Toxicological assessment of nanostructured silica. III. Microecological, hematological indices, state of cellular immunity

Abstract

This paper is the third in a series of publications on the experimental study of subacute oral toxicity of nanostructured silicon dioxide (SiO2). We used commercial nanostructured SiO2, obtained by hydrolysis of tetrachlorosilane in the gaseous phase, with the size of the primary nanoparticles (NPs) of 5–30 nm. The aqueous dispersion of SiO2 after treatment with ultrasound was administered to rats with initial weight of 80±5 g for the first 30 days by intragastric gavage and further for 60 days with diets in doses of 0,1; 1,0; 10 and 100 mg/kg body weight per day. Animals of the control group were treated with deionized water. The amount of basic and transient populations of gut microbiocenosis, hematological indexes were measured using standard methods. Specific content of the B-lymphocytes (CD45RA+), total T-lymphocytes (CD3+), T-helper cells (CD4+), T-cytotoxic cells (CD8+), NK-cells (CD161a+) in general population of lymphocytes was evaluated by flow cytometry; serum cytokine levels of TNF-α, IL-6, IL-10 were determined by ELISA. No significant changes in the qualitative and quantitative composition of the intestinal microbiota populations regardless of the dose of administered nanomaterial have been found. This gave reason to believe that the postulated mechanism of the toxic effects of the NPs of SiO2, mediated by modification of the composition of the intestinal microflora and the corresponding changes in its functional activity, apparently, is not realized. The main target of nanostructured SiO2 was the T-cellular system of the immune system of animals, that was manifested in the significant decrease of the number of leukocytes (33%), number of T-helper cells (13%), CD4/CD8 ratio (27%) and increasing the number of cytotoxic lymphocytes (19%) and the level of TNF-α (590%). The value of the maximum dose (NOAEL) of nanostructured SiO2, has no effect on T-cell immunity was not more than 100 mg / kg body weight per day.

Keywords:silica, nanoparticles, rats, subacute toxicity, intestinal microbiome, erythrocytes, leukocytes, cellular immunity, cytokines

Вопр. питания. 2015. № 4. С. 55-65.

В настоящее время наноструктурный аморфный диоксид кремния (SiO2) широко используется в качестве пищевой добавки, а также как носитель в составе биологически активных добавок к пище, ароматизаторов, технологических вспомогательных средств и различных лекарственных препаратов. Способ получения этого продукта (гидролиз тетрахлорсилана в парах воды) приводит к образованию первичных частиц размером менее 100 нм, подвергающихся затем частичной агрегации. Содержание наноматериала (НМ) в вышеуказанных видах продукции количественно не нормируется; при этом данные о возможной токсичности in vivo наночастиц (НЧ) SiO2 различного размера и пористости и с различным составом адсорбированных на поверхности веществ противоречивы [2-4, 20, 22, 23, 25]. Ранее нами было охарактеризовано влияние острого [5] и подострого (в течение 92 дней) перорального введения крысам наноструктурного SiO2 на интегральные, морфологические, энзимологические, биохимические показатели, генотоксичность, проницаемость кишечной стенки и состояние когнитивной функции [9, 10].

При этом значительных неблагоприятных эффектов не было установлено в дозе SiO2 до 100 мг на 1 кг массы тела. Целью настоящей работы является поиск наиболее чувствительных биомаркеров токсического действия наноструктурного SiO2 при пероральном пути его поступления, таких, как параметры клеточного звена системы иммунитета, гематологические показатели, состав и функциональная активность кишечного микробиоценоза.

Материал и методы

Наноструктурный SiO2, представляющий собой порошкообразный продукт газофазного гидролиза тетрахлорсилана высокой чистоты, был приобретен в фирме ООО "Силика" (РФ) под торговым наимено- ванием "Орисил 300" по ТУ 24.1-31695418-002-2003.

Согласно представленным в предыдущих публикациях [5,9] данным исследования образца с помощью методов трансмиссионной электронной микроскопии, атомно-силовой микроскопии, спектроакустики и динамического лазерного светорассеяния, размер первичных НЧ образца составлял от 5 до 60 нм; в порошке они были непрочно агрегированы в ассоциаты микронного размера.

