Lead toxicity at its joint administration with nanostructured silica

Abstract

Nanoparticles (NPs) are present in the composition of the objects in the environment and foods together with contaminants of conventional nature, and may enhance their toxicity in certain conditions. The aim of this work was to study the effect of nanostructured silicon dioxide (SiO2), widely used as a food additive, on the accumulation and manifestation of the toxic effect of lead (Pb) when co-administered to rats in the subacute experiment. Rats were divided into 6 groups. Animals of the 1st group (control) received distilled water intragatrically by gavage. Rats of the 2nd and 3rd groups received dispersion of SiO2 NPs with primary particle size of 5–30 nm in the doses of 1 and 100 mg/kg body weight, respectively, of Group 4 – lead acetate in the dose of 20 mg of lead/kg body weight, group 5 and 6 – Pb acetate and SiO2 NPs dispersion in doses, respectively 1 and 100 mg/kg body weight, for 22 days by intragastric gavage. The weight of the body and organs, standard haematological parameters, serum protein, creatinine, uric acid, albumin, glucose level, and alkiline phosphatase, ALT and AST activity, urinary 5-aminolevulinic acid (ALA) were determined. Hepatocyte apoptosis was studied by flow-cytometry. The content of Pb, cadmium (Cd), arsenic (As), selenium (Se), iron (Fe), zinc (Zn), copper (Cu), chromium (Cr), manganese (Mg), aluminum (Al) and cobalt (Co) in organs (liver, kidney, brain) was determined by ICP-MS. The result showed that the introduction of Pb, but not NPs resulted in a significant increase in the mass of the kidneys and testes. Urinary excretion of 5-ALA in animals from groups 4–6 significantly (p<0,001) increased, compared with animals 1–3 groups, not influenced by SiO2 NPs administration (p>0,05). Introduction of SiO2 NPs resulted in a dose-dependent increase in blood hemoglobin, the effect of lead on this index had the opposite direction. Marked changes were noticed in the levels of glucose and serum albumin in combined exposure of Pb and NPs. No additional adverse effect was noticed in Pb co-administration with NPs on haematological parameters and hepatocyte apoptosis. Pb accumulation was revealed in the liver, kidneys and brain in animals of groups 4–6, which was not enhanced by the combined effects of NPs (p>0,05). The average biosubstrates content of Cd, As, Se, Zn, Cu, Al, Cr, Mn, Co was similar in animals treated and untreated with Pb, and demonstrated no dependence on NPs dose. The only alleged adverse impact on the trace element profile was almost twofold significant increase in the content of Al in the liver in animals treated with lead and SiO2 NPs in the highest dose (0,859±0,085 mg/kg vs 0,468±0,065 mg/kg in the 4th group, p<0,05). In the absence of lead exposure, this effect was not observed. Thus, there wasn’t obtained any unequivocal evidence of lead adverse effects potentiation in the case of a joint income with SiO2 NPs. Moreover, for some indicators, such as weight gain, serum AST activity, hemoglobin concentration, erythrocyte parameters, the introduction of the SiO2 NPs «abolished» to a certain extent some of the adverse effects of lead, which may be due to the effects of its enterosorption. Investigation of the influence of different types of NPs on the intestinal absorption and toxicity of various chemical contaminants should be continued.

Keywords:nanoparticle(s), silica, lead, rats, toxicity, trace elements, ICP-MS

Вопр. питания. - 2015. - № 2. - С. 10-18.

Наночастицы (НЧ) и наноматериалы (НМ) вследствие своей высокой дисперсности обладают комплексом физико-химических свойств, отличающих их от аналогичных химических веществ в виде протяженных фаз или макроскопических дисперсий. Ввиду этого оценка потенциальных рисков, создаваемых НЧ и НМ для здоровья человека, представляет собой важную задачу [3, 4, 12].

