель которых - оценка безопасных доз НКС, стабилизированного ПВП, при введении в желудочно-кишечный тракт крыс в 92-дневном эксперименте с использованием методических указаний по оценке безопасности наноматериалов, действующих в Российской Федерации [26].

Материал и методы

Исследованный раствор НКС ("кластерного серебра") "Арговит-С" по ТУ 9310-03-79044259-12 был предоставлен фирмой ООО НПЦ "Вектор-Вита" (Авторы благодарят кандидата химических наук В.А. Бурмистрова за предоставленный для исследования образец коллоидного серебра.) (г. Новосибирск, РФ). По своим физико-химическим свойствам НКС представляло собой однородную жидкость коричневого цвета (в проходящем свете) с зеленовато-серым оттенком (в отраженном свете) и небольшой опалесценцией. Длина волны максимума поглощения в видимой области составляла λ=403,2 нм. Стабилизатор ПВП в продукте содержался в количестве 19% по массе.

Определение общего содержания серебра в продукте проведено методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой на приборе "Agilent 7700х" ("Agilent", Япония) после микроволнового разложения в концентрированной азотной кислоте с перекисью водорода согласно МР 1.2.2641-10. Характеристика степени дисперсности серебра в образце выполнена в соответствии с МР 1.2.2641-10 методом трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) на приборе "JEOL JEM-100CX" ("JEOL", Япония) при ускоряющем напряжении 80 кB, а также методом динамического лазерного светорассеяния на анализаторе частиц "Nanotrack Wave" ("Microtrac Inc.", США).

Эксперимент проведен на 75 крысах-самцах линии Вистар исходной массой 80±10 г, полученных из питомника РАН "Столбовая". На протяжении всего эксперимента животные получали сбалансированный полусинтетический рацион согласно МУ 1.2.2520-09. Крыс размещали в клетках группами по 3 особи, рацион и воду предоставляли в режиме свободного неограниченного доступа.

В начале эксперимента животные были случайным образом разделены на 5 групп равной численности (по 15 крыс), совпадающих по исходной средней массе тела. Животные 1-й (контрольной) группы получали деионизованную воду, крысы 2-й группы - носитель ПВП в виде водного раствора. Крысы с 3-й по 5-ю группу получали раствор НКС в дозе соответственно 0,1; 1 и 10 мг на 1 кг массы тела в пересчете на серебро. Животные 3-й и 4-й групп дополнительно получали ПВП в количестве, соответствующем его поступлению с препаратом НКС в 5-й группе. Доза ПВП в группах животных со 2-й по 5-ю не различалась, составляя 200 мг на 1 кг массы тела.

В течение первых 30 сут введение всех тестируемых препаратов и деионизованной воды осуществляли внутрижелудочно через зонд, а на протяжении последующих 62 сут НКС и ПВП добавляли к корму животных; дозу при этом рассчитывали исходя из количества фактически потребленного рациона. В ходе эксперимента крыс ежедневно взвешивали на электронных весах с точностью ±1 г, фиксировали заболеваемость, летальность, внешний вид, активность, состояние шерстяного покрова, стула, особенности поведения.

По истечении 60 сут эксперимента у 9-10 животных из каждой группы, выбранных случай- ным образом, исследовали закрепление условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ).

Методика тестирования была подробно описана ранее [27].

Выведение животных из эксперимента осуществляли на 93-и сутки путем обескровливания из нижней полой вены под эфирной анестезией.