В результате обработки ультразвуком (частота 44 кГц, время 5 мин, мощность 1 Вт/см3, температура +2 оС) продукт образовывал в воде стабильный опалесцирующий коллоидный раствор (суспензию), в котором содержалось более 90% от общего числа НЧ диаметром менее 100 нм.

Эксперимент проведен на 75 крысах-самцах линии Вистар исходной массой тела 80±5 г, полученных из питомника "Столбовая". Дизайн и условия эксперимента были подробно изложены в первой публикации [9]. Все животные были разделены на 5 групп равной численности, из них 1-я группа (контроль) получала деионизованную воду, а группы со 2-й по 5-ю - обработанную ультразвуком суспензию НЧ SiO2 в дозах 0,1; 1,0; 10 и 100 мг на 1 кг массы тела ежедневно в расчете на SiO2. Первые 30 дней НМ вводили внутрижелудочно через зонд, а затем добавляли к корму. Общая продолжительность эксперимента составила 92 дня.

Выведение животных из эксперимента осуществляли путем обескровливания из нижней полой вены под эфирной анестезией. Кровь отбирали в антикоагулянт (0,01% по массе трикалиевой соли ЭДТА) для проведения анализа гематологических и иммунологических показателей. Для анализа кишечного микробиоценоза у 6 крыс из каждой группы отбирали лигированную с двух концов слепую кишку, из которой в асептических условиях извлекали содержимое (фекалии) и после его разведения в фосфатно-тиогликолевом буферном растворе количественно засевали в дифференциально-диагностические и селективные среды в соответствии с [7].

Содержание бифидобактерий определяли на тиогликолевой среде; лактобацилл - на среде MRS; бактерий семейства Enterobacteriaceae - на среде Эндо и цитратном агаре, Bacteroides spp. - на неомицин-агаре для бактероидов, бактерий рода Staphylococcus - на желточно-солевом агаре и среде Байрд-Паркера; Streptococcus spp. - на кровяном агаре; Enterococcus spp. - на молочно-ингибиторной среде (МИС), сульфитредуцирующих клостридий - на модифицированной железосульфитной среде; плесневых грибов - на среде Чапека. Содержание микроорганизмов выражали в lg КОЕ/г сырой массы фекалий.

Оценку антагонистической (кислотообразующей) активности популяций бифидобактерий, выделенных из слепой кишки крыс, проводили путем определения рН культуральной жидкости (тиогликолевой среды) на 5-е сутки инкубации с помощью рН-метра. Контролем служила исходная питательная среда. По величине рН среды судили об антагонистической активности бифидобактерий. Критериями служили пределы рН: менее 4,5 - антагонистически активные бифидобактерии; 4,6-5,1 - слабый антагонизм, более 5,1 - отсутствие антагонистической активности.

Гематологические показатели (количество эритроцитов, лейкоцитов, концентрацию гемоглобина, гематокрит, средний объем эритроцита, среднее содержание гемоглобина в эритроците, среднюю концентрацию гемоглобина в эритроците, содержание тромбоцитов, средний объем тромбоцита, тромбокрит, лейкоцитарная формула, незрелые лимфоциты) определяли стандартными методами [6, 8] на гематологическом анализаторе.

Экспрессию антигенных рецепторов CD45RA, CD3, CD4, CD8, CD161a на лимфоцитах периферической крови определяли методом прямого иммунофлуоресцентного окрашивания клеток цельной крови с использованием панели моноклональных антител, конъюгированных с флуоресцентными красителями, и лизирующего/фиксирующего набора реагентов ("Beckman Coulter", США). Анализ окрашенных клеток выполняли на проточном цитофлуориметре "FC-500" ("Beckman Coulter", США) по программе Cytomics CXP Software. Популяцию лимфоцитов выделяли при помощи гейтирования по параметрам малоуглового (FS) и бокового (SS) светорассеяния. Затем производили гейтирование популяции CD3+-лимфоцитов по каналу флуоресценции FL1 и SS Lin. Результаты регистрировали на двухпараметрической гистограмме распределения CD3+ (из гейта В) с использованием моноклональных антител против CD4 и CD8, детектируемых на каналах флуоресценции FL5 и FL4 соответственно. Аналогичным способом в отдельном тесте определяли экспрессию CD45RA и CD161a. Общее содержание CD45RA+ (B-лимфоцитов), CD3+ (Т-лимфоцитов) и CD161a+ (естественных киллеров) выражали в процентах от общего числа проанализированных лимфоцитов (не менее 104 событий для одного животного).

