Influence of combined vitamin deficiency on unconditioned reflexes and learning in growing rats

AbstractThe aim of this study was to investigate the effect of combined deficiency of all vitamins on the manifestation of unconditioned reflex and learning (in response to an electric current) in growing Wistar rats with initial body weight 53,4±1,2 g (45,5–62,0 g). 20 of 46 tested male rats (latent period of transition from the illuminated chamber to the dark compartment did not exceed 60 s) were included in the experiment. Rats were randomly divided into 2 groups (control and experimental) for the duration of the latent period and body mass. Within 23 days the rats of the control group received a complete semisynthetic diet. Combined vitamin deficiency in tested rats was caused by 5-fold diet decrease of the amount of vitamin mixture without vitamin E. On the 12 th day the second phase of testing was performed, during which the rat received electrocutaneous irritation on paws (current 0,4 mA, 8 seconds) after transition to the dark compartment of the chamber. Preservation of the conducted reflex was performed 24 h and 9 days after training. On the 23 rd day pre-anesthetized with ether rats were taken out from the experiment by decapitation. The content of vitamin A (retinol and retinol palmitate) and E (tocopherols) in plasma and liver and in the sunflower oil was analyzed by HPLC, the level of vitamins B 1 and B 2 in liver and casein by fluorimetric method, blood serum malondialdehyde content – by spectrophotometric method. Reducing of vitamin mixture amount of the diet lead to significant reduction in liver vitamin A, E, B 1 , and B 2 level and in blood plasma vitamin A and E concentration by the end of the experiment, but had no effect on blood plasma MDA concentration. On the 12 th day of vitamin deficiency in rats manifestation of unconditioned reflex (photophobia) has been deteriorated, as evidenced by the significant 3,2-fold increase of latent period of transition to the dark compartment compared with animals fed a complete diet (47,8±15,8 vs 14,8±3,6 sec), but their ability to learn hadn’t been effected. Based on the data that vitamin deficiency, especially of vitamin-antioxidants, causes oxidative stress, and that increase of corticosterone level in hippocampus during aging significantly inhibits the function of the brain, we can assume that increasing of corticosterone level may be one of the cause of the detected cognitive impairment, as isolated vitamin A deficiency in rats increases tissue corticosterone levels.

Keywords:vitamins, rats, vitamin deficiency, unconditioned reflex, photophobia, learning ability, MDA

Вопр. питания. - 2015. - № 1. - С. 31-37.

Эпидемиологические данные и клинические наблюдения свидетельствуют о необходимости адекватной микронутриентной обеспеченности для поддержания когнитивных функций и предотвращения старческой деменции. Дефицит витаминов группы В, участвующих в метаболизме оказывающего нейротоксичное действие гомоцистеина, приводящего к снижению метилирования ДНК, а также недостаточное потребление витаминов-антиоксидантов С и Е, флавоноидов, полиненасыщенных жирных кислот семейства ω-3, витамина D негативно отражаются на способности воспринимать внешнюю информацию [11, 12, 15, 20, 23, 24]. Сочетанный дефицит витаминов, достаточно часто встречающийся среди населения нашей страны [7], сопровождается окислительным стрессом [5], что отражается на адаптационном потенциале организма. Так, дефицит витамина D ассоциируется у пожилых людей cо снижением внимания и утратой исполнительной функции [12, 15]. Устранение дефицита витаминов путем дополнительной витаминизации восстанавливало обратимо нарушенные когнитивные функции у детей [9].

Положение о важнейшей роли витаминов в реализации животными когнитивных функций находит свое конкретное подтверждение в ряде экспериментальных исследований. Сочетанный дефицит витаминов В12 , В6 и фолиевой кислоты в течение 10 нед у мышей сопровождался гомоцистеинемией и значительно ухудшал обучаемость и память [30].

В эксперименте на крысах было показано, что дефицит витамина D у взрослых животных приводил к увеличению в 1,6 раза числа неудачных попыток прохождения водного лабиринта Морриса [28]. У мышей, нокаутированных по гену гулоно-γ-лактоноксидазы и не способных синтезировать аскорбиновую кислоту, вследствие чего содержание этого витамина в мозге и печени было снижено на 75% по сравнению с мышами дикого типа, были нарушены нейросенсорные функции, уменьшались ловкость и подвижность при сохранности когнитивных функций [16, 21].