За 3 ч до этого 8-9 крысам из каждой группы вводили внутрижелудочно через зонд раствор овальбумина куриного яйца (ОВА) в 0,15 М NaCl в дозе 3 г на 1 кг массы тела. Путем взвешивания на электронных весах с точностью ±0,01 г определяли абсолютную и относительную массу внутренних органов (печени, селезенки, семенников, сердца, почек, надпочечников, тимуса, легких, головного мозга); асептически отбирали 0,2 г ткани правой доли печени для изучения апоптоза и слепую кишку для изучения состава кишечного микробиоценоза. Кровь отбирали дробно на антикоагулянт (0,01% по массе трикалиевой соли ЭДТА) для проведения биохимического и гематологического анализа и в стерильную сухую пробирку для отделения сыворотки. У части животных отбирали печень целиком, гомогенизировали ее в 0,1 М трис-HCl буфере рН 7,4, охлажденном до 0 - +2 оС в соотношении 1:4 по массе. Содержание в печени небелковых тиолов определяли спектрофотометрическим методом с 5,5’-дитиобис-2-нитробензойной кислотой (реактив Эллмана), как указано в [27].

Оптическую плотность измеряли при длине волны 405 нм на планшетном фотометре "ЭФОС 96 05" ("Сапфир", Россия).

Всасывание в кишке макромолекул ОВА оценивали по его содержанию в сыворотке крови, которую определяли с помощью твердофазного двухвалентного иммуноферментного теста на полистироле согласно [28] с незначительными модификациями. Величину всасывания ОВА в % от введенной дозы в расчете на всю кровь рассчитывали исходя из предположения, что масса крови крысы составляет 6% от массы тела при гематокрите около 40%.

Гематологические показатели (количество эритроцитов, лейкоцитов, концентрацию гемоглобина, гематокрит, средний объем эритроцита, среднее содержание гемоглобина в эритроците, среднюю концентрацию гемоглобина в эритроците, содержание тромбоцитов, средний объем тромбоцита, тромбокрит, лейкоцитарная формула) определяли стандартными методами на гематологическом анализаторе "Coulter AC TTM 5 diff OV" ("Beckman Coulter", США) со стандартным набором реагентов ("Beckman Coulter", Франция). Апоптоз клеток печени изучали на проточном цитофлуориметре "FC 500" ("Beckman Coulter International S.A.", Австрия) с использованием технологии окрашивания гепатоцитов в суспензии флюоресцентными реагентами FITC-аннексином V и 7-аминоактиномицином (7-AAD). Принцип метода был подробно рассмотрен ранее в работах [29, 30].

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета SPSS 18.0 согласно критерию Стьюдента, непараметрическим критериям Манна-Уитни, χ2 и критерию ANOVA. Различия признавали достоверными при уровне значимости р<0,05.

Результаты

Как показало исследование методом ТЭМ образца НКС, высушенного на сеточке в разведении 1:5, в составе препарата выявлялись НЧ высокой электронной плотности, с четкими контурами, преимущественно округлой или эллипсоидной формы, и отдельные частицы треугольной формы, принадлежащие к размерным фракциям с диаметром менее 5, 10-20 и 50-80 нм (рис. 1а, б). В результате слипания НЧ при высушивании препарата образовывались агрегаты с довольно низкой компактностью частиц разной формы и размера. Единичные НЧ в составе агрегатов были хорошо различимы, значительная часть поверхности практически каждой НЧ оставалась доступной для контакта с окружающей средой. Для подтверждения того, что обнаруженные НЧ являлись частицами серебра, были сняты их электронограммы. Дифракционные максимумы большого количества НЧ, отличающихся по форме, располагались на характерных изображениях концентрических окружностей, соответствующих по взаимному расположению стандартным препаратам серебра с подтвержденным химическим составом. Индивидуальные частицы серебра с диаметром >100 нм в препарате практически отсутствовали. Анализ образца методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой показал, что общее содержание серебра в нем составляло 10,09±0,04 мг/см3.

По данным динамического лазерного светорассеяния, образец НКС характеризовался бимодальным распределением частиц по размерам, с локальными максимумами числа частиц в пределах диаметров 14,1±9,9 и 50,1±40,3 нм (M±s.d.) (рис. 1в). 10-й перцентиль распределения числа НЧ составлял 10,6 нм, 90-й - 61,8 нм. Содержание частиц с диаметром >100 нм составляло менее 1,5%. Таким образом, по данным исследования тремя независимыми методами, изучаемый образец НКС являлся наноматериалом, характеристики которого совпадали с заявленными в нормативно-технической документации на данный продукт.