Содержание CD3+CD4+ (Т-хелперов) и CD3+CD8+ (Т-цитотоксических) определяли как их долю (в %) общем количестве CD3+-клеток. Рассчитывали иммунорегуляторный индекс, представляющий собой отношение числа CD4+/CD8+-клеток.

Концентрации цитокинов IL-6, IL-10 и TNF-α в сыворотке крови крыс определяли с использованием коммерческих наборов "Bioscience" ("Bender MedSystems GmbH", Австрия). Оптическую плотность измеряли на автоматическом планшетном фотометре "ЭФОС 9605" ("Сапфир", Россия). Концентрацию цитокинов определяли по стандартному графику с использованием про- граммного обеспечения прибора методом интерполяции.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета SPSS 18.0 согласно критерию Стьюдента, непараметрическим ранговым критериям Краскела-Уоллиса и Манна-Уитни и критерию ANOVA. Различия признавали достоверными при уровне значимости p<0,05.

Результаты и обсуждение

Основные популяции кишечной микробиоты. В табл. 1 приведены количественные характеристики (средние значения и интервалы изменения) основных популяций микробиоты кишечника у крыс 1-5-й групп. Как следует из представленных данных, содержание бифидобактерий, лактобацилл, стафилококков, энтерококков, стрептококков, бактероидов, общее количество аэробных и анаэробных микроорганизмов варьировало в незначительной степени в зависимости от дозы НЧ SiO2 и в пределах погрешности эксперимента не отличалось от значений для контрольной группы (p>0,05). Для энтеробактерий у животных 5-й группы, получавшей наибольшую дозу НЧ SiO2, было характерно выраженное снижение численности популяции, приблизительно на 1,0 ед.

lg КОЕ/г, т.е. в 10 раз. Содержание в кишечнике этих животных Enterococcus faecium, напротив, было повышено в сравнении с контролем на 1,2 lg КОЕ/г, т.е. примерно в 16 раз. Однако с учетом разброса данных между отдельными животными в группах, оба этих различия не являются статистически достоверными (p>0,05). Таким образом, введение наноструктурного SiO2 в течение 3 мес не оказывало значимого воздействия на видовой состав и количество основных популяций кишечной микробиоты, за исключением отдельных маргинальных сдвигов, наблюдавшихся при наибольшей из испытанных доз НЧ SiO2.

Степень закисления культуральной среды бифидобактериями, выделенными от животных 1-й группы, свидетельствует о наличии слабо выраженной антагонистической (кислотообразующей) активности этой микробной популяции (см. табл. 1). Антагонистическая активность сохранялась и у животных во 2-5-й группах, причем степень ее выраженности у животных во 2, 3 и 5-й группах оказалась достоверно выше (p<0,05) по сравнению с контролем. Таким образом, изучаемый НМ, даже в минимальной из вводимых доз, способен влиять на функциональную активность кишечной бифидофлоры в сторону ее повышения, что, во всяком случае, не может рассматриваться как нежелательный (вредный) эффект.

В табл. 2 охарактеризованы количественные параметры транзиторных популяций кишечной микробиоты животных. Ввиду того что ряд микробных популяций определялся только у отдельных животных из каждой группы, их содержание выражено не средними, а медианными значениями. Как показывает статистический анализ, распределение количества соответствующих популяций в целом по всем группам и в сравнении с 1-й группой оказалось однородным (p>0,05 согласно критериям Краскела-Уоллиса и Манна-Уитни), т.е. какого-либо влияния на эти популяции со стороны наноструктурного SiO2 не наблюдалось. В целом можно заключить, что величина максимальной недействующей дозы (NOAEL) для изучаемого НМ по всем показателям микробиоценоза оказывается выше 100 мг на 1 кг массы тела.

