Non-enzymatic glycosylation of dietary protein in vitro

Abstract

Non-enzymatic glycosylation of proteins, based on discovered by Mayarn reaction of carbohydrate aldehyde group with a free amino group of a protein molecule, is well known to experts in biochemistry of food industry. Generated brown solid in some cases give the product marketable qualities – crackling bread – in others conversely, worsen the product. The biological effects of far-advanced products of non-enzymatic protein glycosylation reaction have not been studied enough, although it was reported previously that they are not split by digestive enzymes and couldn’t be absorbed by animals. The objective of this work was to compare the depth of glycosylation of different food proteins of animal and vegetable origin. The objects of the study were proteins of animal (casein, lactoglobulin, albumin) and vegetable (soy isolate, proteins of rice flour, buckwheat, oatmeal) origin, glucose and fructose were selected as glycosylation agents, exposure 15 days at 37° C. Lactoglobulin was glycosylated to a lesser extent among the proteins of animal origin while protein of oatmeal was glycosylated in the least degree among vegetable proteins. Conversely, such proteins as casein and soya isolate protein bound rather large amounts of carbohydrates. Fructose binding with protein was generally higher than the binding of glucose. The only exception was a protein of oatmeal. When of glucose and fructose simultaneously presented in the incubation medium, glucose binding usually increased while binding of fructose, in contrast, reduced. According to the total amount of carbohydrate (mcg), which is able to attach a protein (mg) the studied food proteins located in the following order: albumin (38) > soy protein isolate (23) > casein (15) > whey protein = rice flour protein (6) > protein from buckwheat flour (3) > globulin (2) > protein of oatmeal (0,3). The results obtained are to be used to select the optimal combination of proteins and carbohydrates, in which the glycosylation during storage will be minimal.

Keywords:glycosylation of proteins, casein, lactoglobulin, albumin, soy, buckwheat, rice, oatmeal, fructose, glucose

Вопр. питания. - 2015. - № 2. - С. 76-80.

Неферментативное гликозилирование белков, в основе которого лежит открытая Майаром (Maillard) реакция альдегидной группы углевода со свободной аминогруппой молекулы белка, известно специалистам в области биохимии пищевой промышленности [2, 3, 5]. Образующиеся вещества коричневого цвета в одних случаях придают продукту товарные качества - поджаристая корочка хлеба, в других, напротив, их ухудшают. Биологическое действие продуктов далеко зашедшей реакции неферментативного гликозилирования белков изучено еще недостаточно, хотя уже сообщалось, что они не расщепляются пищеварительными ферментами и не усваиваются животными [1, 4]. Помимо глюкозы - классического участника реакции Майара - аналогичные продукты образуют при взаимодействии с белками и другие монои дисахариды, в том числе сахарозу и лактозу, хотя механизм реакции при этом неясен [4].

Кетогруппа также реагирует с аминогруппой молекулы белка, образуя после перегруппировки Хейтса глюкозамин. Свободную кетогруппу имеет фруктоза, использование которой в питании человека считается перспективным, в частности в лечебном питании. Каковы свойства фруктозы как агента гликозилирования? Из практики известно, что ее включение в рецептуру кулинарных изделий требует более мягкой термической обработки, чтобы избежать слишком сильного потемнения продукта. Экспериментальных работ, в которых изучалось гликозилирование белков фруктозой, мало, и их результаты противоречивы: по некоторым данным, гемоглобин фруктоза гликозилирует так же, как глюкоза или несколько слабее. По данным других авторов, альбумин сыворотки связывает фруктозу значительно активнее, чем глюкозу. Выяснение этого вопроса было одной из задач проведенной работы. Изучение других углеводов в качестве гликозилирующих агентов еще только начинается. В экспериментальных исследо- ваниях показано, что рибоза, манноза и галактоза в условиях in vitro являются более сильными гликозилирующими агентами, чем глюкоза и фруктоза.

К числу нетрадиционных углеводов, роль которых в питании человека может возрасти, относится ксилоза, интерес к которой связан с наличием ее в качестве возможной и естественной примеси в растительных продуктах и углеводах биотехнологического производства.

В последние 10-15 лет интерес исследователей к неферментативному гликозилированию белков резко возрос и его изучение приняло другое направление. Причиной этого было получение рядом авторов [4] данных о том, что эта реакция хотя и много медленнее, но все же вполне ощутимо протекает и в живом организме, т.е. при температуре 37 °С и при реальных концентрациях глюкозы в среде. Уже выполненные исследования показывают, что такие реакции могут оказывать влияние на многие процессы обмена веществ в организме.

Также установлено, что реакция неферментативного гликозилирования легко протекает с участием ряда белков, входящих в состав нервной ткани, белков свертывающей системы крови, ДНК.