При этом необходимо иметь в виду, что НЧ присутствуют в составе объектов окружающей среды и в пищевых продуктах в комплексном химическом окружении, в том числе вместе с токсикантами традиционной природы. Известная для НЧ и НМ способность усиливать транспорт химических веществ и лекарственных препаратов в клетки и через барьеры организма [13, 14] делает актуальной постановку вопроса о возможном потенцировании токсического действия химических контаминантов пищи при их совместном поступлении в организм. Целью работы явилось изучение влияния НЧ диоксида кремния (НЧ SiO2), широко используемого в качестве пищевой добавки, на накопление и проявление токсического действия Pb при совместном многократном внутрижелудочном введении крысам в подостром эксперименте.

Материал и методы

Эксперимент проведен на 62 крысах-самцах линии Вистар с исходной массой тела 113-157 г, полученных из питомника "Столбовая". Крыс содержали в пластмассовых клетках по 3-4 особи и кормили на протяжении всего эксперимента сбалансированным полусинтетическим рационом согласно МУ 1.2.2520-09 "Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов".

Доступ к корму и питьевой воде не ограничивали. Условия содержания и работы с животными соответствовали действующим российским требованиям (приказ Минздравсоцразвития России от 23.08.2010 № 708н "Об утверждении Правил лабораторной практики").

Крысы были разделены на 6 групп по 10-11 особей в каждой. Животным 1-й (контрольной) группы вводили внутрижелудочно через зонд дистиллированную воду из расчета 1 мл на 100 г массы тела животного. Крысы 2-й и 3-й групп получали водную дисперсию НЧ SiO2 в дозах 1 и 100 мг/кг массы тела соответственно. Крысам 4-й группы вводили внутрижелудочно раствор ацетата Pb в дозе 20 мг/кг массы тела (в расчете на Pb) в целях воспроизведения модели свинцовой интоксикации [6], а крысам 5-й и 6-й групп на фоне введения ацетата Pb в той же дозе дополнительно вводили дисперсию НЧ SiO2 в дозах соответственно 1 и 100 мг/кг массы тела. Внутрижелудочные введения указанных препаратов осуществляли ежедневно в фиксированное время.

В работе использован коммерческий препарат высокодисперсного аморфного SiO2 "Орисил 300" (по ТУ 24.1-31695418-002-2003) с удельной площадью поверхности образца 300 м2/г (ООО "Силика", Московская обл., г. Долгопрудный).

Согласно исследованию методами электронной и атомно-силовой микроскопии [2], образец был представлен первичными НЧ SiO2 диаметром от 5 до 30 нм, агрегированными в рыхлые кластеры субмикронного размера. После ультразвуковой диспергации (44 кГц, 2 Вт/мл, 5 мин при температуре 2-4 оС) средний гидродинамический диаметр частиц в водной дисперсии, по данным динамического лазерного светорассеяния, составлял 56,6±32,1 нм (M±S.D.). В качестве модельного токсиканта использовали Pb уксуснокислый трехводный (далее - ацетат Pb) х.ч. (ООО "Хромресурс", РФ), соответствующий ГОСТ 1027-67.

В ходе эксперимента у крыс всех групп ежедневно определяли массу тела на электронных весах с точностью ±0,5 г. На 20-й день эксперимента проводили сбор суточной мочи, в которой определяли 5-аминолевуленовую кислоту (5-АЛК) спектрофотометрическим методом с использованием наборов фирмы "Biosystems S.A" (Испания).

На 23-й день под эфирной анестезией у животных осуществляли отбор органов и тканей в соответствии с МУ 1.2.2745-10 "Порядок отбора проб для характеристики действия наноматериалов на лабораторных животных". Определение массы внутренних органов, стандартных биохимических и гематологических показателей проводили, как описано ранее [10]. Апоптоз гепатоцитов изучали методом проточной цитофлуориметрии с окрашиванием FITC-аннексином V (AnV-FITC) и 7-аминоактиномицином (7-AAD). Принцип метода и процедура анализа изложены в работах [7-9]. Содержание Pb, кадмия (Cd), мышьяка (As), селена (Se), железа (Fe), цинка (Zn), меди (Cu), хрома (Cr), марганца (Mn), алюминия (Al) и кобальта (Co) в органах (печень, почки, головной мозг) определяли методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой на приборе серии 7700х ("Agilent Technologies", Япония).