На протяжении эксперимента отмечена гибель 4 крыс в 5-й группе: 3 животных на протяжении 1-го месяца введения НКС и 1 крысы - в начале 3-го месяца. Вскрытие всех павших животных показало, что непосредственной причиной гибели животных была двусторонняя пневмония. Остальные животные всех опытных и контрольной групп по своему внешнему виду, состоянию шерстяного покрова и слизистых оболочек, двигательной активности, поведению не отличались от животных контрольной группы, имели нормальный стул. Скорость прироста массы тела, как следует из данных рис. 2, на протяжении первых 86 дней опыта практически не различалась во всех группах животных, однако к завершению эксперимента (на 92-й день) у выживших животных 5-й группы отмечалось небольшое (на 7%), но достоверное (p1-5<0,05) увеличение средней массы тела в сравнении с 1-й группой (рис. 2, табл. 1).

Тестирование когнитивной функции животных по методу УРПИ показало (табл. 2), что все животные всех групп при первом тестировании зашли в темный отсек камеры, где получили раздражение электрическим током на кожу лап. При втором тестировании (через 48 ч) рефлекс закрепился у 80-90% животных во всех группах, различия были недостоверными. При третьем тестировании (через 14 сут) отмечена достоверно меньшая степень сохранения УРПИ у крыс 4-й группы, получавшей НЧ серебра в дозе 1 мг на 1 кг массы тела по сравнению с животными контрольной группы (p1-4<0,05, критерий χ2). В 5-й группе подобное изменение было недостоверным, т.е. четкой зависимости показателя от дозы НЧ не прослеживалось.

Тем не менее есть основания полагать, что НЧ серебра, поступающие в желудочно-кишечный тракт, могут неблагоприятно повлиять на когнитивную функцию.

Результаты определения относительной массы внутренних органов, представленные в табл. 1, показывают, что на 93-й день эксперимента масса легких у животных 5-й группы была достоверно снижена по сравнению со 2-й группой, получавшей носитель ПВП (p2-5<0,05). Относительная масса остальных изученных органов практически не различалась у животных всех опытных и контрольной группы.

Как следует из данных рис. 3, всасывание в кровь антигенного ОВА было достоверно повышено у животных, получавших ПВП (2-я группа), по сравнению с контролем. При этом всасывание в кровь белкового антигена у животных 3-5-й групп не отличалось достоверно от крыс 1-й и 2-й групп, что указывает на отсутствие влияния на барьерную функцию кишки со стороны НЧ серебра в изученном интервале доз. Следует отметить, что во всех группах животных поступление антигенных макромолекул в кровь было очень низким (менее 2×10-5% от введенной дозы), что типично для животных данного возраста и, по-видимому, соответствует во всех случаях физиологической норме [31, 32].

На рис. 4. приведены результаты определения содержания в печени небелковых тиоловых соединений в пересчете на восстановленный глутатион. При этом наблюдается довольно выраженное (на 13%) и достоверное снижение этого показателя в 4-й группе животных при дозе НЧ серебра 1 мг на 1 кг массы тела (p1-4<0,05). Однако при максимальной дозе НКС (5-я группа) данный эффект не подтверждается. Таким образом, однозначная зависимость уровня небелковых тиолов от вводимой дозы наноматериала не установлена.