Недостаточное потребление тиамина самками крыс в период лактации вызывало когнитивные нарушения и нейрохимические изменения в мозге потомства [18]. Витамин А посредством своего основного метаболита - ретиноевой кислоты - оказывал важное физиологическое действие на мозг и поведение не только в эмбриональном, но и в постэмбриональном периоде и взрослой жизни крыс и мышей [14, 27]. Недостаточность витамина А препятствовала обучению и сохранению памяти у молодых крыс [26]. Полное лишение витамина А взрослых крыс в течение 12 нед сопровождалось нарушением пространственного обучения и памяти в тесте прохождения лабиринта [14, 17], мышей в течение 39 нед - ухудшением памяти [19]. Введение ретиноевой кислоты в рацион витамин А-дефицитных крыс восстанавливало нарушенный нейрогенез в гиппокампе [14].

В исследованиях на мышах при использовании модели синдрома Дауна было показано, что витамин Е в дозе 50±5 мг на 1 кг массы тела (соответствует дозе 3000 МЕ на взрослого человека массой 60 кг) замедляет наступление когнитивных и морфологических аномалий головного мозга [25].

Продолжительные исследования на крысах показали, что витамин Е в дозе 500 МЕ на 1 кг корма снижает уровень окислительного стресса в мозге и предотвращает когнитивные расстройства у старых крыс [22]. Дополнительное потребление витамина Е улучшало когнитивные функции взрослых мышей [29].

Целью работы было изучить влияние поливитаминной сочетанной недостаточности у растущих крыс на проявление безусловного рефлекса, способность к обучению в ответ на воздействие электрическим током.

Материал и методы

Исследования выполнены на крысах-самцах линии Вистар с исходной массой тела 53,4±1,2 г (45,5-62,0 г). Животные получены из питомника НЦБМТ РАМН "Столбовая". Общая продолжительность эксперимента составила 23 дня. Содержание лабораторных животных осуществляли в соответствии с Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых в экспериментах и других научных целях (Совет Европы, Страсбург, 2004 г.). На протяжении всего эксперимента животные содержались индивидуально в клетках из прозрачного полимерного материала (высокотемпературного полисульфона) при приглушенном естественном освещении (средняя продолжительность светового дня составила 12,1 ч), относительной влажности воздуха 40-60%, температуре 23±2 °С. Животные получали корм ad libitum и имели постоянный доступ к воде.

Эксперимент начинали с отборочного теста с 2 камерами на проявление безусловного рефлекса фотофобии (светло-темного выбора) с использованием установки "PanLab" (Испания), которая представляет собой большое освещенное белое отделение и маленькое черное отделение, разделенное опускными моторизированными воротами. Крысу однократно помещали в светлый отсек камеры спиной к темному отсеку, в который животное стремилось зайти в силу врожденного предпочтения темных участков пространства и исследовательского поведения. Регистрировали латентный период перехода из светлого отсека камеры в темный (тест 1, см. табл. 3), а затем крыс переводили в индивидуальные клетки. По результатам предварительного тестирования в эксперимент были отобраны 20 из 46 животных, латентный период перехода которых из освещенного в темный отсек камеры не превысил 60 с. По длительности латентного периода и массе тела крысы были рандомизированно разделены на 2 группы: контрольную и опытную (полигиповитаминоз).

В течение первых 3 сут все животные получали полноценный полусинтетический рацион [2], содержащий 20% казеина по ГОСТ 53667-2009 (содержание белка 82-84%), 64% кукурузного крахмала, 9% жира (смесь подсолнечного масла и лярда 1:1), 3,5% стандартной солевой смеси, 2% микрокристаллической целлюлозы, 1% сухой витаминной смеси, 0,30% L-цистеина, 0,25% холина битартрата.

В течение последующих 20 сут крысы контрольной группы продолжали получать полноценный полусинтетический рацион, обеспечивающий поступление с рационом витаминов в адекватном количестве. Полигиповитаминоз у крыс опытной группы вызывали уменьшением в корме количества витаминной смеси в 5 раз и полным исключением из нее витамина Е [4]. Среднесуточное количество поедаемого корма в расчете на 1 крысу составило 14,5±0,4 г в контрольной группе и 13,0±0,5 г в опытной. Поступление витамина Е крысам этой группы обеспечивалось за счет естественного содержания токоферолов в подсолнечном масле и составило 2,2 МЕ на 100 г рациона, т.е. 32,8% от содержания этого витамина в рационе контрольной группы. Поступление витаминов В1 и В2 с витаминдефицитным рационом (за счет витаминной смеси и казеина) составило 24% от потребления крысами контрольнойгруппы.