С этой точки зрения и с учетом отмеченной выше разной гликозилирующей активности различных углеводов необходимо обращать внимание на углеводный состав продуктов. Кроме этого, необходимо отметить, что образовавшиеся в результате реакции Майара белково-углеводные комплексы обладают выраженным аллергическим действием [1]. Это повышает аллергенность молочных продуктов, а также снижает их биологическую ценность, так как связавшаяся определенная часть белка с углеводом не усваиваетсяорганизмом [2].

Цель исследования заключалась в том, чтобы сравнить глубину гликозилирования разных пищевых белков животного и растительного происхождения. В качестве агентов гликозилирования выбраны глюкоза и фруктоза. Полученные результаты предполагается использовать для выбора оптимальных комбинаций белков и углеводов, при которых гликозилирование в ходе термической обработки и дальнейшего хранения пищевых продуктов будет минимальным.

Материал и методы

В работе использованы белки: альбумин ("Реанал", Франция) и рибонуклеаза ("Кох-Лайт", Германия) в качестве стандартов, наиболее полно изученных по способности гликозилироваться; белки молочной сыворотки, казеин, лактоглобулин и белковые препараты из муки риса, гречки, толокна и соевого изолята. Последние получали экстракцией 0,2 М фосфатным буфером (pH 7,3-7,4) при 37 °С в течение 2 ч с последующим диализом в течение суток при 2 °С против дистиллированной воды и высушиванием на сублимационной сушке.

Использованные углеводы: глюкоза ("Серва", Германия) и фруктоза ("Суомен Сокери", Финляндия).

Реакцию гликозилирования проводили по общепринятой схеме: в фосфатном буфере (0,2 М, pH 7,3-7,4) растворяли белок и соответствующий углевод, концентрация белка 1 мг/мл, концентрация каждого углевода 2 мг/мл, конечный объем пробы 5 мл. Для количественной оценки реакции добавляли индикаторное количество 6-3Н-глюкозы, 6-14С-глюкозы или равномерномеченную 14С-фруктозу. Для создания антисептических условий добавляли хлороформ, пробы герметически закрывали и инкубировали в течение 15 сутпри 37 °С.

По окончании инкубации в первой серии опытов измеряли спектр светопоглощения. Поскольку углеводы сами по себе темнеют в таких условиях вследствие реакции карамелизации, их удаляли диализом пробы при 2 °С в течение 1 сут против дистиллированной воды или измеряли светопоглощение одновременно инкубировавшихся растворов углеводов. В основной серии экспериментов реакцию гликозилирования оценивали по связыванию радиоактивного углевода. В этом случае из аликвоты раствора осаждали белок 10%-ной трихлоруксусной кислотой (ТХУ), промывали осадок 5%-ной ТХУ до полного исчезновения радиоактивности в надосадочной жидкости, растворяли его в 0,25 н NаОН и этот раствор использовали для определения радиоактивности, связавшейся с белком. Зная концентрацию реагентов и исходную радиоактивность углевода, рассчитывали количество единиц последнего, связавшегося с единицей массы белка. Радиоактивность измеряли в сцинтилляционном счетчике "RackBeta 1215" ("LKB-Wallac", Швеция).

Каждый белковый препарат инкубировали с раствором, содержащим либо только глюкозу, либо только фруктозу или содержащим глюкозу и фруктозу вместе. Для каждого варианта эксперимент проводили в 3 повторностях.

Результаты и обсуждение

Использование глюкозы и фруктозы, меченных радиоактивными 14С и 3Н, дало возможность уточнить количественную сторону протекающих реакций. Полученные результаты представлены в таблице, из которой видно, что связывание глюкозы и фруктозы разными изучавшимися белками сильно различалось. Среди белков животного происхождения в меньшей степени гликозилировался лактоглобулин. Из растительных белков в наименьшей степени гликозилировался белок из толокна.

Напротив, такие белки, как казеин и белок соевого изолята, связывали сравнительно большое количество углеводов. Связывание фруктозы с белком, как правило, было более высоким, чем связывание глюкозы. Исключение составлял только белок из толокна. При одновременном присутствии в инкубационной среде глюкозы и фруктозы связывание глюкозы, как правило, повышалось, а связывание фруктозы, напротив, несколько снижалось.

Для систематизации этих закономерностей можно представить полученные результаты в относительных величинах. За единицу принимается количество радиоактивности глюкозы, связавшееся с данным белком при инкубации в растворе, содержащем одну глюкозу. Радиоактивность фруктозы, связавшейся с белком при инкубации с одной фруктозой, так же как радиоактивность, связавшуюся с белком при инкубации с раствором глюкозы и фруктозы в присутствии 6-3Н-глюкозы и 14С-фруктозы, выражали относительно этой величины.

