Toxicological assessment of nanostructured silica. IV. Immunological and allergological indices in animals sensitized with food allergen and final discussioin

Abstract

This paper is the final in a series of publications on the assessment of subacute oral toxicity of nanostructured silica (SiO2). Preparation studied was a commercial nanopowder of SiO2, obtained by hydrolysis of tetrachlorosilane in the gaseous phase with the size of primary nanoparticles (NPs) of 5–30 nm. The experiment was conducted in 95 male Wistar rats weighing 150–180 g, divided into 6 groups numbering 25 (group 1), 26 (group 2), 11 (groups 3–6) of animals. The aqueous dispersion of SiO2 after sonication was administered to animals of groups 2, 4 and 6 for 28 days by intragastric gavage at a dose of 100 mg/kg of body weight per day. Animals of groups 1, 3, and 5 were treated with deionized water. On the 1st, 3d, 5th and 21st day of experiment the rats of groups 1, 2, 3 and 4 were sensitized intraperitoneally with hen’s egg ovalbumin (OVA) adsorbed to aluminum hydroxide. Intravenous administration of the challenge dose OVA to rats in groups 1 and 2 was carried out on the 29th day. In the same period animals of groups 3–6 were bled for analysis of cellular immunity. There were evaluated the severity of systemic anaphylaxis reaction, the level of specific IgG antibodies to OVA in sensitized animals, state of erythrocytes, platelets and leukocytes of peripheral blood using standard methods. Using flow cytometry there were measured contents of lymphocyte populations of B-lymphocytes (CD45RA+), total T-lymphocytes (CD3+), T-helper cells (CD4+), T-cytotoxic cells (CD8+), NKcells (CD161a+), phagocytic activity of polymorphonuclear leukocytes in respect of latex particles. Serum levels of TNFα and IL-10 cytokines were determined by ELISA. The result showed that NPs SiO2, at dose of 100 mg/kg body weight had no any marked effect on severity of active anaphylactic shock and level of specific antibodies. The changes in cellular immunity under the influence of nanomaterial had similar direction in sensitized and non-sensitized animals and were more pronounced in the latter. Based on the discussion of the results, together with data from previous publications it was concluded that oral maximum level without observable adverse effect (NOAEL) of nanostructured SiO2 is located below 100 mg/kg body weight.

Keywords:silica, nanoparticles, rats, subacute toxicity, NOAEL, systemic anaphylaxis, cellular immunity, cytokines, antibodies, phagocytosis

Вопр. питания. 2015. № 5. С. 102-111.

Наноструктурный аморфный диоксид кремния SiO2 представляет собой крупнотоннажный продукт современной нанотехнологии, широко применяющийся в настоящее время в качестве пищевой добавки. Имеющиеся сведения о возможном неблагоприятном действии этого наноматериала (НМ) на организм лабораторных животных, полученные в ряде работ [1-7], неоднозначны.

Возможной причиной этих расхождений являются различия в свойствах тестированных НМ, которые по своим физико-химическим характеристикам значительно отличались от наноструктурного SiO2, используемого в пищевой промышленности, а также в недостаточной чувствительности изучаемых биомаркеров токсического действия.

В предыдущих публикациях [8-10] нами были пред- ставлены данные о подострой пероральной токсичности SiO2 с диаметром наночастиц (НЧ) в пределах 5-30 нм в 92-дневном эксперименте на крысах.

При этом был показан дисбаланс иммунного ответа при дозе НМ 100 мг на 1 кг массы тела. Другие возможные эффекты иммунотоксического действия НМ могут проявляться в нагрузочных модельных экспериментах, т.е. в условиях, когда система иммунитета функционирует с напряжением. Так, например, есть основания ожидать усиление под действием НЧ сенсибилизации пищевыми и атопическими аллергенами [11]. Целью настоящей работы является оценка влияния подострого перорального введения НЧ SiO2 на показатели клеточного и гуморального иммунитета у крыс в условиях нагрузки модельным пищевым антигеном.