Минерализацию биологических образцов осуществляли концентрированной азотной кислотой и концентрированной перекисью водорода в соотношении 5:1 в автоматизированной микроволновой системе пробоподготовки "TOPWAVE" ("Analytic Jena", Германия).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета SPSS 20.0 согласно критерию Стьюдента, непараметрическому ранговому критерию Манна-Уитни и однофакторному дисперсионному анализу ANOVA. Различия признавали достоверными при уровне значимости р<0,05.

Результаты

Состояние животных, масса тела, масса внутренних органов

На протяжении 22 дней внутрижелудочного введения исследуемых препаратов наблюдали гибель 2 крыс в 3-й группе, 1 - в 4-й группе, 1 в 5-й группе и 4 - в 6-й группе. Вскрытие всех павших животных показало, что гибель наступила от двусторонней пневмонии, которая развивалась, как можно предположить, вследствие случайной аспирации вводимой через зонд суспензии, содержащей НЧ и ацетат свинца. Остальные животные всех опытных групп по своему внешнему виду, состоянию шерстяного покрова и слизистых оболочек, двигательной активности, поведению не отличались от животных контрольной группы. У животных 3-6-й групп наблюдалось некоторое снижение прироста массы тела по сравнению с животными контрольной группы, однако только у животных 6-й группы, которым вводили ацетат Pb и наноструктурный SiO2, эти различия были достоверными (табл. 1). Однофакторный дисперсионный анализ показал, что причиной снижения прибавки массы тела у животных 4-6-й групп является введение Pb (p<0,05, ANOVA), но не НЧ SiO2. В то же время у животных 3-й группы, получавших только НЧ SiO2 в дозе 100 мг/кг массы тела, также наблюдалось снижение прироста массы тела, которое было более выраженным у животных 6-й группы, получавших НЧ SiO2 в той же дозе в сочетании со Pb. Относительная масса почек и семенников, составлявшая у животных контрольной группы соответственно 0,62±0,02 и 0,94±0,03%, достоверно увеличивалась у животных 4-й группы, получавших Pb, до 0,77±0,02 и 1,07±0,04% и у животных, получавших Pb с НЧ SiO2 в обеих дозах (0,75±0,02 и 1,07±0,04% в группе 5; 0,76±0,02 и 1,15±0,05% в группе 6; р1-4;1-5;1-6<0,01). Однофакторный дисперсионный анализ указал на достоверное (р<0,01) влияние на эти показатели Pb, но не НЧ SiO2. Достоверных дозозависимых изменений в относительной массе остальных внутренних органов животных всех групп не отмечено.

Показатели порфиринового обмена

Экскреция 5-АЛК с мочой у животных 4-6-й групп, получавших ацетат Pb, многократно и достоверно (р1-4;1-5;1-6<0,001) увеличивалась по сравнению с животными 1-й группы (рис. 1а). При этом какаялибо зависимость этого показателя от дозы НЧ SiO2 в группах 4-6 отсутствовала (р4-5;4-6>0,05).

Однофакторный дисперсионный анализ указал на отсутствие влияния на экскрецию 5-АЛК перорально вводимых НЧ SiO2. Введение только НЧ SiO2 приводило к достоверному (р1-3<0,05) увеличению на 15% содержания Hb в крови у животных 3-й группы (рис. 1б). У крыс 4-й группы, получавших Pb, отмечалось достоверное (р1-4<0,05) снижение этого показателя по сравнению с 1-й контрольной группой; при этом дополнительное введение крысам, получавшим Pb, диоксида кремния в обеих дозах (5-я и 6-я группы) возвращало уровень гемоглобина практически к значениям у животных 1-й контрольной группы (р1-5;1-6>0,05).

