Condition of protective intestinal microbiota populations under stress exposure in rats received different diets with bioactive food components

AbstractThe evaluation of the levels of major colon microbiota populations (lactobacilli, bifidobacteria, enterobacteria) was carried out in two 15-days experiments on Wistar rats, exposed to stress factor (electric shock) and fed with different diets with the addition of biologic active micronutrients [extract from the leaves of Serratula coronata L. and Enzymatic hydrolyzate of the mussels meat (EHMM)]. In the first experiment animals were fed with a common vivarium diet. In the experimental group the water extract from leaves of Serratula coronata L. as a phytoecdysteroid source (5 mg per 1 kg body weight) was added to water. In the second experiment rats received balanced semisynthetic diet. In the diet of the experimental group the part of the protein (casein) was replaced by the peptides from EHMM. During the experiment the animal body weight was measured. On the 14 th day of the experiment the animals were subjected to stress stimulation [electrodermal stimulation on paws (electric current 0,4 mA for 8 seconds)]. On the last day of the experiment the animals were euthanized by decapitation and micro-ecological research of protective microbiota populations in the cecal contents was carried out. The relative body weight increase was recorded in both experiments. In the second experiment in animals receiving EHMM this index (68,2±3,0%) was considerably higher than in the control group and in the experimental group receiving no EHMM (57,2±4,0 and 59,7±2,8% respectively). The results of the microecological study showed different effect of diets with biologically active micronutrients on the population levels of lactobacilli. In the experiment with common vivarium diet no significant changes of the levels of the studied colon microbiota populations had been recorded in the rats of control group compared with rats of experimental group, exposed to stress factor but received no extract from Serratula coronata L. The decrease of the levels of lactobacilli by the end of the experiment was observed in the experimental group of rats received water extract from the leaves of Serratula coronata L (content of lactobacilli 7,76±0,17 lg CFU/g) compared to those in control group and experimental group of rats received no extract (8,4±0,09 and 8,69±0,07 lg CFU/g respectively). Feeding with the balanced semisynthetic diet with the addition of EHMM or without it had a positive effect on the levels of lactobacilli and their balance with the aerobic component of the Enterobacteriaceae. There was a trend toward increased levels of lactic acid bacteria in the experimental group received EHMM (9,16±0,12 lg CFU/g) compared with the contents in the control group and in the experimental group exposed to stress factor without adding EHMM in the diet (8,74±0,34 and 8,79±0,23 lg CFU/g, respectively). The conclusion about the positive (protective) effect of a semisynthetic diet enriched with peptides from EHMM was made based on the comparison of indicators that reflect the status of non-specific resistance of the organism: the integral criterion of weight gain and the levels of major colon microbiota populations of laboratory animals.

Keywords:colon microbiota, bifidobacteria, lactobacilli, enterobacteria, Wistar rats, electrodermal stress stimulation, fito ecdysteroids, peptides from Enzymatic hydrolyzate of the mussels meat (EHMM)

Вопр. питания. - 2015. - № 1. - С. 58-65.

Микробиота кишечника является наиболее значимым фактором неспецифической резистентности организма, при этом самое мощное влияние на нее оказывает пища. Однако характеристики этого влияния как в норме, так и при воздействии факторов дезадаптации изучены недостаточно. В 1980-90-х гг. состав и свойства кишечной микробиоты активно исследовали у лиц, подвергавшихся нервно-психическим и физическим перегрузкам, длительной гипокинезии, изоляции в гермокамере (космонавты, подводники) [5, 6, 10]. Позже в экспериментах с использованием крыс получены данные о составе и свойствах основных популяций нормофлоры при таких видах стресса, как иммобилизация, переохлаждение, нагрузка этанолом [8, 12, 13]. Однако в этих исследованиях не оценивали влияние фактора питания.

В настоящее время активно создаются специализированные и функциональные пищевые продукты, обогащенные биологически активными веществами (БАВ) адаптогенного характера. Многие из них позиционируются в качестве средств, способных повышать устойчивость организма человека к вредным физическим и токсическим факторам среды, а также проявлять иммуномодулирующую и противомикробную активность.

К последним главным образом относятся экстракты фитонцидных растений и иммуноактивные пептиды животных белков [19]. При этом влияние большинства таких соединений на кишечную микробиоту неизвестно.