Материал и методы

Наноструктурный SiO2, представляющий собой порошкообразный продукт газофазного гидролиза тетрахлорсилана высокой чистоты, был приобретен в фирме ООО "Силика" (Россия) под торговым наименованием "Орисил 300" по ТУ 24.1-31695418-002-2003. Согласно представленным в предыдущей публикации [8] данным исследования образца методами трансмиссионной электронной микроскопии, атомно-силовой микроскопии, спектроакустики и динамического лазерного светорассеяния, размер первичных НЧ образца составлял от 5 до 30 нм. Частицы были непрочно агрегированы в порошке в ассоциаты микронного размера, разрушающиеся до частиц размером <100 нм в результате обработки ультразвуком в водной суспензии.

Эксперименты проведены на 95 крысах-самцах линии Вистар исходной массой тела 150-180 г, разделенных на 6 групп численностью 25 (1-я группа), 26 (2-я группа), 11 (3-6-я группы) особей; средняя исходная масса тела животных во всех группах различалась недостоверно. Выбор периода введения НМ животным (28 дней) обусловлен временем развития аллергической сенсибилизации в примененной стандартной модели системной анафилаксии. На протяжении этого срока животные всех групп получали стандартный рацион вивария ФГБНУ "НИИ питания" на основе натуральных пищевых продуктов, сбалансированный по основным макро- и микронутриентам [12].

Крыс размещали в клетках группами по 3 особи; рацион и воду животные получали в режиме свободного неограниченного доступа. 1% водную дисперсию НЧ SiO2, предварительно обработанную ультразвуком (частота 44 кГц, удельная мощность 1 Вт/мл, время 5 мин, температура +2 °С), вводили крысам 2, 4 и 6-й групп ежедневно внутрижелудочно через зонд в дозе 100 мг (10 мл) на 1 кг массы тела. Крысы 1, 3 и 5-й групп получали в тех же объемах носитель НМ - деионизованную воду. На 1, 3 и 5-й день эксперимента крыс 1, 2, 3 и 4-й групп внутрибрюшинно иммунизировали по схеме [13] дозой 100 мкг 5-кратно перекристаллизованного овальбумина куриного яйца (ОВА), адсорбированного на 10 мг свежеосажденного гидроксида алюминия. На 21-й день вводили дополнительно еще 10 мкг ОВА в тех же условиях для индукции вторичного иммунного ответа.

По окончании периода кормления животных на 29-й день эксперимента у крыс 1-й и 2-й групп отбирали по 0,5 мл крови из хвостовой вены для определения антител, после чего вводили внутривенно по 6 мг на 1 кг массы тела ОВА в стерильном апирогенном 0,15 М NaCl. Раствор белка перед внутривенным введением предварительно фильтровали через мембранный фильтр с порами 0,22 мкм. Развитие симптомов активного анафилактического шока (ААШ) наблюдали в течение 24 ч после введения разрешающей дозы; тяжесть реакции оценивали в соответствии со шкалой: "0" - нет реакции; "+" - озноб, одышка, кожный зуд; "++" - слабость, атаксия, цианоз конечностей; "+++" - судороги, паралич; "++++" - летальный исход. Выживших животных 1-й и 2-й групп выводили из эксперимента путем ингаляции летальной дозы СО2. Крыс 3-6-й групп выводили из эксперимента путем обескровливания из нижней полой вены под глубокой эфирной анестезией. Кровь отбирали дробно в антикоагулянт (0,01% по массе трикалиевой соли ЭДТА) для определения гематологических и имммунологических показателей и в стерильную сухую пробирку для определения в сыворотке цитокинов.

Интенсивность гуморального иммунного ответа к ОВА у крыс 1-й и 2-й групп оценивали по концентрации циркулирующих специфических IgG антител с помощью непрямого твердофазного иммуноферментного теста (ИФА) на полистироле [14].

Ответ антител анализировали в показателях уровня антител в сыворотке крови (мг/см3), десятичного логарифма концентрации и величины оптической плотности в реакции ИФА за вычетом фона (неспецифической сорбции) контрольного образца.

Определение цитокинов IL-10 и TNFα в сыворотке крови крыс 3-6-й групп проводили с использованием коммерческих наборов "Bioscience" ("Bender MedSystems GmbH", Австрия) в соответствии с рекомендациями фирмы изготовителя.

