Methods quantitative for determination of water-soluble vitamins in premixes and fortified food products by micellar electrokinetic chromatography on short end of the capillary

AbstractIt was purposed new technique by micellar electrokinetic chromatography on short end of the capillary (capillary electrophoresis system Agilent 3D CE, DAD, quartz capillary HPCE stndrd cap 56 cm, 50 μm, 50 mM borate buffer pH=9,3, 100 mM sodium dodecil sulfate) for simultaneous determination of water-soluble vitamins (В1, В2, В6, В12, РР, В5, В9, С, В8) in fortified food products and premixes. It was observed on 6 samples of vitamin premixes and 28 samples of fortified food products using this technique. Our findings are consistent with the results of research on certain vitamins, conducted by other methods. The developed technique can be used in analysis of water-soluble vitamins in premixes and fortified food products.

Keywords:water-soluble vitamins, capillary electrophoresis, micellar electrokinetic chromatography

Согласно статистическим данным, до 30 % населения Российской Федерации испытывают недостаток в поступлении аскорбиновой кислоты (витамина С), более 60% недостаточно обеспечены витаминами группы В и каротиноидами [2, 3]. Это связано с сезонными изменениями состава пищевого рациона (например, неравномерным употреблением овощей и фруктов в разные времена года), хранением и технологической обработкой пищевых продуктов, условиями среды, труда и быта, индивидуальной особенностью организма и т.д.

При таких условиях для нормального функционирования организма возникает необходимость в восполнении дефицита витаминов в виде дополнительного приема обогащенных витаминами пищевых продуктов или биологически активных добавок к пище (БАД) и поливитаминных комплексов [2]. Для обогащения пищевых продуктов и БАД чаще всего используют сухие витаминные премиксы, в состав которых могут входить как водо-, так и жирорастворимые витамины. Анализ содержащих витамины БАД показал, что номенклатура этих БАД (по данным реестра Федеральной службы по надзору в сфере прав защиты потребителей и благополучия человека за 2005-2010 гг.) [22] увеличивается (см. рис. 1).

Рис. 1. Количество зарегистрированных БАД, содержащих витамины, за 2005-2010 гг.

В настоящее время наиболее часто в питании, особенно детском, используются обогащенные витаминами пищевые продукты - молочные и кисломолочные (молоко, творожки, йогурты, сухие и жидкие молочные смеси, молочно-фруктовые пюре), зерновые (каши, сухие завтраки, хлеб, хлебцы), напитки (безалкогольные, тонизирующие, кисели), специализированные продукты для спортсменов, специализированные продукты для энтерального питания.

В связи с расширением списка витаминных премиксов и обогащенных витаминами пищевых продуктов и БАД актуальным является проведение в них качественного и количественного контроля витаминов. В настоящее время существует несколько официальных методов определения содержания лишь отдельных витаминов. К этим методам прежде всего относятся титрование, спектрофотометрия, полярография, флуорометрия, фотоэлектроколориметрия, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) (см. табл. 1).

Таблица 1. Сравнительный анализ методов количественного определения водорастворимых витаминов в пищевых продуктах, премиксах и БАД к пище, закрепленных в нормативных документах РФ

Таблица 2. Методики определения водорастворимых витаминов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Из перечисленных методов только метод капиллярного электрофореза (КЭ), описанный в ГОСТ Р 52741-2007, позволяет в исследуемом образце определить одновременно 8 водорастворимых витаминов, но он может быть использован только для исследования этих витаминов в премиксах, а не пищевых продуктах и БАД.

Актуальной является разработка методики, которая позволила бы определить их содержание одновременно и в обогащенных пищевых продуктах, премиксах и БАД, уменьшая при этом затраты времени и средств на проведение исследований. В настоящее время для этих целей традиционно используются различные методики определения витаминов, основанные на методе ВЭЖХ (см. табл. 2) [4, 6, 9, 10, 12-15, 17, 19, 20].