Полученные результаты, позволяют сделать следующие выводы. В первой группе белков - альбумин, рибонуклеаза - при инкубации с раствором, содержащим один углевод, на одну часть глюкозы связывается в 3 (рибонуклеаза) и 4 раза (альбумин) больше фруктозы. При одновременном присутствии глюкозы и фруктозы количество связавшейся с белком глюкозы остается прежним, а связывание фруктозы снижается, причем таким образом, что суммарное количество связавшейся с белком радиоактивности глюкозы и фруктозы оказывается равным тому, которое имеет место при инкубации с раствором фруктозы. Можно предположить, что в молекуле белка этой группы имеется некоторое число центров, по которым может происходить гликозилирование, и при инкубации с фруктозой все они оказываются задействованными. При инкубации с глюкозой гликозилируется только одна четвертая часть (альбумин) или одна треть (рибонуклеаза) этих центров. При инкубации с двумя углеводами глюкоза занимает свое место, а остальные связываются с фруктозой.

Вторая группа белков - большая часть из исследованных - характеризуется тем, что при инкубации с двумя углеводами связывание глюкозы оказывается в той или иной степени повышенным по сравнению с ее связыванием при инкубации в растворе только глюкозы. Связывание фруктозы при одновременном наличии обоих углеводов снижается. Соотношение уровней гликозилирования глюкозой и фруктозой индивидуально для каждого белка. Округляя величины, можно считать, что в отсутствие конкуренции фруктоза как гликозилирующий агент превосходит глюкозу для белка из гречневой муки, сывороточных белков, казеина, белков из муки сои и муки риса соответственно в 1,5; 2,9; 3,8; 5,1 и 5,7 раза. И чем более высоким оказывается это соотношение, тем более четко проявляется тенденция к повышенному связыванию глюкозы при одновременном наличии в инкубационной среде глюкозы и фруктозы. Можно предположить, что присоединение фруктозы к белку так видоизменяет его молекулу, что она становится более доступной для гликозилирования глюкозой. Как видно из таблицы, сумма связавшихся с белком глюкозы и фруктозы при раздельной инкубации с каждым из этих углеводов близка к их суммарному связыванию в условиях конкуренции. Можно предполагать, что белки этой группы имеют центры гликозилирования, специфичные для глюкозы и фруктозы: в отсутствие конкуренции каждый из этих углеводов реагирует только со своими центрами.

Если же они присутствуют вместе, то, как уже было отмечено, присоединение фруктозы делает часть ее центров доступными для связывания с глюкозой.

По суммарному количеству углевода (мкг), которое способен присоединить белок (мг), изученные пищевые белки располагались в следующем порядке: альбумин (38) > белок из соевого изолята (23) > казеин (15) > сывороточные белки = белок из рисовой муки (6) > белок из гречневой муки (3) > глобулин (2) > белок толокна (0,3) (см. рисунок).

Заключение

Проблема неферментативного гликозилирования белков имеет два аспекта. Первый - технологический, касающийся качества пищевых продуктов. Его можно считать традиционным.

Но в наше время он получил новую остроту в связи с увеличением использования монои дисахаридов и их метаболитов в питании человека. Для современного питания характерно также увеличение квоты пищевых продуктов, готовых к употреблению (сухих и жидких), консервированных продуктов длительного хранения. Между тем процессы гликозилирования идут даже при хранении пищевых продуктов в условиях вечной мерзлоты, как это обнаруживается при находках старых продовольственных складов полярных экспедиций. Подбор соответствующих белков и углеводов может быть важен для сохранения качества пищевых продуктов при хранении.

Второй аспект связан с неферментативным гликозилированием в организме человека. Несмотря на то что этот вопрос начали изучать совсем недавно, уже имеющиеся данные убедительно доказывают его значимость, особенно при ряде патологических состояний. В связи с этим повышаются требования к выбору используемых при производстве пищевых продуктов сахаров и консервантов. Такие углеводы, как фруктоза, которая находит все более широкое применение, входя в виде примеси в естественные растительные продукты и в сахара биотехнологического производства, являются более мощными гликозилирующими агентами, чем глюкоза.

Литература

1. Бахна С.Л., Хейнер Д.К. Аллергия к молоку. - М.: Медицина, 1985. - С. 20-21.

2. Бедных Б.С., Антипова Т.А.. Сергеев В.Н. Использование различных углеводных компонентов в питании детей раннего возраста. - М.: АгроНИИТЭИММП, 1989. - С. 20-21.

3. Бедных Б.С. Неферментативное гликозилирование белков // Переработка молока. - 2014. - № 2. - С. 12-13.

4. Вировец О.А. Неферментативное гликозилирование (реакция Майара) в организме // Вопр. питания. - 1988. - № 5. - С. 4-9.

5. Maillard C. Reactions in food // Prog. Food Nutr. Sci. - 1981. - Vol. 5. - N 1-6.