Экспрессию рецепторов CD45RA, CD3, CD4, CD8, CD161a на лимфоцитах (Лф) периферической крови крыс 3-6-й групп определяли методом прямого иммунофлуоресцентного окрашивания клеток цельной крови с использованием панели моноклональных антител, конъюгированных с флуоресцентными красителями: FITC, PC7, APC (IO Test, "Beckman Coulter", США). Содержание CD45RA+-клеток (B-Лф), CD3+ (Т-Лф) и CD161а+ (естественных киллеров) выражали в процентах от общего числа проанализированных клеток; содержание CD3+CD4+ (Т-хелперов) и CD3+CD8+ (Т-цитотоксических Лф) выражали в процентах от общего числа CD3+-клеток. Рассчитывали иммунорегуляторный индекс (ИРИ), представляющий собой отношение количества СD4+/CD8+ Лф. Измерения проводили на проточном цитофлуориметре FC-500 ("Beckman Coulter", США) по стандартной методике [14].

Изучение фагоцитарной активности нейтрофильных лейкоцитов периферической крови выполняли по стандартной методике [15] с помощью набора реагентов "Phagocytosis Assay Kit" (IgG FITC) ("Cayman Chemical Company", США). Объектом фагоцитоза служат частицы латекса, опсонизированные IgG FITC. Клеточную суспензию с добавлением латекса инкубировали с цельной кровью животных в течение 30 мин в двух пробирках.

Анализ проб проводили на проточном цитофлуориметре по программе Cytomics CXP Software.

Популяцию нейтрофильных лейкоцитов выделяли при помощи гейтирования по параметрам малоуглового (FS) и бокового (SS) светорассеяния, после чего оценивали число фагоцитировавших клеток по величине флуоресценции FITC. Анализ проводили дважды: в присутствии и в отсутствие стимулятора фагоцитоза - форбол12-миристат-13-ацетата (ФМА), после чего рассчитывали индекс стимуляции для каждого изученного образца крови.

Гематологические показатели определяли на гематологическом анализаторе "Coulter AC TTM 5 diff OV" ("Beckman Coulter", США) со стандартным набором реагентов ("Beckman Coulter", Франция). Определяемые параметры включали количество эритроцитов, лейкоцитов, концентрацию гемоглобина, показатель гематокрита, средний объем эритроцита, среднее содержание гемоглобина в эритроците, среднюю концентрацию гемоглобина в эритроците, лейкоцитарную формулу, количество тромбоцитов, средний объем тромбоцита, относительный объем тромбоцитов в образце цельной крови.

Статистическая обработка результатов эксперимента проведена с использованием пакета программ SPSS 18.0 согласно ANOVA (факторный анализ), t-критерию Стьюдента, непараметрическим ранговым критериям Манна-Уитни и χ2; критерию U углового преобразования Фишера для долевых показателей. Различия признавали достоверными при уровне значимости p<0,05.

Результаты и обсуждение

На протяжении 28 дней введения НЧ SiO2 1 крыса погибла во 2-й группе и 1 в 6-й группе. На секции выявлены признаки двусторонней пневмонии, что могло быть связано со случайной аспирацией этими животными вводимой суспензии НЧ SiO2 в дыхательные пути. Остальные животные имели нормальный внешний вид, активность, признаков заболеваемости не выявлено.

Как видно из данных, представленных в табл. 1, средняя масса тела крыс 1-й и 2-й групп по окончании эксперимента достоверно не различалась, что свидетельствует об отсутствии влияния НМ на рост животных.

Данные о тяжести реакции системной анафилаксии (% летальных и тяжелых реакций, величина анафилактического индекса), представленные в табл. 1, свидетельствуют, что у животных, получавших в течение месяца НЧ SiO2 в дозе 100 мг на 1 кг массы тела в сутки, наблюдается увеличение тяжести аллергической реакции, которое, однако, остается статистически недостоверным (р>0,05).