Целью работы было изучение содержания и некоторых функциональных характеристик ведущих защитных популяций микробиоты (бифидобактерий, лактобактерий, энтеробактерий) толстой кишки в эксперименте у крыс, подвергавшихся воздействию стрессового фактора на фоне кормления различными рационами с добавлением биологически активных компонентов адаптогенной природы. В качестве адаптогенных добавок использовали экстракт из листьев растения серпухи венценосной (Serratula coronata L.) и ферментативный гидролизат мяса мидий [16], перспективные для производства биологически активных добавок к пище (БАД) и функциональных продуктов.

В серпухе венценосной содержится комплекс БАВ, обладающих адаптогенным, тонизирующим, анаболическим действием и противовоспалительной активностью [3], влияние которых на представителей нормальной микрофлоры не изучено. Также не охарактеризован в этом отношении ферментативный гидролизат мидий (в отличие от кислотного мидийного гидролизата, у которого доказано наличие противовирусной, противобактериальной и иммуномодулирующей активности [4]), что требует внимания и отдельной проработки.

Материал и методы

При проведении исследования использовали половозрелых крыс-самцов линии Вистар, полученных из питомника "Столбовая". Животных разделили случайным образом на 3 группы по 8 особей в каждой.

Стрессорное воздействие на животных моделировали с использованием установки ("PanLab", Испания), представляющей собой большое освещенное белое и маленькое черное отделения, разделенные опускными моторизированными воротами. Решетчатый пол малого черного отделения электрифицирован (выход 0-2 мА). Крысу помещали в светлый отсек камеры спиной к темному отсеку. Как только крыса переходила в темный отсек камеры, она получала электрокожное раздражение лап (сила тока 0,4 мА, в течение 8 с).

Концентрации фитоэкдистероидов в экстракте из листьев серпухи венценосной определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на приборе "Agilent 1100 Series" ("AgilentTechnology", США) [22]. Пробу вводили в колонку AtlantisC18 4,6×250 мм, 5 мкм, скорость элюирования 0,9 мл/мин, использовали градиентный режим элюирования с применением 2-компонентной подвижной фазы: компонент А - деионизированная вода; компонент В - ацетонитрил марки "для ВЭЖХ". С 0 мин - 20% В, 15 мин - 50% В, 15,5 мин - 20% В, 21 мин - 20%; длина волны детектирования - 247 нм, объем вводимой пробы - 10 мкл. Суммарное содержание фитоэкдистероидов составило 61,5 мг/г, при этом концентрации 20-гидроксиэкдизона и 25S-инокостерона были равны соответственно 40,6 и 14,2 мг/г.

Ферментативный гидролизат мяса мидий (ФММ) был получен в полупромышленных условиях с применением ферментного препарата "Протозим" ("ЕНЗИМ", Украина), микрофильтрации и распылительной сушки [1]. Молекулярно-массовое распределение пептидных фракций в составе ФММ было определено ранее [16]. Суммарное содержание пептидов (средне- и короткоцепочечных) с молекулярной массой менее 3,5 кДа и аминокислот в ФММ составляло более 45%.

В соответствии с задачами исследования проводили 2 эксперимента.

Эксперимент I (с добавлением экстракта серпухи венценосной) Животные были помещены в отдельные клетки по одной особи в каждой и в течение эксперимента получали стандартный общевиварный рацион [14]. Животным 3-й опытной группы ежедневно в воду добавляли сухой водный экстракт из листьев серпухи венценосной. Крысы этой группы получали ежесуточно водный раствор экстракта из расчета 81 мг сухого экстракта (5 мг фитоэкдистероидов) на 1 кг массы тела. Животные 1-й (контрольной) группы и 2-й опытной группы получали в течение всего эксперимента воду.

Крыс ежедневно осматривали и фиксировали объем выпитой жидкости, и регулярно через сутки взвешивали.

Исходная масса тела животных 1-й контрольной группы была 193,6±5,6 г, а для животных 2-й и 3-й опытных групп она составила соответственно 165,5±4,1 и 169,0±3,4 г.

Продолжительность эксперимента составляла 15 сут (при этом экстракт серпухи животные получали в течение последних 12 сут). В предпоследний день эксперимента животных 2-й и 3-й опытных групп подвергали стрессорному воздействию.