Биохимические показатели крови

Концентрации белка, креатинина, мочевой кислоты и активность аланинаминотрансферазы (АЛТ) и щелочной фосфатазы (ЩФ) в сыворотке крови у крыс опытных групп достоверно не отличались от таковых у животных контрольной группы (табл. 2).

Активность аспартатаминотрансферазы (АСТ) в сыворотке крови была достоверно выше у животных 4-й и 5-й групп по сравнению с контрольной группой, что свидетельствует о проявлении токсического действия Pb. Однако у животных 6-й группы, получавших Pb и максимальную дозу НЧ SiO2, этот показатель не отличался от такового у животных контрольной группы. Концент- рация альбумина в сыворотке крови у животных 5-й группы не отличалась от таковой у животных 1-й группы, но была достоверно выше, чем у животных 4-й группы. Концентрация глюкозы в крови у животных 6-й группы также была достоверно выше, чем у животных 4-й группы, получавших только Pb.

Гематологические показатели, апоптоз клеток печени

Исследование гематологических показателей выявило ряд неблагоприятных изменений у животных 4-й группы, получавших Pb, по сравнению с контрольной группой животных. Так, у них обнаружено снижение показателя гематокрита до 37,680,51% (40,820,80% у крыс контрольной группы), среднего объема эритроцита до 53,001,00 мм3 (56,780,86 мм3 у крыс контрольной группы), среднего содержания гемоглобина в эритроците до 17,990,37 пг (19,840,31 пг у крыс контрольной группы), средней концентрации гемоглобина в эритроците до 338,631,77 г/дл (349,331,57 г/дл у крыс контрольной группы) (р1-4<0,05 во всех случаях), что свидетельствовало о проявлении токсического действия Pb. Введение только НЧ SiO2 (крысы 2-й и 3-й групп) не оказывало никакого влияния на эти показатели по сравнению с животными контрольной группы. Также не выявлены изменения в отношении изученных показателей у животных, получавших Pb и НЧ SiO2 (крысы 5-й и 6-й групп), по сравнению с животными 4-й группы (р4-5;4-6>0,05 по всем перечисленным параметрам), за исключением показателя гематокрита у крыс 6-й группы, у которых показатель гематокрита (41,100,55%) не отличался от такового у животных контрольной группы. Во всяком случае какого-либо усиления неблагоприятного влияния Pb на гематологические показатели при его сочетанном действии с НЧ не выявлено. Определение лейкоцитарной формулы крови (количество лейкоцитов, содержание нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов) не выявило каких-либо эффектов как со стороны Pb, так и совместного введения Pb и НЧ SiO2 при данных дозах и длительности воздействия.

В то же время введение животным Pb приводило к достоверному увеличению (на 16-22%) количества тромбоцитов (p1-4;1-5;1-6<0,05), при этом влияние НЧ SiO2 на этот показатель отсутствовало.

Таким образом, в ходе гематологических исследований не обнаружено ни одного признака того, что наноструктурный SiO2 каким-то образом усиливал действие Pb. Исследование апоптоза клеток печени показало отсутствие влияния на количество живых гепатоцитов, клеток на ранней и поздней стадии апоптоза и некротических клеток введения как Pb, так и НЧ SiO2 в использованных дозах и при данных сроках воздействия.

Распределение элементов по органам

При введении Pb наблюдается его существенное накопление в печени, почках и головном мозге (табл. 3). Одновременное введение Pb и НЧ SiO2 не приводит к дальнейшему его накоплению во всех изученных органах (р4-5;4-6>0,05). Таким образом, введение исследуемого НМ не оказывает влияния на бионакопление Pb в условиях данного эксперимента.