При оценке состояния эритроцитов (табл. 3) следует отметить, что в группах крыс, получавших НЧ серебра (3-5-я), отмечается достоверное повышение количества эритроцитов, причем в 5-й группе и по сравнению с животными, получавшими ПВП (p2-5<0,05). Одновременно в этих же группах выявлено повышение концентрации гемоглобина, однако факторный анализ указывает на неспецифический характер этого эффекта, зависящего только от приема ПВП. То же относится и к увеличению гематокрита, которое наблюдалось во всех опытных группах животных в сравнении с контролем. Средний объем эритроцита был достоверно снижен при всех дозах НЧ серебра в сравнении с животными, получавшими ПВП (2-я группа), однако во всех случаях оставался в пределах физиологической нормы, характерной для животных контрольной группы (p1-3,1-4,1-5>0,05). Однако факторный анализ указывает на влияние приема НЧ на этот по- казатель. Среднее содержание гемоглобина в эритроците было достоверно снижено в 3-5-й группах в сравнении со 2-й группой, причем при наибольшей дозе НЧ и по сравнению с 1-й группой (p1-5<0,05), что подтверждается и факторным анализом (p<0,05, ANOVA, по фактору НЧ). Концентрация гемоглобина в эритроците была достоверно снижена во всех опытных группах по сравнению с контролем, а в 4-й и 5-й группах и по сравнению с животными, получавшими ПВП (2-я группа). Однако абсолютная величина изменения данного показателя невелика и составляет максимум 2,6% в 5-й группе. Можно предположить, что прием НЧ серебра в дозах 0,1 и 1 мг на 1 кг массы тела оказывает минимальное воздействие на эритроциты животных, а в дозе 10 мг на 1 кг массы тела эффект уже достаточно выражен.

Как следует из табл. 4, показатели тромбоцитов животных, получавших НЧ серебра в дозах 0,1 и 1 мг на 1 кг массы тела, достоверно не отличались от контроля и от значений для крыс, получавших ПВП. Однако при дозе 10 мг на 1 кг массы тела (5-я группа) отмечается достоверное снижение среднего объема тромбоцита (в сравнении со 2-й группой) и тромбокрита (в сравнении с 1-й группой).

Показатели лейкоцитарной формулы крови животных 1-5-й групп (табл. 5) имеют разнонаправленные изменения. Общее количество лейкоцитов достоверно снижалось под действием приема ПВП, тогда как зависимость от дозы НЧ серебра не прослеживалась. При наибольшей дозе НЧ серебра (5-я группа) отмечено достоверное и значительное (более чем в 2 раза) снижение относительного количества нейтрофилов и увеличение (на 19-20%) относительного числа лимфоцитов, причем этот эффект был достоверным при сравнении как с 1-й, так и со 2-й группой. Отмечался также рост процентного содержания моноцитов в 4-й группе в сравнении с контролем, однако четкой зависимости от дозы НЧ при этом не выявлено.

Достоверные изменения в относительном содержании эозинофилов во всех группах животных отсутствовали.

Таким образом, анализ гематологических показателей показывает, что наиболее выраженные и достоверные изменения ряда параметров (количество эритроцитов, содержание и концентрация гемоглобина в эритроците, средний объем тромбоцита, тромбокрит, количество нейтрофилов и лимфоцитов) характерны для животных 5-й группы, получавшей НЧ серебра в дозе 10 мг на 1 кг массы тела. Имеющиеся изменения при меньших дозах наноматериала невелики по абсолютной величине, укладываются в интервал колебаний физиологической нормы или являются неспецифическими (могут быть объяснены эффектами со стороны ПВП).

Результаты исследования апоптоза гепатоцитов методом проточной цитофлуориметрии (табл. 6) указывают на отсутствие влияния НЧ серебра на число живых клеток и клеток на ранней и поздней стадии апоптоза. Однако число погибших клеток, распознаваемых как AnV(-)7AAD(+), оказалось достоверно повышенным во всех группах крыс, получавших НЧ серебра как по сравнению с контролем, так и с животными, получавшими ПВП.

Обсуждение

Многочисленные исследования последних лет свидетельствуют о наличии у НЧ серебра различных размеров и с разным составом веществ, адсорбированных на поверхности, токсических свойств при ингаляционном и эпикутанном введении лабораторным животным [13, 15-17]. Основными органами-мишенями при этих путях поступления НЧ были печень, легкие и селезенка.