Метод КЭ дополняет классические методы разделения, такие как ВЭЖХ и газовая хроматография (ГХ), являясь более дешевым (в плане проведения исследований), и способствует сокращению времени исследования. Метод основан на принципе разной скорости миграции заряженных частиц и молекул в постоянном электрическом поле. Выделяют следующие варианты КЭ: капиллярный зональный электрофорез (КЗЭ), мицеллярная электрокинетическая хроматография (МЭКХ), микроэмульсионная капиллярная электрокинетическая хроматография (МЭКЭКХ), капиллярная электрохроматография (КЭХ), капиллярный гель-электрофорез (КГЭ), капиллярная изоэлектрофокусировка (КИЭФ), капиллярный изотахофорез (КИТФ). По сравнению с другими разделяющими методами анализа, КЭ имеет ряд преимуществ [1]: он более экономичен, практически не требует дорогостоящих хроматографических колонок, а также использования дорогостоящих высокочистых растворителей (ацетонитрил, метанол, гексан).

КЭ, несмотря на небольшую историю своего применения для анализа различных групп биологически активных веществ, в том числе и витаминов в пищевых продуктах, БАД, воды и др., уже нашел широкое применение у нас в стране и за рубежом. Существуют различные варианты методик для исследования витаминного состава различных объектов пищевой и фармацевтической промышленности (см. табл. 3) [5, 7-9, 11, 16, 18, 21]. Проведение анализа на коротком конце капиллярановое направление в методе КЭ. С помощью такой техники выполнения анализа удается преодолеть затруднение, обусловленное неизбежным истощением носителей зарядов во флаконах с буферными растворами (часто наблюдаемый эффект при работе на длинном конце капилляра - классическая техника). Из-за такого истощения обнаруживаются нестабильность и невоспроизводимость результатов разделения, приходится часто заменять растворы, используемые в системе. Этот очевидный недостаток может затруднять выполнение серии анализов, повышает расход реактивов и требует непрерывного надзора оператора. Всего этого удается избежать, изменив для ввода пробы входной конец капилляра на выходной. Для этого необходимо внести небольшие изменения в условия разделения определяемых биологически активных веществ: поместить флакон с образцом под выходной конец капилляра (а не под входной), использовать гидродинамическое ведение процесса под воздействием вакуума (а не давления) и изменить полярность высокого напряжения.

Целью нашей работы является разработка методики качественного и количественного определения водорастворимых витаминов (тиамина хлорида гидрохлорид, рибофлавина, никотиновой кислоты и никотинамида, пантотеновой кислоты, пиридоксина гидрохлорида, фолиевой и аскорбиновой кислот, биотина) в витаминных премиксах и обогащенных витаминами пищевых продуктах с помощью мицеллярной электрокинетической хроматографии на коротком конце капилляра.

Таблица 3. Методики определения водорастворимых витаминов методом капиллярного электрофореза

Материал и методы

Для определения водорастворимых витаминов нами был использован метод мицеллярной электрокинетической хроматографии.

Электрофоретическое разделение проводили на системе капиллярного электрофореза Agilent 3D CE (Agilent, США) с диодно-матричным детектором, на кварцевом капилляре HPCE stndrd cap Lэфф/Lобщ=47,5/56 см (короткий конец - 8,5 см), ID=50 мкм; температура термостата - 25 °С; эффективное напряжение - 30 кВ. Общее время анализа - 5 мин. Детектирование проводили на волнах с длиной 210, 254, 270 и 292 нм. Снятие спектра проводили в диапазоне от 190 до 400 нм. Ввод пробы осуществляли гидродинамически (-50 мбар в течение 10 с).

Центрифугирование исследуемых образцов проводили на центрифуге Eppendorf 5418 (Eppendorf, Германия), встряхивание - на шейкере Biosan OS-10 (Biosan, Латвия), озвучивание - на УЗ ванне CTBRAND (Китай), нагревание - на водяной бане AiSet NF (Лабтех).