Результаты определения гематологических показателей у животных приведены в табл. 3-5.

Как следует из представленных данных, у крыс 4-й группы отмечалось достоверное (p<0,05) снижение численности эритроцитов (на 5%), что сопровождалось достоверным (p<0,05) увеличением среднего объема эритроцита и содержания в нем гемоглобина. Небольшое (на 5%) но достоверное возрастание среднего объема эритроцита наблюдалось также у животных 5-й группы. Остальные показатели, как следует из полученных данных, оставались в опытных группах животных без существенных изменений. Отсутствовали также какие-либо изменения в параметрах, характеризующих состояние тромбоцитов крови животных (табл. 4). Таким образом, изменения, выявленные в состоянии эритроцитов животных, не свидетельствуют, судя по их величине и направленности, о неблагоприятном влиянии наноструктурного SiO2 на систему кроветворения даже в наибольшей из доз. По показателям эритроцитов и тромбоцитов животных величина NOAEL для НМ превышает 100 мг на 1 кг массы тела.

Показатели лейкоцитарной формулы крови (табл. 5) не отличались у животных в 2-5-й группах от контроля, за исключением достоверного (p0,05) и довольно выраженного для этого показателя (на 33%) снижения общего числа лейкоцитов у крыс 5-й группы. Таким образом, величина NOAEL наноструктурного SiO2 по данному показателю находится в интервале 10-100 мг на 1 кг массы тела.

Несмотря на то что относительная численность лимфоцитов в общей популяции лейкоцитов крови демонстрировала только маргинальное (на 7%) и недостоверное снижение у животных 5-й группы, качественный состав лимфоцитов, как видно из данных, представленных на рисунке, сущес- твенно модифицируется: достоверно снижалась доля Т-хелперов (на 13%), возрастала доля цитотоксических лимфоцитов (на 19%), что в совокупности привело к выраженному (на 27%) снижению иммунорегуляторного индекса и дисбалансу иммунного ответа. У животных 5-й группы, получавшей наибольшую дозу НЧ SiO2, также обнаружен дисбаланс уровней основных прои противовоспалительных цитокинов: TNF-α, концентрация которого достоверно повысилась в 6,9 раза, и IL-10, содержание которого имело выраженную (на 36%) тенденцию к снижению.

Это свидетельствует о наличии воспалительной реакции.

Уровень IL-6 в крови животных всех групп оставался ниже предела чувствительности метода (данные не приведены).

Таким образом, как показали результаты гематологических и цитологических исследований, введение животным наноструктурного SiO2 в дозе не менее 100 мг на 1 кг массы тела приводит к выраженным сдвигам в показателях иммунной системы, что может свидетельствовать о проявлении определенного негативного эффекта НЧ в данной дозе.

Исследование влияния наноструктурного SiO2 на биомаркеры токсического действия, включая параметры клеточного звена системы иммунитета, гематологические и микробиологические показатели, проведено в интервале доз от 1 до 100 мг на 1 кг массы тела в условиях подострого (92-суточного) перорального введения крысам. Согласно существующим оценкам [25], суточная нагрузка на человека НЧ SiO2, поступающими с пищей, может достигать 1,8 мг на 1 кг массы тела, что близко к минимальной из доз, охарактеризованных в настоящем исследовании. Вместе с тем даже максимальная, 100-кратно аггравированная доза этого НМ была по крайней мере в 50 раз ниже LD50, которая составляет более 5000 мг на 1 кг массы тела [5].