При 28-дневном пероральном введении НЧ серебра крысам в дозах 125 мг на 1 кг массы тела и выше отмечалось токсическое воздействие на печень [20]. У мышей при подостром (14-28-дневном) пероральном введении НЧ серебра в дозах свыше 1 мг на 1 кг массы тела происходили гистопато- логические изменения в печени и почках [21]. При этом, согласно данным [19], эти НЧ при пероральном введении не обладали репродуктивной токсичностью. В работе [18] в результате 28-дневного введения НКС, стабилизированного ПВП, самцам крыс Вистар, имевшим возраст около 1 мес в начале эксперимента, отмечалось снижение уровня глюкозы натощак, повышение макромолекулярной проницаемости кишки, ингибирование развития симбиотической кишечной микрофлоры. В числе других возможных эффектов НЧ серебра при их поступлении в организм заслуживает упоминания их воздействие на систему тромбоцитов [33]. Существующие в литературе расхождения в оценке пороговых доз (NOAEL и LOAEL) и проявлений токсического действия связаны как с различными характеристиками применявшихся НЧ (размер, покрытие поверхности), так и с несовпадающими интервалами тестируемых доз и длительностью введения.

Результаты, полученные в данной работе, применительно к выпускаемому в промышленных масштабах НКС, стабилизированному ПВП, с размером частиц в интервале 10-60 нм, свидетельствуют, что по целому ряду показателей (прибавка массы тела, относительная масса легких, средний объем эритроцита, содержание и концентрация гемоглобина в эритроцитах, количество нейтрофилов и лимфоцитов) отмечаются неблагоприятные сдвиги при дозе НЧ 10 мг на 1 кг массы тела. При меньших уровнях воздействия (0,1 и 1 мг на 1 кг массы тела) также отмечаются отдельные изменения (в содержании тиоловых соединений в печени, когнитивной функции, количестве моноцитов), которые, однако, не обладают однозначной зависимостью от дозы.

Влияние НЧ серебра на проницаемость кишечной стенки в отношении макромолекул ОВА в данном исследовании в отличие от работы [18] не обнаружено, вероятно, вследствие того, что тестирование проводилось на взрослых животных (возраст к концу эксперимента - около 4 мес), у которых барьерная функция кишки была полностью созревшей [31, 33].

Отдельно следует остановиться на эффекте возрастания числа мертвых гепатоцитов в печени животных, подвергавшихся воздействию НЧ начиная с 0,1 мг на 1 кг массы тела, что может свидетельствовать о гепатотоксическоом эффекте НЧ даже при таких низких дозах. Однако данное явление не сопровождалось значимым изменением в параметрах апоптоза у этих животных, к тому же показатель числа мертвых клеток обладает, по-видимому, определенной вариабельностью в пределах нормы. Так, в ранее проведенных исследованиях у контрольных животных, получавших сбалансированные по макро- и микронутриентам рационы, он составлял 0,25±0,16 [34], 0,67±0,25 [29] и даже 0,94±0,13% [30]. Ввиду этого обнаруженные нами изменения числа мертвых клеток в пределах 0,3-0,5% не могут однозначно рассматриваться как свидетельства токсического действия на печень при использованных дозах НКС.

По совокупности полученных результатов можно заключить, что НЧ серебра размером 10-60 нм, стабилизированные ПВП, при ежедневном введении в желудочно-кишечный тракт крыс в течение 92 дней вызывают достоверные изменения ряда изученных интегральных и гематологических показателей организма животных в интервале доз 1-10 мг на 1 кг массы тела.

Литература

1. Rezic I. Determination of engineered nanoparticles on textiles and in textile wastewaters // Trends Anal. Chem. 2011. Vol. 30, N 7. P. 1159-1167.

2. Blaser S.A., Scheringer M., MacLeod M., Hungerbuhler K. Estimation of cumulative aquatic exposure and risk due to silver: contribution of nano-functionalized plastics and textiles // Sci. Total Environ. 2008. Vol. 390, N 2-3. P. 396-409.

3. Marambio-Jones C., Hoek E.M.V. A review of the antibacterial effects of silver nanomaterials and potential implications for human health and the environment // J. Nanopart. Res. 2010. Vol. 12, N 5. P. 1531-1551.