На 12-е сутки кормления проводили тестирование условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ).

Регистрировали латентный период перехода из светлого отсека установки в темный (тест 2, см. табл. 3).

Как только крыса переходила в темный отсек камеры, она получала электрокожное раздражение лап (сила тока 0,4 мА, 8 с). Затем крысу сразу же помещали в жилую клетку. Животное должно было обучиться не заходить в темную камеру, где оно получило болевое раздражение, и пассивно избегать неприятной ситуации, находясь в светлом отсеке. Проверка сохранения УРПИ (воспроизведения рефлекса) заключалась в повторном помещении каждого животного в освещенный отсек на 13-е и 21-е сутки кормления (через 24 ч и через 9 сут после обучения). Тестирование завершали, когда животное входило в темный отсек или (альтернативно) если не делало этого в течение 3 мин (тесты 3 и 4, см. табл. 3).

Латентный период пребывания в светлом отсеке камеры при тестировании является показателем, характеризующим степень запоминания крысой отрицательного опыта - удара током, который она приобрела в темном отсеке камеры при обучении.

На 23-и сутки эксперимента предварительно анестезированных эфиром крыс выводили из эксперимента путем декапитации. Собранную с гепарином после декапитации животного кровь центрифугировали в течение 15 мин при 500g, отбирали плазму и хранили при -20 °С.

Содержание витаминов А (ретинол и пальмитат ретинола) и Е (токоферолы) в плазме крови и в печени, а также в подсолнечном масле определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, витаминов В1 и В2 в печени и казеине - флуориметрически, как описано ранее [3, 4, 10]. Интенсивность процессов перекисного окисления липидов оценивали по содержанию вторичных [(малоновый диальдегид (МДА)] продуктов такого окисления в плазме крови [1].

Экспериментальные данные обрабатывали с помощью статистических пакетов Статистика (версия 6.0) и SPSS Statistics для Windows (версия 20.0). Для выявления статистической значимости различий непрерывных величин использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни и непараметрический критерий Краскелла-Уоллиса для независимых переменных. Различия между анализируемыми показателями считали достоверными при уровне значимости р≤0,05.

Результаты и обсуждение

Среднесуточное потребление корма крысами, получавшими витаминдефицитный рацион, было достоверно ниже (р=0,010) и составило 89,7% от показателя животных контрольной группы.

Нахождение на витаминдефицитном рационе достоверно (р=0,004) замедлило рост крыс на 14-е сутки и через 23 дня привело к снижению (р<0,05) массы тела и скорости ее прироста соответственно на 15,2 и 19,4% по сравнению с показателями животных контрольной группы (табл. 1).

Витаминдефицитный рацион крыс практически не отразился на абсолютной массе печени, но привел к достоверному увеличению ее относительной массы. Внешние признаки развития недостаточности витаминов (выпадение шерсти, алопеция, дерматит) не проявлялись.

Снижение содержания витаминов в рационе приводило к развитию выраженного полигиповитаминоза [4], о чем свидетельствует достоверное уменьшение концентрации витаминов в печени и плазме крови (табл. 2). Развитие полигиповитаминоза не отразилось на концентрации МДА в плазме крови крыс, что согласуется с ранее полученными данными [2].

Данные тестирования рефлексов по длительности латентного периода перехода животными в темный отсек представлены в табл. 3.

Как свидетельствуют результаты второго этапа тестирования, пребывание на витаминдефицитном рационе привело к достоверному увеличению латентного периода перехода в темный отсек животных опытной группы в 3,2 раза. Очевидно, что потребление крысами в течение 12 сут корма со сниженным содержанием витаминов и развитие у них сочетанной недостаточности всех витаминов привело к ухудшению воспроизведения безусловного рефлекса (фотофобии). У животных контрольной группы, получавших полноценный рацион, безусловный рефлекс сохранялся в полном объеме. По данным литературы, изолированный дефицит каждого из витаминов D, А или В1 , а также нарушение эндогенного синтеза аскорбиновой кислоты приводит к нарушению обучаемости животных в модельных экспериментах [14, 16-18, 21, 26, 28]. Ранее нами было показано, что сочетанный дефицит витаминов у крыс, способных синтезировать аскорбиновую кислоту, сопровождается снижением содержания этого витамина в печени [6]. Таким образом, полученные результаты о негативном влиянии сочетанного дефицита сразу всех витаминов на воспроизведение безусловного рефлекса растущих крыс вполне согласуются с данными о влиянии недостаточности отдельных (особенно обладающих антиоксидантными свойствами) витаминов на когнитивные и сенсомоторные функции. При изолированном дефиците витамина А у крыс возрастает концентрация кортикостерона в тканях [8, 13].