На 15-е сутки эксперимента животных выводили из эксперимента путем декапитации под легким эфирным наркозом и подвергали патологоанатомическому вскрытию. В процессе вскрытия у животных лигировали слепую кишку и отбирали ее для микробиологических исследований.

Эксперимент II (с добавлением ферментативного гидролизата мяса мидий) Исходная масса тела животных 1-й контрольной группы и 2-й и 3-й опытных групп достоверно не различалась и составила соответственно 179,4±5,9; 176,3±4,5 и 177,6±4,0 г.

Животные 1-й контрольной группы и 2-й опытной группы получали изокалорийный (381 ккал/100 г сухого корма) и изоазотистый (20,2% белка казеина по калорийности) полусинтетический рацион [18]. Животные 3-й опытной группы получали тот же рацион, в котором 50% белка (казеина) было заменено пептидами ФММ [17]. Крыс ежедневно осматривали и периодически взвешивали.

В предпоследний день эксперимента животных 2-й и 3-й опытных групп подвергали стрессорному воздействию. На 15-е сутки эксперимента животных выводили из эксперимента с отбором биоматериала, как указано выше.

Для выявления и подсчета лактобацилл, бифидобактерий, энтеробактерий асептически извлекали содержимое толстой (слепой) кишки (caecum), количественно разводили регенерированным фосфатно-тиогликолевым буфером, засевали на дифференциально-диагностические питательные среды и инкубировали в термостате при температуре (37±1 °С). Для выделения и подсчета количества лактобактерий использовали плотную среду MRS (HiMedia), для бифидобактерий - полужидкий модифицированный бульон для бифидобактерий (HiMedia). Для создания микроаэрофильных условий посевы помещали в изолирующий полимерный пакет, в который закладывали газогенерирующие пакеты для химического связывания кислорода "Anaerocult" ("Merck", Германия), и инкубировали в течение 3 сут. Энтеробактерии выделяли на среде Эндо и цитратном агаре Симмонса. Посевы инкубировали в течение 24 ч, после чего проводили учет всех типов колоний, типичных и презумптивных, на принадлежность к изучаемым видам микроорганизмов. Все типы выросших колоний микроскопировали. Изоляты со среды MRS, состоящие из бесспоровых грамположительных палочек, проверяли на отсутствие каталазы и по этим первичным признакам относили к роду Lactobacillus. К нормальным энтеробактериям относили выросшие на среде Эндо лактозоположительные колонии с металлическим блеском или без него; к условно-патогенным цитратассимилирующим энтеробактериям - колонии, вырастающие на среде Симмонса и изменяющие ее цвет.

К бифидобактериям относили изоляты из бульона для бифидобактерий, состоящие из характерных бесспоровых грамположительных палочек.

Количество микроорганизмов выражали в десятичном логарифме (lg) колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1 г сырой массы содержимого кишки.

Определение антагонистической (кислотообразующей) активности популяции бифидобактерий проводили путем определения рН культуральной жидкости первой генерации в модифицированном бульоне для бифидобактерий на 5-е сутки инкубации. Контролем служила стерильная неинокулированная питательная среда. Критериями антагонистической активности бифидобактерий служили пределы величины рН: менее 4,5 - антагонистически активные бифидобактерии; 4,6-5,1 - слабый антагонизм, более 5,1 - отсутствие антагонистической активности [7].

Полученные данные обрабатывали с помощью статистического пакета Статистика (версия 20).

Для выявления статистической значимости различий непрерывных величин использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни для независимых переменных. Различия между анализируемыми показателями считали достоверными при уровне значимости р≤0,05.

Авторы выражают благодарность старшему научному сотруднику ФГБНУ "НИИ питания" С.Н. Зорину за участие в эксперименте и заведующей лабораторией биобезопасности и анализа нутримикробиома ФГБНУ "НИИ питания" С.А. Шевелевой за обсуждение полученных результатов.

Результаты и обсуждение

Эксперимент I

На 15-е сутки эксперимента относительное увеличение массы тела животных для 1, 2 и 3-й групп достоверно не различалось и составило соответственно 23,0±2,0, 24,8±2,4 и 23,9±2,8%.

Результаты микроэкологического исследования показаны в табл. 1. Как видно из табл. 1, медианные уровни содержания основных популяций микробиоты у крыс, содержавшихся на стандартном общевиварном рационе и подвергнутых стрессу, значимо не изменялись по сравнению с контролем.