4. Savage N., Diallo M.S. Nanomaterials and water purification: opportunities and challenges // J. Nanopart. Res. 2005. Vol. 7, N 4-5. P. 331-342.

5. Fabrega J., Luoma S.N., Tyler C.R., Galloway T.S. et al. Silver nanoparticles: behaviour and effects in the aquatic environment // Environ. Int. 2011. Vol. 37, N 2. P. 517-531.

6. Vejerano E.P, Leon E.C., Holder A.L., Marr L.C. Characterization of particle emissions and fate of nanomaterials during incineration // Environ. Sci. Nano. 2014. Vol. 1, N 2. P. 133-143.

7. Hansen S.F., Michelson E.S., Kamper A., Borling P. et al. Categorization framework to aid exposure assessment of nanomaterials in consumer products // Ecotoxicology. 2008. Vol. 17, N 5. P. 438-447.

8. Christensen F.M., Johnston H.L., Stone V., Aitken R.J. et al. Nanosilver - feasibility and challenges for human health risk assessment based on open literature // Nanotoxicology. 2010. Vol. 4, N 3. P. 284-295.

9. Sheehy K., Casey A., Murphy A., Chambers G. Antimicrobial properties of nano-silver: a cautionary approach to ionic interference // J. Colloid. Interface Sci. 2015. Vol. 443, N 1. P. 56-64.

10. Gliga A.R., Skoglund S., Wallinder I.O., Fadeel B., Karlsson H.L.. Size-dependent cytotoxicity of silver nanoparticles in human lung cells: the role of cellular uptake, agglomeration and Ag release // Part. Fibre Toxicol. 2014. Vol. 11. P. 11.

11. Hussain S.M., Hess K.L., Gearhart J.M., Geiss K.T. et al. In vitro toxicity of nanoparticles in BRL 3A rat liver cells // Toxicol. in Vitro. 2005. Vol. 19, N 7. P. 975-983.

12. Powers C.M., Badireddy A.R., Ryde I.T., Seidler F.J. et al. Silver nanoparticles compromise neurodevelopment in PC12 cells: critical contributions of silver ion, particle size, coating, and composition // Environ. Health Perspect. 2011. Vol. 119, N 1. Р. 37-44.

13. Stensberg M.C., Wei Q., McLamore E.S., Porterfield D.M. et al. Toxicological studies on silver nanoparticles: challenges and opportunities in assessment, monitoring and imaging // Nanomedicine (Lond). 2011. Vol. 6, N 5. P. 879-898.

14. Lapresta-Fernandez A., Fernandez A., Blasco J. Nanoecotoxicity effects of engineered silver and gold nanoparticles in aquatic organisms // Trends Anal. Chem. 2012. Vol. 32, N 2. P. 40-59.

15. Sung J.H., Ji J.H., Park J.D., Yoon J.U. et al. Subchronic inhalation toxicity of silver nanoparticles // Toxicol. Sci. 2009. Vol. 108, N 2. P. 452-461.

16. Sung J.H., Ji J.H., Yoon J.U., Kim D.S. et al. Lung function changes in Sprague-Dawley rats after prolonged inhalation exposure to silver nanoparticles // Inhal. Toxicol. 2008. Vol. 20, N 6. P. 567-574.

17. Korani M., Rezayat S.M., Gilani K., Arbabi Bidgoli S. et al. Acute and subchronic dermal toxicity of nanosilver in guinea pig // Int. J. Nanomed. 2011. Vol. 6. P. 855-862.

18. Шумакова А.А., Смирнова В.В., Тананова О.Н., Трушина Э.Н. и др. Токсиколого-гигиеническая характеристика наночастиц серебра, вводимых в желудочно-кишечный тракт крыс // Вопр. питания. 2011. Т. 80, № 6. С. 9-18.

19. Hong J.S., Kim S., Lee S.H., Jo E. et al. Combined repeated-dose toxicity study of silver nanoparticles with the reproduction/developmental toxicity screening test // Nanotoxicology. 2014. Vol. 8, N 4. P. 349-362.