Для приготовления буфера применяли воду, очищенную на системе Milli-Q, а также натрий тетраборнокислый 10-водный марки "ч.д.а.", натрия додецилсульфат 98,5% (фирмы "Sigma"). Для приготовления исследуемых образцов использовали дистиллированную воду, калия гидроксид марки "х.ч.". Промывку капилляра проводили водой, очищенной на системе Milli-Q, 1,0 М и 0,1 М растворами натрия гидроксида фирмы "Agilent".

Для приготовления стандартных растворов использовали аскорбиновую кислоту (99,0%), никотиновую кислоту (99,5%), никотинамид (99,5%), пиридоксина гидрохлорид (99,0%), рибофлавин (98,0%), тиамина хлорид гидрохлорид (99,0%), фолиевую кислоту (97,0%), кальциеваую соль D-пантотеновой кислоты (99,0%), (+)-биотин (99,0%), производства "Fluka Chemie GmbH".

Рабочие стандартные растворы готовили следующим образом: 5, 10, 20, 40, 80 мг (точная навеска) указанных выше веществ помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляли туда около 30 мл воды очищенной (подщелоченной в случае фолиевой кислоты до рН=9,5-10,0 по лакмусу). Затем интенсивно встряхивали, при необходимости озвучивали на УЗ ванне до полного растворения вещества (нагревали в случае приготовления стандартного раствора рибофлавина). После этого объем раствора доводили до метки очищенной водой и перемешивали, затем фильтровали через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм. Приготовленные рабочие растворы хранили в течение 30 дней при температуре -18 С.

Объектами исследования служили 6 витаминных премиксов и 28 обогащенных витаминами пищевых продуктов (табл. 4).

Подготовку проб таблетированных, порошкообразных и твердых форм витаминных премиксов, а также порошкообразных и жидких форм обогащенных витаминами пищевых продуктов проводили следующим образом: 0,5-2,0 г (точная навеска для премиксов) и 5,0 г/5,0 мл (точная навеска/точный объем для обогащенных витаминами пищевых продуктов) образца помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, затем экстрагировали 30 мл очищенной воды, подщелоченной в случае фолиевой кислоты до рН=9,5-10,0 по лакмусу. После чего интенсивно встряхивали на шейкере в течение 10 мин. Для наилучшей экстракции рибофлавина приготовленные пробы нагревали на водяной бане в течение 10-15 мин.

Таблица 4. Процент открытия водорастворимых витаминов от заявленного количества в группах обогащенных пищевых продуктов и премиксах

Рис. 2. Электрофореграмма разделения витаминов в смеси стандартных рабочих растворов при длине волны 210 нм

Рис. 3. Электрофореграмма разделения витаминов в витаминном премиксе NUTR RU11620 при длине волны 210 нм

Далее доводили объем раствора образца до метки очищенной водой и перемешивали. Полученный раствор фильтровали через мембранный фильтр, размер пор которых был 0,45 мкм, или центрифугировали при 20 000 g в течение 10 мин. В тех случаях, когда образец содержал фолиевую кислоту, рибофлавин и другие водорастворимые витамины, пробы готовили в 3 вариантах: отдельно с подщелачиванием для экстракции фолиевой кислоты, отдельно с нагреванием на водяной бане для экстракции рибофлавина и отдельно для экстракции остальных водорастворимых витаминов.

Приготовленные пробы анализировали в течение суток.

Электрофоретическое разделение проводили следующим образом.

Для разделения водорастворимых витаминов использовали 50 мМ боратный буферный раствор рН 9,3, содержащий 100 мМ натрия додецилсульфата. Для его приготовления брали 1,91 г (точная навеска) натрия тетрабората десятиводного и 2,884 г натрия додецилсульфата, помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, добавляли 60 мл воды, очищенной на системе Milli-Q, встряхивали на шейкере в течение 5 мин, озвучивали на УЗ ванне до полного растворения. Далее доводили объем до метки водой, очищенной на системе Milli-Q. Полученный буферный раствор перемешивали и фильтровали через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм.