Отсутствие выраженного неблагоприятного воздействия наноструктурного SiO2 на состав и количество основных и транзиторных популяций кишечной микробиоты показывает, что постулируемый возможный механизм токсического воздействия различных НМ, опосредованный модификацией состава кишечной микрофлоры и соответствующими изменениями ее функциональной активности [12, 17], в данном случае, по-видимому, не реализуется. Хотя влияние на микрофлору имело место, однако оно выражалось в определенной активации функциональной активности симбиотической бифидофлоры, вне четкой зависимости от дозы вводимого НМ. Для выводов о причинах этого эффекта в настоящее время недостаточно данных; сведения о влиянии наноструктурного SiO2 на бифидобактерии в доступной литературе отсутствуют. Можно предположить, что наблюдаемый эффект каким-то образом связан с высокой сорбционной способностью НЧ SiO2, обусловленной его большой удельной поверхностью. Следствием этого может быть сорбция и удаление из "зоны действия" определенных бактериальных метаболитов или других эндогенных факторов, ингибирующих функциональную активность бифидофлоры.

Как показали результаты оценки системных показателей организма животных, основной мишенью воздействия перорально вводимых НЧ SiO2 является иммунная система, а именно Т-клеточное звено иммунитета. Это находит выражение в уменьшении числа Т-хелперов и возрастании цитотоксических Т-клеток, в снижении иммунорегуляторного индекса и повышении уровня циркулирующего TNF-α. Как известно, TNF-α является провоспалительным цитокином, синтезируемым активированными макрофагами на ранних стадиях иммунного ответа, проявляющим эффекты цитотоксичности, активации катаболизма и оказывающим разнообразные иммунорегуляторные воздействия [19, 24]. Есть данные, в частности, о его способности подавлять активность Т-хелперного звена иммунитета, играющей определенную роль в патогенезе ВИЧ-инфекции [14]. Выявленное усиление продукции TNF-α под действием НЧ SiO2 в дозе 100 мг на 1 кг массы тела может рассматриваться как один из показателей иммуномодулирующего действия, наряду со снижением уровня Т-хелперов и величины иммунорегуляторного индекса.

Обсуждая возможные механизмы воздействия НЧ SiO2 на клетки иммунной системы in vivo, следует упомянуть, что в литературе имеются свидетельства неблагоприятного воздействия этого НМ на иммунологические и гематологические показатели. В их числе - усиление продукции провоспалительных цитокинов [16], агрегация тромбоцитов [13], гемолиз [18]. Однако все эти результаты были получены в тестах in vitro, когда действующая на клетки доза НЧ может быть значительно завышена в сравнении с условиями in vivo. При введении НЧ SiO2 крысам внутрибрюшинно отмечены сдвиги в функции перитонеальных макрофагов, повышении продукции IL-1β, TNF-α, NO, экспрессии генов IL-1,6, TNF-α, синтазы оксида азота, циклооксигеназы-2 [20]. По данным работы [22], ингаляция НЧ SiO2 мышам вызывала у них легочный нейтрофилез, сопровождаемый повышенной экспрессией TNF-α и нейтрофил-привлекающего хемокина CXCL1 в легочной ткани. НЧ SiO2 были также способны усиливать интраназальную аллергическую сенсибилизацию мышей овальбумином [27].

В работе [25] изучали подострую (в 84-дневном эксперименте) пероральную токсичность двух видов наноструктурированного SiO2 при пероральном введении крысам в очень высоких дозах (100-2500 мг на 1 кг массы тела ежедневно). При этом были отмечены дозозависимое усиление фиброза в печени и экспрессия генов, ответственных за этот процесс. По этим показателям авторы оценивают пороговую дозу (LOAEL) НЧ SiO2 при подострой пероральной экспозиции величиной 2500 мг на 1 кг массы тела. Отсутствие наблюдаемых эффектов при меньших дозах вводимого НМ свидетельствует, по-видимому, о недостаточной чувствительности изученного в данной работе набора биомаркеров.