То же можно отметить и в отношении уровня антител к ОВА, выраженного тремя разными показателями (см. табл. 1). Как следует из данных рис. 1, у животных 2-й группы, получавших наноструктурный SiO2, наблюдается меньшее число легких (+) и средней тяжести (++) аллергических реакций, что, однако, компенсируется большим числом отсутствующих реакций (0) в сравнении с 1-й группой, получавшей воду. В целом оба распределения животных по тяжести шока статистически достоверно не различаются (р>0,05) согласно многомерному критерию χ2. Таким образом, эффект усиления аллергизации животных модельным пищевым аллергеном ОВА при воздействии наночастиц SiO2 в дозе 100 мг на 1 кг массы тела оказывается слабо (маргинально) выраженным, и данная доза может быть принята в качестве максимальной недействующей (NOAEL).

Полученный результат качественно совпадает с ранее установленным отсутствием аллергизирующего действия при пероральном введении НЧ различных типов на фоне парентеральной сенсибилизации модельным пищевым антигеном.

В то же время имеются данные о том, что НЧ SiO2 при интраназальном и ингаляционном введении мышам и крысам усиливают их аллергическую чувствительность к ОВА [16, 17]. При парентеральном введении некоторые оксидные НЧ активируют калликреин-кининовую систему [18] или являются гистаминолибераторами [19]. Можно предположить, что решающую роль при этом, по-видимому, играет путь введения НМ. Проаллергенное действие ингалируемых НЧ, особенно производимых в промышленных масштабах, несомненно, необходимо учитывать при установлении гигиенических нормативов их безопасного содержания в воздухе рабочей зоны, в то время как для НЧ, содержащихся в пище и питьевой воде, такого рода риски, повидимому, являются значительно меньшими.

Изучение гематологических параметров у крыс 3-6-й групп, подвергшихся сенсибилизации и воздействию НМ, показало, что средние показа- тели, характеризующие состояние эритроцитов, только очень незначительно (в пределах 3-5%) различались между сравниваемыми группами (данные не показаны). Было отмечено незначительное, но достоверное (р<0,05, ANOVA) снижение концентрации гемоглобина в крови (на 4%) и в эритроците (на 3%) у сенсибилизированных животных в сравнении с несенсибилизированными. Какого-либо влияния НМ на состояние эритроцитов как у сенсибилизированных, так и у несенсибилизированных животных не выявлено.

Исследование лейкоцитарной формулы животных (табл. 2) показало, что сенсибилизация и месячное введение НМ не оказывало ни какого влияния на эти показатели, за исключением достоверного повышения относительного содержания лимфоцитов вследствие сенсибилизации на фоне введения НЧ SiO2. Исходя из данных табл. 3 можно предположить, что источником такого увеличения является, по-видимому, возрастание числа В-клеток, доля которых в общем пуле у сенсибилизированных животных, получавших НЧ, возрастает. В отсутствие приема НМ подобный эффект не наблюдается.

Основным фактором, достоверно влияющим на параметры тромбоцитов животных (см. табл. 2), является сенсибилизация, тогда как НЧ в значительно меньшей степени влияют на этот показатель так как различие подтверждается по данным ANOVA, но не при парном сравнении). Можно заключить, что для системы тромбоцитов NOAEL по наноразмерному SiO2 в ходе месячного приема составляет не менее 100 мг на 1 кг массы тела.

Основное наблюдение, которое может быть сделано из оценки параметров системы клеточного иммунитета животных (см. табл. 3), состоит в том, что так же, как и в результате 3-месячного введения, 1-месячное зондовое введение НЧ SiO2 в дозе 100 мг на 1 кг массы тела у несенсибилизированных животных приводит к достоверному снижению числа Т-хелперов, возрастанию количества Т-цитотоксических Лф и уменьшению ИРИ.

Таким образом, подтверждается ранее сделанный вывод о том, что Т-клеточное звено иммунитета, по-видимому, является наиболее чувствительной мишенью воздействия изучаемых НЧ. Однако на фоне сенсибилизации эти изменения оказываются смазанными и приобретают характер статистически недостоверной тенденции. Таким образом, усиление дисбаланса иммунного ответа под действием НЧ SiO2 в условиях сенсибилизации пищевым белком, во всяком случае, не наблюдается. Заслуживает внимания достоверное (р<0,05) и весьма выраженное (на 75%) возрастание числа естественных киллеров (CD161a+) в результате воздействия НЧ у несенсибилизированных животных.