Профили распределения других изученных микроэлементов в печени крыс представлены на рис. 2. Как следует из полученных данных, содержание Cd, As, Se, Zn, Cu, Al, Cr, Mn, Co в целом аналогично у животных, получавших и не получавших Pb, и не показывает зависимости от дозы введенного наноразмерного SiO2.

Во всяком случае введение НЧ SiO2 не приводит к усилению накопления таких токсичных элементов, как Cd и As, и к снижению тканевых запасов эссенциальных микроэлементов Se, Cu, Cr и Co как при наличии, так и в отсутствие свинцовой интоксикации. Что же касается уровней Zn и Mn, то их содержание в ткани печени оказывается даже достоверно выше (хотя и незначительно по абсолютной величине) у животных 3-й группы, получавших наибольшую дозу НЧ SiO2 по сравнению с контрольной группой (р1-3<0,05). Единственным предположительно неблагоприятным воздействием на микроэлементный профиль является почти двукратное достоверное увеличение содержания в ткани печени Al у животных, получавших Pb и НЧ SiO2 в наибольшей дозе (4-я группа - 0,468±0,065 мг/кг; 6-я группа - 0,859±0,085 мг/кг; р4-6<0,05).

В отсутствие экспозиции Pb подобный эффект не наблюдался.

При изучении распределения эссенциальных и токсичных элементов в ткани почек и головного мозга крыс 1-6-й групп была выявлена в целом аналогичная картина (данные не показаны), состоящая в отсутствии дозозависимых изменений в уровнях микроэлементов при разных дозах использования НЧ SiO2 как в условиях сочетанного действия Pb, так и без него. При этом НЧ SiO2 не оказывали достоверного влияния (р>0,05) на накопление Al в ткани головного мозга.

Обсуждение

В литературе обсуждаются возможные риски потенцирования токсического действия химических контаминантов окружающей среды, связанные со способностью искусственных минеральных НЧ выступать в роли своеобразных "транспортеров" этих контаминантов во внутреннюю среду организма. Так, в работах [16, 18] показано усиление бионакопления и токсичности ионов Cd и арсенита для рыб при воздействии НЧ диоксида титана (TiO2). В исследовании [11] НЧ TiO2 усиливали поглощение мононуклеарными фагоцитами человека бактериального липополисахарида, присоединенного к поверхности частиц через кальциевые мостики, результатом чего было развитие мощного провоспалительного ответа. Авторы работ связывают выявленные эффекты со способностью НЧ ввиду их малого размера проникать через биологические мембраны в клетки, выступая тем самым в роли "транспортеров" адсорбированных на них токсикантов химической и биологической природы. Однако для высших животных и человека, при естественных путях поступления НЧ в организм (в первую очередь через желудочно-кишечный тракт) данная возможность пока постулируется только теоретически [3, 4, 12].

В предыдущей работе [10] нами было изучено влияние стандартизованных препаратов НЧ TiO2 и НЧ SiO2 на накопление и токсичность Pb при его внутрижелудочном введении крысам. При этом не получено доказательств увеличения всасывания Pb в желудочно-кишечном тракте за счет его абсорбции на НЧ, а наблюдаемые эффекты были, скорее всего, связаны как с токсичностью самого Pb, так и с токсичностью (в изученных дозах) НЧ TiO2, но не НЧ SiO2. Использованный в работе [10] образец НЧ SiO2 имел меньшую удельную площадь поверхности (220 м2/г) и, следовательно, меньшую степень дисперсности, чем примененный в данном исследовании наноструктурный SiO2 с удельной площадью поверхности 300 м2/г. Полученные данные показывают, что и в данном случае не получено однозначных свидетельств потенцирования неблагоприятных эффектов Pb в случае его совместного поступления с НЧ SiO2. Более того, для ряда показателей, таких, как активность АСТ сыворотки крови, содержание гемоглобина, некоторые гематологические показатели эритроцитов, введение НЧ SiO2 в определенной степени отменяло неблагоприятные эффекты Pb. Увеличение уровня глюкозы под воздействием НЧ в условиях свинцовой интоксикации было небольшим по абсолютной величине и, по-видимому, не являлось биологически значимым. Однако обнаруженный эффект требует подтверждения в дальнейших исследованиях. Увеличение накопления Al в печени крыс при сочетанном действии НЧ SiO2 и Pb в настоящее время не вполне понятно и требует дополнительного исследования. При этом важно подчеркнуть, что в мозге животных, т.е. в органе, по современным представлениям являющемся основной мишенью токсического действия Al [15], этот эффект не наблюдался.

