Impact of new fermented dairy product with whey protein hydrolysate on tolerance and dynamics of atopic dermatitis manifestation in children suffering from cow’s milk protein allergy

Abstract

Traditionally dietetic fermented dairy products occupy significant place in prophylaxis and therapy of different digestive tract diseases. Under enrichment of such products with probiotics and prebiotics their regular intake promotes to maintain human’s immune status. Moreover it is known that conformation of milk proteins during fermentation with starter microorganisms can reduce fermented products allergenicity comparing to original milk thereby attaching them additional functional properties. In this aspect the controlled biocatalytical conversion of milk proteins is perspective making it possible as well to manufacture the products with low allergenicity and at that keeping the properties required for immunological (oral) tolerance formation. The work presents the results of the carried out clinic-laboratory investigations covering the tolerance of the new developed fermented product «Biokefir – P 1% fat content» with 20% replacement of milk proteins for whey proteins hydrolysate (cheese whey) in 20 children suffering from cow’s milk protein allergy in the form of atopic dermatitis at the stage of the disease remission. The analyses showed that daily intake of the product (250 ml) by the children at the age of 3–16 years with light manifestation of food allergy against the background of non specific hypoallergenic diet influences positively the children general state and is accompanied by improvement of the organism antioxidant protection index (increase of antioxidant blood serum volume regarding to peroxilic radical from 5.82±0.35 to 6.84±0.43 mM of trolox equivalents) and intestine microbiota (increase of bifidobacteria and lactic acid bacteria in intestine from 18.7±0.83 to 24.7±15.3 and from 15.3±0.31 to 19.1±0.65 UE). The patients’ blood serum didn’t show any marker changes for food allergy parameters – content of crude protein and the level of circulating allergen specific IgG and IgE antibodies to β-lactoglobulin of cow’s milk the confirms the product low allergenic properties.

Keywords:children, diethotherapy, food allergy, atopic dermatitis, fermented dairy product, whey proteins hydrolysate, cow’s milk β-lactoglobulin, allergen specific antibodies, AOC to peroxyl radical, intestine microflora

Вопр. питания. 2015. № 5. С. 56-63.

Данные отечественной медицины свидетельствуют о том, что каждый 3-й житель России подвержен аллергии, и прямые затраты на лечение 1 больного неуклонно возрастают, достигая 65 000 руб. в год [1-3]. При этом одна из наиболее распространенных форм аллергических заболеваний (до 80%) - пищевая аллергия [4, 5]. Среди пациентов, страдающих пищевой аллергией, наиболее часто (70-80%) встречается непереносимость белков коровьего молока. Это является серьезной медико-социальной проблемой, поскольку продолжительное потребление нативных молочных продуктов в таком случае приводит к сбоям в работе иммунной системы и развитию хронических заболеваний, таких как атопический дерматит и бронхиальная астма, дисбиозам желудочно-кишечного тракта и т.д. Более того, предполагается существование связи между непереносимостью белков коровьего молока и развитием детского аутизма [1, 2, 6]. Неотъемлемой частью комплексной терапии "молочной" аллергии является диетотерапия, которая строится на исключении из рациона продуктов на основе белков коровьего молока или использования специализированных смесей.

В свою очередь это также таит в себе потенциальную опасность формирования остеопении за счет недополучения необходимого организму кальция из молока [7].

Одним из подходов к созданию молочных продуктов со сниженной аллергенностью является процесс ферментативного гидролиза молочных белков [4]. В зависимости от степени расщепления молочного белка выделяют смеси пептидов, созданные на основе высоко- или частично (умеренно) гидролизованного белка. При этом существует четкая корреляция между длиной пептида и его аллергенностью: чем больше молекулярная масса (т.е. чем крупнее пептид), тем выше риск развития аллергической реакции. В связи с вышесказанным актуальным является создание молочных продуктов с помощью управляемого гидролиза для получения такого пептидного профиля, который утрачивает сенсибилизирующую активность, при этом сохраняя свойства, необходимые для выработки иммунологической толерантности [8, 9].

Ранее в ФГБНУ ВНИМИ были разработаны ферментативный способ получения смеси гидролизованных белков молочной сыворотки [10] и способ изготовления кисломолочного продукта "Биокефир-П 1% жирности" (далее - продукт) с заменой 20% молочных белков на гидролизат белков подсырной сыворотки, предназначенного для диетического и профилактического питания [11].

Цель настоящего исследования - клиническая оценка переносимости продукта и динамики некоторых проявлений аллергии у детей с пищевой аллергией на белки коровьего молока.