На фоне сенсибилизации данный эффект практически не проявляется. Вместе с тем эти изменения могут рассматриваться как активация клеточного звена врожденного иммунитета под действием НЧ, т.е. не может быть интерпретировано как неблагоприятное (вредное). Поэтому достаточных оснований для снижения величины NOAEL по данному показателю, по-видимому, нет.

Как следует из данных табл. 4, базальные показатели активности фагоцитоза нейтрофильных лейкоцитов у крыс 3-6-й групп практически не различались. Индекс стимуляции фагоцитоза под действием ФМА проявлял тенденцию к снижению в 6-й группе, получавшей НЧ SiO2 в отсутствие сенсибилизации; различие с 5-й группой, однако было недостоверным (p>0,05). При сравнении аналогичных групп сенсибилизированных животных (3-й и 4-й) такой эффект практически не был заметен. Факторный анализ показал отсутствие влияния на показатели фагоцитоза со стороны как сенсибилизации, так и приема НМ.

Анализ содержания цитокинов в сыворотке крови животных (рис. 2) показал, что имеется тенденция к снижению концентрации IL-10 при введении НЧ SiO2 у сенсибилизированных крыс и к возрастанию уровня TNFу несенсибилизированных (см. рис. 2). Однако указанные различия были недостоверными (p>0,05). В предыдущей работе [10] было выявлено значительное увеличение уровня TNF α в сыворотке крови крыс, получавших наноструктурный SiO2 в дозе 100 мг на 1 кг массы тела в сутки в течение 3 мес; 28-дневный период приема НМ, по-видимому, недостаточен для развития подобного эффекта.

Общий вывод, который может быть сделан из полученных результатов, заключается в том, что 28-дневное введение наноструктурного SiO2 в максимальной изученной дозе не приводит к достоверному увеличению аллергической чувствительности к ОВА. В то же время наблюдаемые при этом изменения в состоянии иммунной системы: в дисбалансе CD4+- и CD8+-клеток, - во всяком случае не усиливаются в условиях антигенной нагрузки. Таким образом, данные модельного нагрузочного эксперимента не выявляют дополнительных признаков иммунотоксического дейс- твия наноструктурного SiO2 и не дают оснований для пересмотра ранее установленной оценки NOAEL.

В заключение необходимо остановиться на общем анализе данных по оценке изменений биологических маркеров токсичности наноструктурного SiO2, наблюдающихся при подострой пероральной экспозиции этим НМ [8-10]. Их сводка представлена в табл. 5. Как видно из этих данных, для ряда выявленных эффектов НМ отсутствует четкая зависимость от дозы, либо наблюдаемые сдвиги не могут быть однозначно интерпретированы как неблагоприятные, что не соответствует существующему определению NOAEL.

Исключение составляют эффекты в отношении клеточного звена системы иммунитета, для которых, во-первых, существует четкая зависимость от дозы, т.е. они проявляются в максимальной степени при наибольшей дозе НЧ SiO2, и, во-вторых, их направленность (особенно снижение числа Т-хелперов и увеличение выработки провоспалительного TNF α ) свидетельствует о наличии провоспалительного влияния. Отсутствие достоверных сдвигов этих показателей в группе животных, получавших НМ в дозе 10 мг на 1 кг массы тела, позволяет заключить, что величина пероральной NOAEL для наноструктурного SiO2 находится в интервале до 100 мг на 1 кг массы тела в сутки в условиях его ежедневного поступления в течение 1-3 мес.

Литература

1. Верников В.М., Распопов Р.В., Арианова Е.А., Тананова О.Н. и др. Токсиколого-гигиеническая оценка препаратов наноструктурированного диоксида кремния в эксперименте на лабораторных животных // Инновационные технологии в управлении, образовании, промышленности "АСТИНТЕХ-2010". Астрахань : ИД "Астраханский университет", 2010. С. 4-7.

2. Зайцева Н.В., Землянова М.А., Звездин В.Н., Саенко Е.В. Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности водной суспензии нанодисперсного диоксида кремния, синтезированного методом жидкокристаллического темплатирования // Анализ риска здоровью. 2013. № 1. С. 65-72.