Попытки количественно оценить всасывание и бионакопление SiO2 в органах и тканях крыс методом химического анализа (с использованием масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой) приводят к неоднозначным результатам ввиду высокого фонового уровня кремния в органах животных контрольной группы. На качественном уровне было констатировано достоверное увеличение содержания кремния в печени и селезенке животных, получавших НЧ SiO2 в дозах более 1000 мг на 1 кг массы тела [25]. Вместе с тем имеется ряд косвенных свидетельств возможности всасывания в кишечнике НЧ различных видов [11, 15, 21, 26]. В результате поступления НЧ в кровь становится возможным усиление презентации антигенов иммунокомпетентным клеткам вследствие их адсорбции на частицах с последующим усилением иммунного ответа. Как было показано в нашей работе [1], внутрижелудочное введение крысам НЧ диоксида титана в кристаллической модификации рутила приводит к выраженным сдвигам в показателях иммунной системы как у не иммунизированных, так и у иммунизированных овальбумином животных. В сравнении с результатами данного исследования, полученными на НЧ SiO2, имеющими форму, близкую к сферической, это показывает, что иммунотропные эффекты оксидных НМ, повидимому, специфичны для формы и химического состава частиц и должны быть детально изучены в каждом отдельном случае.

Литература

1. Арианова Е.А., Шумакова А.А., Тананова О.Н., Трушина Э.Н. и др. Влияние наночастиц диоксида титана на показатели иммунной системы у крыс // Вопр. питания. 2012. T. 84. № 6. С. 47-53.

2. Верников В.М., Распопов Р.В., Арианова Е.А., Тананова О.Н. и др. Токсиколого-гигиеническая оценка препаратов наноструктурированного диоксида кремния в эксперименте на лабораторных животных // Инновационные технологии в управлении, образовании, промышленности "АСТИНТЕХ-2010". Астрахань : ИД "Астраханский университет", 2010. С. 4-7.

3. Зайцева Н.В., Землянова М.А., Звездин В.Н., Саенко Е.В. Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности водной суспензии нанодисперсного диоксида кремния, синтезированного методом жидкокристаллического темплатирования // Анализ риска здоровью. 2013. № 1. С. 65-72.

4. Зайцева Н.В., Землянова М.А., Лебединская О.В., Звездин В.Н. и др. Влияние нанодисперсного диоксида кремния на структурные особенности внутренних органов экспериментальных животных // Морфология. 2013. Т. 144, № 5. С. 78-79.

5. Зайцева Н.В., Землянова М.А., Звездин В.Н., Довбыш А.А. и др. Токсикологическая оценка наноструктурного диоксида кремния. Параметры острой токсичности // Вопр. питания. 2014. Т. 83, № 2. С. 42-49.

6. Лабораторные методы исследования в клинике : справочник / под ред. В.В. Меньшикова. М. : Медицина, 1987. 368 с.

7. МУ 1.2.2634-10 "Микробиологическая и молекулярно генетическая оценка воздействия наноматериалов на представителей микробиоценоза".

8. Роскин Г.И., Левинсон Л.Б. Микроскопическая техника. М. : Сов. Наука, 1957. 467 с.

9. Шумакова А.А., Арианова Е.А., Шипелин В.А., Сидорова Ю.С. и др. Токсикологическая оценка наноструктурного диоксида кремния. I. Интегральные показатели, аддукты ДНК, уровень тиоловых соединений и апоптоз клеток печени // Вопр. питания. 2014. Т. 83, № 3. С. 52-62.

10. Шумакова А.А., Авреньева Л.И., Гусева Г.В., Трусов Н.В. и др. Токсикологическая оценка наноструктурного диоксида кремния II. Энзимологические, биохимические показатели, состояние системы антиоксидантной защиты // Вопр. питания. 2014. Т. 83, № 4. С. 58-66.

11. Behrens I., Pena A.I., Alonso M.J., Kissel T. Comparative uptake studies of bioadhesive and non-bioadhesive nanoparticles in human intestinal cell lines and rats: the effect of mucus on particle adsorption and transport // Pharm. Res. 2002. Vol. 19, N 8. P. 1185-1193.