В то же время известно, что повышение уровня кортикостерона в гиппокампе при старении существенно тормозит функции головного мозга [13].

Можно предположить, что в условиях моделируемой в данной работе сочетанной поливитаминной недостаточности также имеет место повышение уровня кортикостерона в различных органах и тканях. Вопрос о возрастании уровня этого медиатора стресса в гиппокампе как одном из механизмов выявленного нарушения нейросенсорных функций требует, однако, дополнительных исследований.

Согласно данным 3-го тестирования УРПИ, можно судить о том, что приобретенный крысами навык пассивного избегания оставался сохранным через 24 ч после обучения для животных обеих групп (ни одно животное не вошло в клетку) независимо от их обеспеченности витаминами. Полигиповитаминоз не отразился на процессе угасания УРПИ через 9 сут после обучения: длительное сохранение воспроизведения условного рефлекса на сформированном уровне наблюдалось у животных обеих групп.

Литература

1. Андреева Л.И., Кожемякин Л.А., Кишкун А.А. Модификация метода определения перекисей липидов в тесте с тиобарбитуровой кислотой // Лаб. дело. - 1988. - № 11. - С. 41-43.

2. Вржесинская О.А., Бекетова Н.А., Коденцова В.М. и др. Влияние обогащения витаминдефицитного рациона крыс полиненасыщенными жирными кислотами семейства ω-3 на биомаркеры витаминного и антиоксидантного статуса // Вопр. питания. - 2013. - Т. 82, № 1. - С. 45-52.

3. Вржесинская О.А., Коденцова В.М., Спиричев В.Б и др. Оценка рибофлавинового статуса организма с помощью различных биохимических методов // Вопр. питания. - 1994. - Т. 63, № 6. - С. 9-12.

4. Вржесинская О.А., Коденцова В.М., Бекетова Н.А. и др. Экспериментальная модель алиментарного полигиповитаминоза разной степени глубины у крыс // Вопр. питания. - 2012. - Т. 81, № 2. - С. 51-56.

5. Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Мазо В.К. Витамины и окислительный стресс // Вопр. питания. - 2013. - Т. 82, № 3. - С. 11-18.

6. Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Бекетова Н.А. и др. Биохимические показатели плазмы крови и некоторые параметры антиоксидантого статуса крыс при полигиповитаминозах разной степени // Бюл. экспер. биол. - 2012. - № 10. - С. 439-442.

7. Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Спиричев В.Б. Изменение обеспеченности витаминами взрослого населения Российской Федерации за период 1987-2009 гг. (к 40-летию лаборатории витаминов и минеральных веществ НИИ питания РАМН) // Вопр. питания. - 2010. - Т. 79, № 3. - С. 68-72.

8. Сидорова Ю.С., Бекетова Н.А., Вржесинская О.А. и др. Влияние витаминной обеспеченности на протекание общего адаптационного синдрома у растущих крыс // Вопр. питания. - 2014. - Т. 83, № 5. - С. 20-25.

9. Студеникин В.М., Спиричев В.Б., Самсонова Т.В. и др. Влияние дополнительной витаминизации на заболеваемость и когнитивные функции у детей // Вопр. дет. диетологии. - 2009. - Т. 7, № 3. - С. 32-37.

10. Якушина Л.М., Бекетова Н.А., Бендер Е.Д., Харитончик Л.А. Использование методов ВЭЖХ для определения витаминов в биологических жидкостях и пищевых продуктах // Вопр. питания. - 1993. - № 1. - С. 43-48.

11. An Evidence-Based Analysis Health Quality Ontario. Vitamin B12 and Cognitive Function // Ont. Health Technol. Assess. Ser. - 2013. - Vol. 13, N 23. - P. 1-45.

12. Annweiler C., Schott A.M., Rolland Y. et al. Dietary intake of vitamin D and cognition in older women: a large population-based study // Neurology. - 2010. - Vol. 75, N 20. - Р. 1810-1816.