Перед работой новый капилляр последовательно промывали в течение 5 мин 1 М раствором натрия гидроксида, затем в течение 5 мин деионизированной водой и в течение 5 мин рабочим буфером. Между анализами для промывки капилляра использовали следующую схему: 3 мин 0,1 М раствором натрия гидроксида, 3 мин деионизованной водой и 3 мин рабочим буфером.

Детектирование водорастворимых витаминов проводили на фотодиодно-матричном детекторе при длинах волн 210, 254 и 292 нм (диапазон - 190-400 нм). Выбор длины волны объясняется специфичными максимумами их спектров поглощения. Витамины на электрофореграмме идентифицировали путем сравнения со стандартом по времени миграции и спектру в ультрафиолетовой (УФ) и видимой областях спектра. В качестве примера разделения водорастворимых витаминов в указанных условиях на рис. 2 и 3 приведена электрофореграмма смеси стандартных рабочих растворов и витаминного премикса.

Результаты и обсуждение

В процессе исследования нами были изучены различные варианты разделения и определения водорастворимых витаминов. Для этого сравнивали разделяющую способность 50 мМ фосфатного и 50 мМ боратного буферов, из которых более эффективным оказался боратный буфер. Также в ходе работы изучали влияние различных концентраций мицеллообразующего агента (натрия додецилсульфата) на разделяющую способность боратного буфера. Лучший результат был достигнут при добавлении 100 мМ натрия додецилсульфата. В итоге были подобраны наилучшие условия разделения и количественного определения водорастворимых витаминов методом МЭКХ (табл. 5). В подобранных условиях удалось быстро (в течение 5 мин) провести определение содержания водорастворимых витаминов в исследуемых образцах.

Разрешение разработанной методики составило не менее 1,5 (для аскорбиновой и пантотеновой кислот - 0,75). Предел обнаружения витаминов был в промежутке от 1,0 мг/кг (для рибофлавина) до 10,0 мг/кг (для фолиевой кислоты). Предел количественного определения находился в зоне от 4,0 мг/кг (для рибофлавина) до 30,0 мг/кг (для фолиевой кислоты). Это позволило уверенно проводить определение количества витаминов в большинстве витаминных премиксах и обогащенных витаминами пищевых продуктах. Оценку количественного содержания витаминов осуществляли методом абсолютной градуировки с построением калибровочной кривой по 5 точкам. Процент открытия витаминов в витаминных премиксах и пищевых продуктах, обогащенных витаминами, представлен в табл. 5 (процент открытия составил от 92,3 до 99,9%). Колебания процента открытия наблюдались для аскорбиновой и фолиевой кислот вследствие их неустойчивости к факторам окружающей среды.

Для оценки точности результатов разработанной методики была вычислена систематическая ошибка, которая составила не более 10%, а также установлена полуширина доверительного интервала (от 0,49% для никотинамида до 2,95% для пантотеновой кислоты). Воспроизводимость результатов оценивали по величине относительного стандартного отклонения (S), которая составила от 0,56% (для никотинамида) до 3,36% (для пантотеновой кислоты).

При помощи разработанной методики был исследован витаминный состав 6 премиксов и 28 обогащенных пищевых продуктов. Полученные результаты были подтверждены исследованиями, в которых использовали официальные методы определения витаминов (ВЭЖХ, спектрофотометрия). Для сравнения полученных данных были рассчитаны коэффициенты корреляции, величина которых составила от 0,9955 для рибофлавина до 0,9985 для пиридоксина гидрохлорида (сравнение с методом ВЭЖХ согласно Р.1.4.1672-03 "Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище"). На рис. 4 приведен пример сравнения результатов количественного определения водорастворимых витаминов разработанной методикой с помощью метода МЭКХ и методом ВЭЖХ согласно Р.1.4.1672-03.