12. Bu Q., Yan G., Deng P., Peng F. et al. NMR-based metabonomic study of the sub-acute toxicity of titanium dioxide nanoparticles in rats after oral administration// Nanotechnology. 2010. Vol. 10. Article ID 125105. doi: 10.1088/0957-4484/21/12/ 125105.

13. Corbalan J.J., Medina C., Jacoby A., Malinski T., Radomski M.W. Amorphous silica nanoparticles aggregate human platelets: potential implications for vascular homeostasis // Int. J. Nanomedicine. 2012. Vol. 7. P. 631-639.

14. Hober D., Haque A., Wattre P., Beaucaire G. et al. Production of tumour necrosis factor-alpha (TNF-alpha) and interleukin-1 (IL-1) in patients with AIDS. Enhanced level of TNF-alpha is related to a higher cytotoxic activity // Clin. Exp. Immunol. 1989. Vol. 78, N 3. P. 329-333.

15. Jani P., Halbert G.W., Langridge J., Florence A.T. Nanoparticle uptake by the rat gastrointestinal mucosa: quantitation and particle size dependency // Pharm. Pharmacol. 1990. Vol. 42. P. 821-826.

16. Kasper J., Hermanns M.I., Bantz C., Maskos M. et al. Inflammatory and cytotoxic responses of an alveolar-capillary coculture model to silica nanoparticles: Comparison with conventional monocultures // Part. Fibre Toxicol. 2011. Vol. 8. P. 1-6.

17. Kish L., Hotte N., Kaplan G.G., Vincent R. et al. Environmental particulate matter induces murine intestinal inflammatory responses and alters the gut microbiome // PLoS One. 2013. Vol. 8, N 4. Article ID e62220

18. Lin Y.S., Haynes C.L. Impacts of mesoporous silica nanoparticle size, pore ordering, and pore integrity on hemolytic activity // J. Am. Chem. Soc. 2010. Vol. 132, N 13. P. 4834-4842.

19. Murray J., Barbara J., Dunkley S., Lopez A. et al. Regulation of neutrophil apoptosis by tumor necrosis factor-: requirement for TNFR55 and TNFR75 for induction of apoptosis in vitro // Blood. 1997. Vol. 90, N 7. P. 2772-2783.

20. Park E.J., Park K. Oxidative stress and pro-inflammatory responses induced by silica nanoparticles in vivo and in vitro // Toxicol. Lett. 2009. Vol. 184, N 1. P. 18-25.

21. Rieux A., Fievez V., Theate I., Mast J. et al. An improved in vitro model of human intestinal follicle-associated epithelium to study nanoparticle transport by M cells // Eur. J. Pharm. Sci. 2007. Vol. 30, N 5. P. 380-391.

22. Rossi E.M., Pylkkanen L., Koivisto A.J., Vippola M. et al. Airway exposure to silica-coated TiO2 nanoparticles induces pulmonary neutrophilia in mice// Toxicol. Sci. 2010. Vol. 113, N 2. P. 422-433.

23. Sayes C.M., Reed K.L, Glover K.P., Swain K.A. et al. Changing the dose metric for inhalation toxicity studies: short-term study in rats with engineered aerosolized amorphous silica nanoparticles // Inhal. Toxicol. 2010. Vol. 22, N 4. P. 348-354.

24. Strieter R., Kunkel S., Bone R. Role of tumor necrosis factor-alpha in disease states and inflammation // Crit. Care Med. 1993. Vol. 21, suppl. 10. P. S447-S463.

25. Van der Zande M. , Vandebriel R.J. , Groot M.J. , Kramer E. et al. Subchronic toxicity study in rats orally exposed to nanostructured silica// Part. Fibre Toxicol. 2014. Vol. 11. P. 8.

26. Volkheimer G. Passage of particles through the wall of the gastrointestinal tract // Environ. Health Perspect. 1974. Vol. 9, N 12. P. 215-225.

27. Yoshida T., Yoshioka Y., Fujimura M., Yamashita K. et al. Promotion of allergic immune responses by intranasally-administrated nanosilica particles in mice // Nanoscale Res. Lett. 2011. Vol. 6, N 1. P. 192-204.