Материал и методы

Исследование проведено на базе отделения аллергологии клиники лечебного питания ФГБНУ "НИИ питания". В обследование было включено 20 детей в возрасте от 3 до 16 лет с легкими проявлениями пищевой аллергии в виде атопического дерматита. Критерии включения: диагноз атопический дерматит, установленный по характерным симптомам болезни; связь возникновения симптомов заболевания с приемом молочных продуктов в анамнезе; лабораторное подтверждение пищевой аллергии по результатам исследования аллергенспецифических IgE и IgG антител в сыворотке крови к белку коровьего молока. Степень тяжести кожных проявлений на момент начала испытаний и в динамике оценивали по системе SCORAD.

Продукт изготавливался ОАО "Молочный комбинат “Воронежский”" в соответствии с ТУ 9222-51200419785 (СГР № RU.77.99.19.004.Е.009238.11.13) путем сквашивания смеси пастеризованного молока и гидролизата сывороточных белков закваской молочнокислых микроорганизмов и дрожжей, входящих в состав микрофлоры кефирных грибков, с добавлением пропионовокислых бактерий. Продукт содержит (в 100 г): 3,1 г белка; 1 г жира; 4,2 г углеводов (лактозы); энергетическая ценность 38 ккал/160 кДж. Каждая партия продукта подвергалась контролю по всему перечню нормируемых показателей качества и безопасности в аккредитованной лаборатории предприятия-изготовителя.

Доставка продукта в отделение аллергологии осуществлялась не позднее чем за 8 ч до начала приема детьми. Все дети в течение 14 дней получали по 250 мл продукта в сутки на ночь на фоне неспецифической гипоаллергенной диеты с исключением высокоаллергенных (облигатных) аллергенов (рыба и морепродукты, орехи, шоколад, какао, творог, сметана, цитрусовые).

Переносимость продукта пациентами оценивали по развитию у них нежелательных и побочных явлений, учету общего состояния и самочувствия ежедневно на протяжении всего времени приема данного продукта. Для оценки эффективности продукта у наблюдаемых детей осуществлялся ежедневный осмотр кожных покровов.

Исследование одобрено Этическим комитетом ФГБНУ "НИИ питания". Перед исследованием получено информированное согласие родителей или опекунов пациента.

Для определения титров аллергенспецифических IgE и IgG антител к β-лактоглобулину (β-ЛГ) коровьего молока в сыворотке крови в лунки 96-луночных прозрачных полистироловых микропланшетов ("Corning Costar", США) с иммобилизованным β-ЛГ вносили по 0,1 см3 испытуемых сывороток (интервал разведений от 1:10 до 1:20 000). Микропланшет инкубировали 60 мин при 37 °С, отмывали 50 мМ К-фосфатным буфером (рН 7,4, с добавлением 0,1 М NaCl и 0,05% Тритона Х-100). Для определения аллергенспецифических IgE в лунки вносили по 0,1 см3 мышиных антител против IgE человека в концентрации 10 мкг/см3.

После повторной инкубации и отмывки в лунки планшета вносили по 0,1 см3 конъюгата антител против IgG мыши с пероксидазой ("Медгамал", Россия), разведение 1:6000. Для определения аллергенспецифических IgG в лунки микропланшета вносили по 0,1 см3 конъюгата антител против IgG человека с пероксидазой ("Медгамал", Россия), разведение 1:6000, вновь инкубировали и отмывали. Для определения пероксидазной активности связавшейся с носителем ферментной метки в лунки микропланшета вносили по 0,1 см3 0,4 мМ раствора 3,3’,5,5’-тетраметилбензидина в 40 мМ Na-цитратном буфере (рН 4,0) с 3 мМ Н2О2, затем инкубировали 15 мин при комнатной температуре, останавливали реакцию добавлением 0,05 см3 1 М H2SO4 и измеряли оптическую плотность при длине волны 450 нм на микропланшетном фотометре-флуориметре "Synergy 2" ("BioTek", США). По калибровочной кривой определяли концентрацию аллергенспецифических антител в сыворотке крови.

Концентрацию общего белка в сыворотке крови определяли с использованием набора реагентов "Pierce BCA protein assay kit" ("Thermo Scientific ", США). Содержание белка в сыворотке крови измеряли на микропланшетном фотометре-флуориметре "Synergy 2" ("BioTek", США).

В качестве стандарта использовали раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА, "Thermo Scientific ", США).