Таблица 5. Условия разделения водорастворимых витаминов методом мицеллярной электрокинетической хроматографии

Рис. 4. Сравнение результатов количественного определения водорастворимых витаминов в витаминном премиксе методами МЭКХ и ВЭЖХ

Было выявлено, что КЭ обладает преимуществом при определении витаминов (особенно никотинамида и никотиновой кислоты) в премиксах и пищевых продуктах, в частности в молочных и кисломолочных. В то же время при применении ВЭЖХ, спектрофотометрии и флюориметрии это часто сделать не удается. К тому же подготовка образцов для исследования этими методами многоэтапна и занимает длительное время.

Таким образом, было показано, что разработанная нами методика с использованием мицеллярной электрокинетической хроматографии на коротком конце капилляра может быть использована наряду с другими методиками для количественного определения содержания водорастворимых витаминов в различных витаминных премиксах и обогащенных витаминами пищевых продуктах.

Литература

1. Беккер Ю. Хроматография. Инструментальная аналитика: методы хроматографии и капиллярного электрофореза. - М.: Техносфера, 2009. - 458 с.

2. Витаминные препараты. Новая популярная медицинская энциклопедия / Гл. ред. В.И. Покровский. - М.: Энциклопедия, 2004. - 768 с.

3. Спиричев В.Б., Шатнюк Л.Н., Поздняковский В.М. Обогащение пищевых продуктов витаминами и минеральными веществами. Наука и технология. - Новосибирск: Сибир. унив. изд-во, 2004. - 548 с.

4. Burini G. // J. Chromatogr. A. - 2007. - Vol. 1154. - P. 9 7-10 2 .

5. Candioti L.V., Robles J.C., Mantovani V.E. et al. // J. Talanta. - 2006. - Vol. 69. - Р. 140-147.

6. Chavez-Servin J.L., Castellote A.I., Carmen M. // J. Chromatogr. A. - 2006. - Vol. 1122. - P. 138-143.

7. Delgado-Zamarreno M.M., Gonzalez-Maza I., SanchezPerez A. et al. // J. Chromatogr. A. - 2002. - Vol. 953. - P. 2 5 7- 2 6 2 .

8. Fung Cheung R.H., Hughes J.G., Marriott P.J. et al. // Food Chem. - 2009. - Vol. 112. - Р. 507-514.

9. Fung Cheung R.H., Morrison P.D., Small D.M. et al. // J. Chromatogr. A. - 2008. - Vol. 1213. - P. 93-99.

10. Heudi O., Kilinc T., Fontannaz P. // J. Chromatogr. A. - 2005. - Vol. 1070. - P. 49-56.

11. Hustad S., Ueland P.M., Schneede J. // Clin. Chem. - 1999. - № 45/46. - Р. 862-868.

12. Lebiedzinska A., Marszatt M.L., Kuta J. et al. // J. Chromatogr. A. - 2007. - Vol. 1173. - P. 71-80.

13. Li Jia, Yaling Liu, Yanyan Du et al. // J. Chromatogr. A. - 2007. - Vol. 1154. - P. 416-422.

14. Mittermayr R., Kalman A., Trisconi M.-J. et al. // J. Chromatogr. A. - 2004. - Vol. 1032. - P. 1-6.

15. Morten A. Kall // J. Food Chem. - 2003. - Vol. 82. - Р. 3 15 - 3 2 7.

16. Okamoto H., Nakajima T., Ito Y. // J. Chromatogr. A. - 2003. - Vol. 986. - P. 153-161.

17. Perveen S., Yasmin A., Khan K.M. // Chem. J. - 2009. - N 3. - Р. 1 - 5 .

18. Shabangi M., Sutton J.A. // J. Pharm. Biomed. Anal. - 2005. - Vol. 38. - P. 66-71.

19. Vidovica S., Stojanovica B., Veljkovica J. et al. // J. Chromatogr. A. - 2008. - Vol. 1202. - P. 155-162.

20. Vinas P., Lopez-Erroz C., Balsalobre N. et al. // J. Chromatogr. A. - 2003. - Vol. 1007. - P. 77-84.

21. Yin C., Cao Y., Ding S. et al. // J. Chromatogr. A. - 2008. - Vol. 1193. - P. 172-177.

22. www.fp.crc.ru