В группе стрессированных крыс, к рациону которых был добавлен экстракт серпухи венценосной, к концу эксперимента наблюдалось сниженное содержание лактобактерий по сравнению с таковым у крыс контрольной группы (p=0,026) и группы стрессированных животных, не получавших данный экстракт (p=0,002).

В то же время в целом указанные показатели находились в пределах значений, характерных для этих популяций у животных данного вида и возраста [11].

Кислотообразующая способность бифидобактерий не менялась, что говорит о сохранности их функциональной активности за срок эксперимента.

В наблюдениях на крысах, подвергавшихся стрессорным воздействиям иного характера [8, 12, 13], также было отмечено уменьшение в содержимом толстой кишки количества молочнокислых микроорганизмов - ведущей защитной популяции микробиоты данного вида животных.

Таким образом, включение в рацион сухого экстракта из листьев серпухи венценосной не предотвращало неблагоприятных изменений содержания защитных популяций микробиоты у крыс, подвергавшихся стрессу.

Однозначно охарактеризовать причину данного явления сложно. Сведений о наличии в серпухе венценосной веществ фитонцидного характера в литературе нет. В то же время ряд публикаций свидетельствует о наличии in vitro у экстрактов серпухи венценосной протекторного эффекта для непатогенных бактерий к факторам физического стресса и об избирательном характере воздействия. Так, на Escherichia coli показано [2, 15], что экстракт серпухи венценосной и экдистероидсодержащая субстанция (смесь 20-гидроксиэкдизона и инокостерона в соотношении 8:1) вызывали экспрессию генов культуры, кодирующих каталазу-гидропероксидазу I и Mn-супероксиддисмутазу.

Также установлено, что экстракт серпухи оказывал защитный эффект на Escherichia coli от бактериостатических доз перекиси водорода, а смесь чистых экдистероидов не влияла на ее устойчивость к пероксидному стрессу. Авторы выдвигают гипотезу о том, что защитное действие экстракта обусловлено содержанием в нем полифенолов, обладающих антиоксидантной активностью. Другими авторами показано, что нативные экдистероиды серпухи венценосной не проявляют ингибирующих свойств по отношению к большинству тест-культур, а один из них - инокостерон - даже слабо стимулирует рост E. coli и B. subtilis. Значительное повышение антибиотической активности, правда, в отношении бактерий, являющихся возбудителями гнойно-воспалительных заболеваний, авторы наблюдали при модификации молекулы 20-гидроксиэкдизона (введении ацетильных групп) [20].

Кроме того, известно, что индуцированные стрессом изменения внутренней среды в пищеварительном тракте (за счет снижения секреции желудочного сока и его кислотности, увеличения концентрации бикарбоната в двенадцатиперстной кишке и нарушения кишечной моторики) ведут к формированию неблагоприятных параметров для выживания, адгезии и размножения лактобацилл в кишечнике [9, 21]. Возможно, изменение химуса при стрессе способно влиять и на модификацию экдистероидов экстракта серпухи и на изменение их антимикробных свойств.

По существу, изучение механизмов влияния растительных экстрактов на представителей микробиоты сегодня является весьмаактуальным.

Таким образом, включение в рацион экстракта серпухи венценосной не показало протекторного эффекта на микрофлору при кратковременном стрессе. Поскольку углубление дефицита защитных популяций при более длительном его воздействии может способствовать снижению неспецифического иммунитета макроорганизма, это подтверждает целесообразность предварительного доклинического микроэкологического тестирования растительных БАВ пищи адаптогенной природы in vivo.

Эксперимент II

Потребление ФММ в составе рациона оказало выраженное положительное влияние на прирост массы тела крыс. На 15-е сутки относительное увеличение массы тела животных 1, 2 и 3-й групп составило соответственно 57,2±4,0;

59,7±2,8; 68,2±3,0% и, как видно, в группе крыс, получавших ФММ, было достоверно выше данного показателя у животных 1-й и 2-й групп (р<0,05 согласно критерию Стьюдента и непараметрическому ранговому критерию Манна-Уитни) [17].

Одним из возможных объяснений наблюдаемого феномена может быть наличие у пептидов ФММ анаболических свойств.