Прямые свидетельства транспорта НЧ SiO2 через стенку кишки млекопитающих в доступной литературе отсутствуют, однако можно предположить, что по аналогии со сходным по физикохимическим свойствам и размеру частиц наноструктурным TiO2 [1, 5] всасываемость НЧ SiO2 является, по-видимому, весьма низкой. С учетом высокой сорбционной способности данного НМ это может привести к эффекту энтеросорбции и, следовательно, к замедлению скорости всасывания Pb в кишечнике и соответствующему уменьшению его токсического действия. Аналогичный c точки зрения физикохимии процесса эффект наблюдали авторы работы [17], в которой показано снижение накопления ионов Cd в клетках зеленых водорослей вследствие его адсорбции на НЧ TiO2. Однако непосредственный перенос этих данных на организм высших животных и человека невозможен, и исследование влияния НЧ различных типов на кишечную абсорбцию и токсичность других химических контаминантов должно быть продолжено.

Литература

1. Гмошинский И.В., Хотимченко С.А., Попов В.О. и др. Наноматериалы и нанотехнологии: методы анализа и контроля // Успехи химии. - 2013. - Т. 82, № 1. - С. 48-76.

2. Зайцева Н.В., Землянова М.А., Звездин В.Н. и др. Токсикологическая оценка наноструктурного диоксида кремния. Параметры острой токсичности // Вопр. питания. - 2014. - Т. 83, № 2. - С. 42-49.

3. Онищенко Г.Г., Арчаков А.И., Бессонов В.В. и др. Методические подходы к оценке безопасности наноматериалов // Гиг. и сан. - 2007. - № 6. - С. 3-10.

4. Онищенко Г.Г., Тутельян В.А. О концепции токсикологических исследований, методологии оценки риска, методов идентификации и количественного определения наноматериалов // Вопр. питания. - 2007. - Т. 76, № 6. - С. 4-8.

5. Онищенко Г.Е., Ерохина М.В., Абрамчук С.С. и др. Влияние наночастиц диоксида титана на состояние слизистой оболочки тонкой кишки крыс // Бюл. экспер. биол. - 2012. - Т. 154, № 8. - С. 231-237.

6. Патент Российской Федерации № 2286607 "Способ моделирования хронической токсической нефропатии".

7. Распопов Р.В., Арианова Е.А., Трушина Э.Н. и др. Характеристика биодоступности наночастиц нульвалентного селена у крыс // Вопр. питания. - 2011. - Т. 80, № 4. - С. 36-41.

8. Распопов Р.В., Трушина Э.Н., Гмошинский И.В., Хотимченко С.А. Биодоступность наночастиц оксида железа при использовании их в питании. Результаты экспериментов на крысах // Вопр. питания. - 2011. - Т. 80, № 3. - С. 25-30.

9. Трушина Э.Н., Мустафина О.К., Бекетова Н.А. и др. Влияние пищевых волокон на апоптоз гепатоцитов крыс с алиментарной поливитаминной недостаточностью // Вопр. питания. - 2014. - Т. 83, № 1. - С. 33-40.

10. Шумакова А.А., Трушина Э.Н., Мустафина О.К. и др. Влияние наночастиц диоксида титана и диоксида кремния на накопление и токсичность свинца в эксперименте при их внутрижелудочном введении // Вопр. питания. - 2014. - Т. 83, № 2. - С. 57-63.