Антиоксидантную емкость (АОЕ) сыворотки крови по отношению к пероксильному радикалу определяли по методу [12]. Перед проведением анализа образцы сыворотки крови размораживали на льду и готовили рабочие разведения в 50 мМ натрий-фосфатном буфере, pH 7,40, в 120 и 160 раз. Пероксильный радикал генерировался непосредственно в реакционной среде при термическом распаде азосоединения 2,2’-азобис (2-метилпропионамидина) дигидрохлорида (ААРН), инициируемом путем инкубации при 37 °С в течение 10 мин. Для построения калибровочной кривой в качестве стандартного антиоксиданта использовали тролокс (6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновая кислота) (Trolox, "Sigma-Aldrich", США). Кинетику убыли свечения флуоресцеина при взаимодействии с пероксильным радикалом в отсутствии антиоксидантов (контроль) и в присутствии тролокса или сыворотки крови в реакционной среде регистрировали в течение 1 ч с интервалом измерений 60 с при температуре 37 °С на фотометре-флуориметре "Synergy 2" ("BioTek", США) в режиме регистрации интенсивности флуоресценции (длина волны возбуждения - 485 нм, длина волны испускания - 528 нм).

АОЕ сыворотки крови по отношению к пероксильному радикалу выражали в мМ эквивалентов тролокса (ТЭ).

Для определения состава кишечной микрофлоры был использован модифицированный метод T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism), который основан на ПЦР-амплификации фрагментов генов микробной 16S рДНК, выделении амплифицированных фрагментов из агарозного геля, последующей ферментной обработке рестриктазами и разделении полученных в результате рестрикции фрагментов ДНК на автоматическом секвенаторе, с последующим анализом полученных T-RFLP-грамм по базам данных с помощью соответствующих программ и комплексным анализом на основе статистических (корреляционный и кластерный), таксономических и экологических подходов.

Выделение тотальной ДНК из кала обследованных детей проводили с использованием набора "Genomic DNA Purification kit" ("Thermo Fisher Scientific", США). Для ПЦР-амплификации использовали флуоресцентно-меченные праймеры: 63F (Cy5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG) и 1087R (CCGTCAATTCCTTTRAGTTT). Ферментативную обработку амплификата проводили с использованием рестриктаз Msp, Hha и Hae (Promega, Madison, Wis.). Разделение полученных в результате рестрикции фрагментов ДНК проводили в условиях капиллярного электрофореза при помощи секвенатора CEQ8000 ("Beckman Coulter", США) вместе с флуоресцентно-меченным ДНК-маркером. Определение филогенетической принадлежности микроорганизмов проводили с помощью программ и баз данных "Arlequin", "FragSort", "TRAMPR" и "T-REX". Содержание микроорганизмов в образцах кала выражали в условных единицах (усл. ед.).

За условную единицу (усл. ед.) принимали количество рестрикционных фрагментов, принадлежащих к определенной таксономической группе микроорганизмов, соотнесенное с общим количеством полученных фрагментов всех микроорганизмов.

Статистическую обработку данных проводили с использованием программ "Microsoft Excel" и "Биостатистика" версия 4.03. Статистически значимыми по двустороннему критерию Стьюдента считали отличия при p<0,05.

Результаты и обсуждение

Использование кисломолочных продуктов позволяет расширить возможности диетотерапии на этапе постепенного расширения рациона питания детям с легкими проявлениями пищевой аллергии.

Кисломолочные продукты назначают, как правило, на этапе диетологической реабилитации, когда происходит снижение чувствительности к белкам коровьего молока, а также при легких проявлениях пищевой аллергии, с учетом того, что при ферментации или сквашивании коровьего молока происходит снижение аллергизирующих свойств его белков. В данной работе оценивали возможность использования в качестве продукта диетического питания разработанный в ФГБНУ ВНИМИ кисломолочный продукт с частичной (20%) заменой молочных белков на гидролизат белков подсырной сыворотки.

Ежедневные осмотр и опрос пациентов не выявили побочных реакций при употреблении продукта. Переносимость и вкусовые качества продукта были хорошими, досрочного прекращения его приема наблюдаемыми детьми не отмечено. Также не отмечено обострения кожного процесса у детей (оценка по индексу SCORAD 23,7±3,08 балла до и 21,3±2,63 балла после приема продукта) и нарастания количества эозинофилов в периферической крови (4,8±1,2% до и 4,9±1,8% после приема продукта).

В настоящее время установлена положительная корреляционная взаимосвязь между наличием у пациентов пищевой аллергии, клиническими проявлениями атопического дерматита и высоким уровнем в сыворотке крови таких пациентов аллергенспецифических антител IgG и IgE [13]. Комплексное исследование аллергенспецифических IgE и IgG антител в сыворотке крови к пищевым аллергенам у детей позволяет оптимизировать диетотерапию и снизить частоту тяжелых проявлений аллергопатологии. Результаты рандомизированного исследования содержания аллергенспецифи- ческих антител IgG и IgE к β-ЛГ коровьего молока в сыворотке крови 10 детей разных возрастных категорий, потреблявших продукт, представлены в табл. 1. По результатам исследования концентрация в сыворотке крови аллергенспецифических IgE антител к белку коровьего молока β-ЛГ колебалась от <0,35 до 2,2 МЕ/мл, что соответствовало классу аллергии от 1+ до 2+.