13. Bonhomme D., Pallet V., Dominguez G. et al. Retinoic acid modulates intrahippocampal levels of corticosterone in middle-aged mice: consequences on hippocampal plasticity and contextual memory // Front. Aging Neurosci. - 2014. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3917121/

14. Bonnet E., Touyarot K., Alfos S. et al. Retinoic acid restores adult hippocampal neurogenesis and reverses spatial memory deficit in vitamin A deprived rats // PLoS One. - 2008. - Vol. 3, N 10. - Р. e3487.

15. Buell J.S., Scott T.M., Dawson-Hughes B. et al. Vitamin D is associated with cognitive function in elders receiving home health services // J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. - 2009. - Vol. 64A, N 8. - Р. 888-895.

16. Chen Y., Curran C.P., Nebert D.W. et al. Effect of vitamin C deficiency during postnatal development on adult behavior: functional phenotype of Gulo(−/−) knockout mice // Genes Brain Behav. - 2012. - Vol. 11, N 3. - P. 10.1111/j.1601-183X.2011.00762.x.

17. Cocco S., Diaz G., Stancampiano R. et al. Vitamin A deficiency produces spatial learning and memory impairment in rats // Neuroscience. - 2002. - Vol. 115, N 2. - Р. 75-82.

18. de Freitas-Silva D.M., Resende de S., Pereira S.R. et al. Maternal thiamine restriction during lactation induces cognitive impairments and changes in glutamate and GABA concentrations in brain of rat offspring // Behav. Brain Res. - 2010. - Vol. 211, N 1. - Р. 33-40.

19. Etchamendy N., Enderlin V., Marighetto A. et al. Vitamin A deficiency and relational memory deficit in adult mice: relationships with changes in brain retinoid signalling // Behav. Brain Res. - 2003. - Vol. 145, N 1-2. - Р. 37-49.

20. Gillette-Guyonnet S., Secher M., Vellas B. Nutrition and neurodegeneration: epidemiological evidence and challenges for future research // Br. J. Clin. Pharmacol. - 2013. - Vol. 75, N 3. - Р. 738-755.

21. Harrison F.E., Yu S.S., Van Den Bossche K.L. et al. Elevated oxidative stress and sensorimotor deficits but normal cognition in mice that cannot synthesize ascorbic acid // J. Neurochem. - 2008. - Vol. 106. - Р. 1198-1208.

22. Joseph J.A., Shukitt-Hale B., Denisova N.A. et al. Long-term dietary strawberry, spinach, or vitamin E supplementation retards the onset of age-related neuronal signal-transduction and cognitive behavioral deficits // J. Neurosci. - 1998. - Vol. 18, N 19. - Р. 8047-8055.

23. Kang J.H., Cook N., Manson J.A. et al. A trial of В vitamins and cognitive function among women at high risk of cardiovascular disease // Am. J. Clin. Nutr. - 2008. - Vol. 88, N 6. - P. 1602-1610.

24. Liu L., van Groen T., Kadish I., Tollefsbol T.O. DNA methylation impacts on learning and memory in aging // Neurobiol. Aging. - 2009. - Vol. 30, N 4. - Р. 549-560.

25. Lockrow, J. Prakasam A., Huang P. et al. Cholinergic degeneration and memory loss delayed by vitamin E in a Down syndrome mouse model // Exp. Neurol. - 2009. - Vol. 216, N 2. - Р. 278-289.

26. Mao C.T., Li T.Y., Liu Y.X., Qu P. Effects of marginal vitamin A deficiency and intervention on learning and memory in young rats // Zhonghua Er Ke Za Zhi. - 2005. - Vol. 43, N 7. - Р. 526-530.

27. Olson C.R., Mello C.V. Significance of vitamin A to brain function, behavior and learning // Mol. Nutr. Food Res. - 2010. - Vol. 54, N 4. - Р. 489-495.

28. Taghizadeh M., Talaei S.A., Salami M. Vitamin D deficiency impairs spatial learning in adult rats // Iran Biomed. J. - 2013. - Vol. 17, N 1. - Р. 42-48.

29. Takatsu H., Owada K., Abe K. et al. Effect of vitamin E on learning and memory deficit in aged rats // J. Nutr. Sci. Vitaminol. (Tokyo). - 2009. - Vol. 55, N 5. - Р. 389-393.

30. Troen A.M., Shea-Budgell M., Shukitt-Hale B. et al. Vitamin deficiency causes hyperhomocysteinemia and vascular cognitive impairment in mice // Proc. Natl Acad. Sci. USA. - 2008. - Vol. 105, N 34. - Р. 12474-12479.