20. Kim Y.S., Kim J.S., Cho H.S., Rha D.S. et al. Twenty-eight-day oral toxicity, genotoxicity, and gender-related tissue distribution of silver nanoparticles in Sprague-Dawley rats // Inhal. Toxicol. 2008. Vol. 20, N 6. P. 575-583.

21. Park E.J., Bae E., Yi J., Kim Y., Choi K. et al. Repeated-dose toxicity and inflammatory responses in mice by oral administration of silver nanoparticles // Environ. Toxicol. Pharmacol. 2010. Vol. 30, N 2. P. 162-168.

22. Van der Zande M., Vandebriel R.J., Doren E.V., Kramer E. et al. Distribution, elimination, and toxicity of silver nanoparticles and silver ions in rats after 28-day oral exposure // ACS Nano. 2012. Vol. 6, N 8. P. 7427-7442.

23. Lubick N. Nanosilver toxicity: ions, nanoparticles - or both? // Environ. Sci. Technol. 2008. Vol. 42, N 23. P. 8617.

24. Xiu Z.M., Zhang Q.B., Puppala Y.L., Colvin V.L. et al. Negligible particle-specific antibacterial activity of silver nanoparticles // Nano Lett. 2012. Vol. 12, N 8. P. 4271-4275.

25. Choi O., Deng K.K., Kim N.J., Ross L. et al. The inhibitory effects of silver nanoparticles, silver ions, and silver chloride colloids on microbial growth // Water Res. 2008. Vol. 42, N 12. P. 3066-3074.

26. Онищенко Г.Г., Тутельян В.А., Гмошинский И.В., Хотимченко С.А. Развитие системы оценки безопасности и контроля наноматериалов и нанотехнологий в Российской Федерации // Гиг. и сан. 2013. № 1. С. 4-11.

27. Шумакова А.А., Арианова Е.А., Шипелин В.А., Сидорова Ю.С. и др. Токсикологическая оценка наноструктурного диоксида кремния. I. Интегральные показатели, аддукты ДНК, уровень тиоловых соединений и апоптоз клеток печени // Вопр. питания. 2014. Т. 83, № 3. С. 52-62.

28. Stuart C.A., Twistelton R., Nicholas M.K., Hide D.W. Passage of cow’s milk proteins in breast milk // Clin. Allergy. 1984. Vol. 14, N 6. P. 533-535.

29. Распопов Р.В., Трушина Э.Н., Гмошинский И.В., Хотимченко С.А. Биодоступность наночастиц оксида железа при использовании их в питании. Результаты экспериментов на крысах // Вопр. питания. 2011. Т. 80, № 3. С. 25-30.

30. Распопов Р.В., Трушина Э.Н., Мустафина О.К., Тананова О.Н. и др. Характеристика эффективности использования наночастиц оксида цинка в питании. Эксперименты на лабораторных животных // Вопр. питания. 2011. Т. 80, № 5. С. 39-44.

31. Мазо В.К., Морозов И.А.. Ширина Л.И. Всасывание белковых макромолекул в желудочно-кишечном тракте взрослых млекопитающих // Успехи физиол. наук. 1989. Т. 20, № 3. С. 65-85.

32. Udall J.N., Pang K., Fritze L., Kleinman R., Walker W.A. Development of gastrointestinal mucosal barrier. I. The effect of age on intestinal permeability to macromolecules // Pediatr. Res. 1981. Vol. 15, N 3. P. 241-244.

33. Shrivastava S., Bera T., Singh S.K., Singh G. et al. Characterization of antiplatelet properties of silver nanoparticles // ACS Nano. 2009. Vol. 3, N 6. P. 1357-1364.

34. Распопов Р.В., Арианова Е.А., Трушина Э.Н., Мальцев Г.Ю. и др. Характеристика биодоступности наночастиц нульвалентного селена у крыс // Вопр. питания. 2011. Т. 80, № 4. С. 36-41.