Из полученных данных видно, что в процессе обследования у всех пациентов в выборке не отмечалось повышения титров аллергенспецифических IgE и IgG антител к β-ЛГ коровьего молока в сыворотке крови после приема продукта. Содержание IgE и IgG оставалось на уровне, детектируемом до приема исследуемого продукта у 7 и 5 детей соответственно (табл. 1). У остальных пациентов отмечено снижение уровня специфических антител после употребления продукта на фоне неспецифической гипоаллергенной диеты, при этом у пациентов № 2 и 6 было отмечено снижение уровня как IgE, так и IgG специфических антител (см. табл. 1).

Аллергические заболевания нередко связаны с патологией печени, поджелудочной железы, нарушениями белкового, углеводного, жирового обмена и желудочно-кишечными заболеваниями. Так, у пациентов с атопическим дерматитом снижается устойчивость к перекисному окислению липидов и увеличивается продукция активных форм кислорода, что указывает на формирование локального оксидативного стресса у таких пациентов [14].

В связи с этим для восстановления антиоксидантного статуса организма в лечении больных с атопическим дерматитом в комплексе со стандартной терапией указывают также на целесообразность использования антиоксидантных препаратов [15], в результате чего получают дополнительный антигистаминный эффект - стабилизацию мембран базофилов и тучных клеток, что, в свою очередь, приводит к уменьшению выброса из них гистамина.

В ходе данного исследования был проведен анализ влияния продукта при его употреблении на антиоксидантную емкость сыворотки крови пациентов и изменение общего содержания белка. Из представленных на рисунке (а) данных видно, что при введении в рацион пациентов продукта не происходило статистически значимого изменения содержания общего белка в сыворотке, которое, как правило, возрастает при наличии аллергической реакции.

При употреблении продукта наблюдалось статистически значимое (p<0,05) увеличение средней величины АОЕ сыворотки крови пациентов по отношению к пероксильному радикалу на 17,5% (6,84±0,43 мМ ТЭ) по сравнению с ее уровнем до начала испытаний - 5,82±0,35 мМ ТЭ (рисунок б), что говорит о возможной активизации антиоксидантных систем организма. Очевидно, употребление продукта может оказывать позитивное влияние на клиническое благополучие пациентов с атопическим дерматитом.

Поскольку у больных с проявлениями атопического дерматита часто отмечаются дисбактериозы, у пациентов до и после употребления продукта был проведен метагеномный анализ ДНК, экстрагированной из кала. В результате зафиксировано более 200 филотипов микроорганизмов (бактерий, архей, грибов), в том числе значительное количество некультивируемых. Как видно из представленных в табл. 2 данных, прием продукта сопровождался изменениями в таксономической структуре микробного сообщества в кишечнике пациентов, при этом установлена достоверная положительная связь между увеличением содержания представителей таксономических порядков, к которым принадлежат бифидо- и лактобактерии, в образцах каловых масс пациентов и приемом продукта (r=0,78 и r=0,69 соответственно), а также достоверная отрицательная связь - с содержанием бактерий рода Fusobacterium sp. (r=-0,69), присутствие больших количеств которых отмечается при различных патологических процессах в толстой кишке.

Заключение

В результате проведенного исследования можно прийти к выводу, что разработанный кисломолочный продукт с заменой 20% молочных белков на гидролизат белков подсырной сыворотки хорошо переносится детьми в возрасте от 3 до 16 лет с легкими проявлениями пищевой аллергии - побочных действий продукта и нежелательных явлений за период приема кисломолочного продукта в течение 14 дней ни в одном случае не отмечено.

Клиническое наблюдение за пациентами с легкими проявлениями пищевой аллергии, получавшими продукт на фоне неспецифической гипоаллергенной диеты, показало положительное влияние продукта на состояние и самочувствие детей. Ежедневное потребление продукта способствовало снижению выраженности некоторых проявлений заболевания, связанных с его патогенетическими механизмами. Так, не отмечено изменения уровней общего белка и циркулирующих в сыворотке крови IgE и IgG антител к β-ЛГ, что указывает на отсутствие у данного продукта аллергенных свойств. У пациентов происходило увеличение АОЕ сыворотки крови по отношению к пероксильному радикалу, а также увеличение содержания бифидо- и лактобактерий в содержимом кишечника, что свидетельствует о повышении антиоксидантной защиты организма и нормализации микробиоценоза толстой кишки.