Результаты микробиологических исследований II эксперимента показаны в табл. 2, из которой следует, что на полусинтетическом рационе (по сравнению от общевиварным в эксперименте I) отмечено достоверное увеличение уровня лактобактерий (p=0,008) и повышение функциональной кислотообразующей активности бифидобактерий (p=0,003).







У животных, получавших полусинтетический рацион без ФММ, стрессорное воздействие приводило к снижению количества бифидобактерий по сравнению с группой контроля (р=0,025). Добавление мидийного гидролизата в рацион животных, подвергнутых действию стрессового фактора, сказывалось однозначно положительно, так как у крыс не происходило значимого снижения содержания бифидобактерий по сравнению с группой контроля, наблюдалась тенденция (p=0,09) к увеличению численности лактобактерий в кишечнике по сравнению с группой стрессированных животных, а также к формированию их оптимального баланса с уровнем энтеробактерий (снижение количества энтеробактерий с нормальной ферментативной активностью по сравнению с контрольной группой было статистически значимо, р=0,003).

Это подтверждается достоверностью различий в величинах кислотообразующей активности бифидобактерий (рН среды I генерации) в кишечнике у крыс, получавших различные рационы - общевиварный (с добавлением экстракта серпухи венценосной) и полусинтетический (с добавлением ФММ) - в стрессорных условиях (4,47±0,07 против 4,69±0,03, р≤0,05, и 9,16±0,12 против 7,76±0,17 lg КОЕ/г, р≤0,05 соответственно).

Таким образом, в стрессорных условиях включение мидийного гидролизата в полусинтетический сбалансированный рацион крыс сопровождается улучшением баланса ведущих защитных популяций кишечной микробиоты и повышением функциональной кислотообразующей активности бифидобактерий в кишечнике по сравнению с группой, получавшей полноценный общевиварный рацион с включением минорных растительных адаптогенных веществ.

Заключение

Исследования состояния защитных популяций микробиоты кишечника у крыс, подвергавшихся краткосрочному воздействию стрессового фактора в эксперименте на фоне кормления различными рационами с добавлением биологически активных компонентов адаптогенной природы, показали наличие значимой зависимости уровней данных популяций и некоторых их функциональных характеристик от качества изученных компонентов. Так, в стрессорных условиях включение ферментативного гидролизата мидий в полусинтетический рацион крыс сопровождается улучшением баланса лактобактерий, бифидобактерий, нормальных энтеробактерий и повышением кислотообразующей активности бифидобактерий в кишечнике по сравнению с группой, получающей полноценный общевиварный рацион с добавлением минорных растительных адаптогенных веществ. Наряду с этим существенно более высокий прирост массы тела, зафиксированный у стрессированных крыс на полусинтетическом рационе, содержащем пептиды ФММ, чем у крыс на данном рационе без ФММ и не подвергавшихся стрессу, позволяет дать заключение о положительном влиянии рациона, обогащенного пептидами ФММ, на неспецифическую резистентность организма.

Выявленные зависимости подтверждают целесообразность предварительного доклинического тестирования БАВ пищи адаптогенной природы в биологическом эксперименте in vivo, в том числе с изучением состояния кишечной микробиоты.

Литература

1. Арнаутов М.В., Абрамова Л.С., Абрамов Д.В. и др. Отработка технологии ферментативного гидролиза мяса мидий в полупромышленных масштабах // Рыбное хозяйство. - 2013. - № 1. - С. 112-116.

2. Безматерных К.В., Володина С.О., Володин В.В. и др. Влияние экстрактов серпухи венценосной и пажитника сенного на устойчивость бактерий Escherichia coli к пероксидному стрессу // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. - 2013. - Т. 15, № 3(5). - С. 1567-1570.

3. Воробьева А.Н., Зарембо Е.В., Рыбин В.Г. Дальневосточные виды родов Stemmacantha cass. и Serratula L. - перспективные источники фитоэкдистероидов (обзор литературы) // Бюл. физиологии и патологии дыхания. - 2006. - № S22. - С. 90-93.

4. Гончаренко Е.Н., Деев Л.И., Кудряшов Ю.Б. и др. Применение адаптогена МИГИ-К для реабилитации ликвидаторов-чернобыльцев // Радиационная биология. Радиоэкология. - 1999. - Т. 39, № 2-3. - С. 304-309.