3. Зайцева Н.В., Землянова М.А., Лебединская О.В., Звездин В.Н. и др. Влияние нанодисперсного диоксида кремния на структурные особенности внутренних органов экспериментальных животных // Морфология. 2013. Т. 144, № 5. С. 78-79.

4. Park E.J., Park K. Oxidative stress and pro-inflammatory responses induced by silica nanoparticles in vivo and in vitro // Toxicol. Lett. 2009. Vol. 184, N 1. P. 18-25.

5. Rossi E.M., Pylkkanen L., Koivisto A.J., Vippola M. et al. Airway exposure to silica-coated TiO2 nanoparticles induces pulmonary neutrophilia in mice // Toxicol. Sci. 2010. Vol. 113, N 2. P. 422-433.

6. Sayes C.M., Reed K.L., Glover K.P., Swain K.A. et al. Changing the dose metric for inhalation toxicity studies: short-term study in rats with engineered aerosolized amorphous silica nanoparticles // Inhal. Toxicol. 2010. Vol. 22, N 4. P. 348-354.

7. Van der Zande M., Vandebriel R.J., Groot M.J., Kramer E. et al. Subchronic toxicity study in rats orally exposed to nanostructured silica // Part. Fibre Toxicol. 2014. Vol. 11. P. 8.

8. Шумакова А.А., Арианова Е.А., Шипелин В.А., Сидорова Ю.С. и др. Токсикологическая оценка наноструктурного диоксида кремния. I. Интегральные показатели, аддукты ДНК, уровень тиоловых соединений и апоптоз клеток печени // Вопр. питания. 2014. Т. 83, № 3. С. 52-62.

9. Шумакова А.А., Авреньева Л.И., Гусева Г.В., Трусов Н.В. и др. Токсикологическая оценка наноструктурного диоксида кремния II. Энзимологические, биохимические показатели, состояние системы антиоксидантной защиты // Вопр. питания. 2014. Т. 83, № 4. С. 58-66.

10. Шумакова А.А., Кузнецова Г.Г., Минаева Л.П., Быкова И.Б. и др. Токсикологическая оценка наноструктурного диоксида кремния. III. Микроэкологические, гематологические показатели, состояние системы иммунитета // Вопр. питания. 2015. Т. 84, № 4. С. 46-56.

11. Yang H., Wu Q., Tang M., Liu X. et al. In vitro study of silica nanoparticleinduced cytotoxicity based on real-time cell electronic sensing system // J. Nanosci. Nanotechnol. 2010. Vol. 10, N 1. P. 561-568.

12. МУК 2.3.2.970-00. Медико-биологическая оценка пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников.

13. Stokes C.R., Miller B.G., Bourne F.J. Animal models of food sensitivity // Food Allergy and Intolerance / eds J. Brostoff, S.J. Challacombe. Eastbourne : W.B. Saunders, 1987. P. 286-300.

14. МР 1.2.0052-11. Оценка воздействия наноматериалов на функцию иммунитета.

15. МУ 1.2. 2635-10. Медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов.

16. Han B., Guo J., Abrahaley T., Qin L. et al. Adverse effect of nanosilicon dioxide on lung function of rats with or without ovalbumin immunization // PLoS One. 2011. Vol. 6, N 2. Article ID e17236.

17. Yoshida T., Yoshioka Y., Fujimura M., Yamashita K. et al. Promotion of allergic immune responses by intranasally-administrated nanosilica particles in mice // Nanoscale Res. Lett. 2011. Vol. 6, N 1. P. 192-204.

18. Simberg D., Zhang W.M., Merkulov S., McCrae K. et al. Contact activation of kallikrein-kinin system by superparamagnetic iron oxide nanoparticles in vitro and in vivo // J. Control Release. 2009. Vol. 140, N 3. P. 301-305.

19. Chen E.Y., Garnica M., Wang Y.C., Mintz A.J. et al. A mixture of anatase and rutile TiO2 nanoparticles induces histamine secretion in mast cells // Part. Fibre Toxicol. 2012. Vol. 9. P. 2.