Это дает основания для признания перспективности использования продукта в качестве продукта диетического (профилактического) питания для людей, страдающих пищевой аллергией в стадии ремиссии, в комплексе с неспецифической гипоаллергенной диетой.

Литература

1. Конь И.Я., Сафронова А.И., Коновалова Л.С. Специализированные продукты питания в профилактике и лечении пищевой аллергии у детей первого года жизни // Леч. врач. 2009. № 7. Раздел "Педиатрия". С. 56-59.

2. Сергеев Ю.В. Атопический дерматит. Современные подходы к диагностике, терапии и профилактике // Медицина для всех. 2001. № 2(19). С. 2-8.

3. Федорович Ж.В., Петрова Д.Т. Пищевая аллергия у детей первого года жизни : учеб.-метод. пособие. Минск : Эдит ВВ, 2007. 49 с.

4. Королева О.В., Агаркова Е.Ю., Ботина С.Г., Николаев И.В. и др. Перспективы использования гидролизатов сывороточных белков в технологии кисломолочных продуктов // Мол. пром-сть. 2013. № 7. С. 66-68.

5. Шевелева С.А., Батищева С.Ю., Кузнецова Г.Г., Семенова Н.Н. и др. Изучение состава лактофлоры толстой кишки у больных с пищевой аллергией и синдромом раздраженной кишки // Вопр. питания. 2011. № 2. С. 26-30.

6. Сенцова Т.Б., Гаппарова К.М., Григорьян О.Н., Ворожко И.В. и др. Клинико-иммунологические проявления пищевой непереносимости у больных с ожирением // Вопр. питания. 2012. Т. 81, № 5. С. 83-87.

7. Сафина И.С. Остеопения недоношенных // Вестн. соврем. клин. мед. 2013. Т. 6, № 5. С. 114-119.

8. Пат. 2531164 Рос. Федерация, МПК А23J. Способ получения низкогидролизованной пептидной композиции из белков молочной сыворотки / Королева О.В., Николаев И.В., Федорова Т.В., Агаркова Е.Ю. и др.; заявитель и патентообладатель (и) Государственное научное учреждение Всероссийский научноисследовательский институт молочной промышленности (RU), Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии имени А.Н. Баха Российской академии наук. № 2013126576 ; заявл. 11.06.2013 ; опубл. 20.10.2014, Бюл. № 29. 15 с.

9. Kahl J., Zalecka A., Ploeger A., Bugel S. et al. Functional food and organic food are competing rather than supporting concepts in Europe // Agriculture. 2012. Vol. 2. P. 316-324.

10. Пат. 2531577 Российская Федерация, МПК А23С. Способ получения кисломолочного продукта с пониженной аллергенностью / Рожкова И.В., Раскошная Т.А., Семенихина В.Ф., Юрова Е.А., Агаркова Е.Ю., Коржов Р.П., Ширшова Т.И., Харитонов В.Д.; заявитель и патентообладатель Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности (RU). № 2013148643 ; заявл. 01.11.2013 ; опубл. 20.10.2014, Бюл. № 29. 7 с.

11. Харитонов В.Д. Проблемы и перспективы молочной промышленности XXI века // Хранение и переработка сельхозсырья. 2000. № 11. С. 16-18.

12. Ou B., Hampsch-Woodill M., Prior R.L. Development and validation of an improved oxygen radical absorbance capacity assay using fluorescein as the fluorescent probe // J. Agric. Food Chem. 2001. Vol. 49. P. 4619-4626.

13. Переделкина О.В., Ровда Ю.И., Миняйлова Н.Н., Крекова Н.П. и др. Состояние прооксидантной и антиоксидантной систем у детей с атопическим дерматитом на фоне стандартного и комбинированного лечения с применением системной озонотерапии // Сибир. мед. журн. 2013. Т. 28, № 1. С. 74-78.

14. Ревякина В.А., Сенцова Т.Б., Моносова О.Ю., Кувшинова Е.Д. и др. Пищевая аллергия и атопический дерматит у детей. Есть ли взаимосвязь? // Иммунопатология, аллергология, инфектология: Международный научно-практический рецензируемый журнал. 2013. № 4. С. 22-27.

15. Сапунцова С.Г., Лебедько О.А., Ковальский Ю.Г., Флейшман М.Ю. и др. Содержание гистамина и антиоксидантный статус при гиперрегенераторных дерматозах // Дальневосточ. мед. журн. 2014. № 2. С. 55-59.