5. Кафарская Л.И., Гладько И.А., Ефимов Б.А. и др. Изучение влияния кисломолочного бифидумбактерина на микрофлору кишечника у летчиков-испытателей // Журн. микробиол. - 1992. - № 4. - С. 12-14.

6. Лизько Н.Н., Фролов В.Н., Смирнов К.В. Микрофлора кишечника и пищеварительные ферменты человека в условиях длительной гипокинезии // Лечебное питание в терапии и профилактике гастроэнтерологических заболеваний у детей: Сб. науч. тр. / Под ред. А.А. Баранова, В.Г. Дорофейчука. - Горький: Горьковский мединститут им. С.М. Кирова, 1988. - С. 141-145.

7. Микробиологическая и молекулярно генетическая оценка воздействия наноматериалов на представителей микробиоценоза. Методические указания МУ 1.2.2634-10.

8. Неверова Н. Н., Кикалова Т.П., Карпунина Л.В., Сметанина М.Д. Изменение молочнокислой микрофлоры кишечника животных под действием лектина бацилл в условиях стресса // Вестн. Саратовского госагроуниверситета им. Н.И. Вавилова. - 2007. - № 5. - С. 20-22.

9. Олескин А.В. Нейрохимия, симбиотическая микрофлора и питание (биополитический подход) // Гастроэнтерология СанктПетербурга. - 2009. - №. 1. - С. 8-16.

10. Петровская В.Г., Марко О.П. Микрофлора человека в норме и патологии. - М., 1976. - С. 104-111.

11. Пинегин Б.В., Мальцев В.Н., Коршунов В.М. Дисбактериозы кишечника. - М.: Медицина, 1984. - 143 с.

12. Правдивцева М.И., Карпунина Л.В., Сметанина М.Д. Влияние экзополисахаридов лактобацилл на микрофлору толстого отдела кишечника самок крыс при различных видах стресса // Известия Саратовского университета. - 2011. - Т. 11. Сер. Химия. Биология. Экология. - Вып. 2.

13. Правдивцева М.И., Карпунина Л.В., Нурмухамбетов А.В. и др. Влияние лаксарана Z на микрофлору толстого отдела кишечника самок крыс в условиях иммобилизационного стресса // Успехи современного естествознания. - 2009. - № 8. - С. 101-101.

14. Приказ МЗ СССР № 1179 от 10.10.1983 "Об утверждении нормативов затрат кормов для лабораторных животных в учреждениях здравоохранения".

15. Самойлова З.Ю. Изучение антиоксидантного действия растительных экстрактов на бактерии Escherichia coli: Автореф. дис. - канд. биол. наук. - Пермь, 2009.

16. Сидорова Ю.С., Арнаутов М.В., Байгарин Е.К. Сравнительная оценка влияния гомогената и ферментолизата мяса мидий на рост крыс и усвояемость ими белка // Вопр. питания. - 2013. - Т. 82, № 2. - С. 17-22.

17. Сидорова Ю.С., Селяскин К.Е., Зорин С.Н. Влияние ферментолизата мяса мидий на рост и некоторые показатели общего адаптационного синдрома у крыс // Вопр. питания. - 2014. - Т. 83, № 4. - С. 13-22.

18. Тышко Н.В., Жминченко В.М., Пашорина В.А. и др. Сравнительная характеристика влияния экспериментальных рационов на рост и развитие крыс // Вопр. питания. - 2011. - Т. 80, № 5. - С. 30-38.

19. Шевелева С.А., Батищева С.Ю. Характеристика бифидогенных свойств коллагенового сырья // Вопр. питания. - 2012. - Т. 81, № 1. - С. 13-22.

20. Ширшова Т. И., Политова Н.К., Бурцева С.А. и др. Антимикробная активность нативных экдистероидов растения Serratula coronata L. и некоторых их ацильных производных // Хим.-фарм. журн. - 2006. - Т. 40, № 5. - С. 22-28.

21. Hawrelak J.A., Myers S.P. The causes of intestinal dysbiosis: a review // Alternative Medicine Review: a journal of clinical therapeutic. - 2004. - Vol. 9, N 2. - P. 180.

22. Zimmer Aline R., Bruxel Fernanda. HPLC method for the determination of ecdysterone in extractive solution from Pfaffia glomerata // J. Pharm. Biomed. Anal. - 2006. - Vol. 40. - P. 450-453.