The influence assessment of probiotic fermented milk products on intestinal microflora, hematological indices and cellular immunity in rats (report 1)

AbstractInfluence of probiotic fermented milk products on the intestinal flora, hematological parameters and immune status of the experiment in vivo at rats is studied. Entering in digestive tract of probiotic strains of Lactobacillus acidophilus NK-1 and Bifidobacterium bifidum 791 at the level of hundreds of millions CFU in a day (from 1,7Ч108 to 9Ч108 CFU) in composition fermented milk products renders on the whole positive, but not significant statistically influence on the indexes of colon microflora and immune status of rats, and it must be extended for the achievement of reliable effect.

Keywords:probiotic fermented milk products, colon microflora, cellular immunity

Доклинические исследования пищевых продуктов, обогащенных пробиотиками, позволяют оценить их переносимость, определить эффективную дозировку пробиотических микроорганизмов, а также установить оптимальную продолжительность приема продуктов [1, 2, 5].

Целью настоящей работы была оценка воздействия кисломолочных продуктов, содержащих пробиотические лактобациллы и бифидобактерии, на общее состояние животных, динамику их массы тела, микробиоценоз толстой кишки, гематологические показатели и иммунный статус. Оценка гематологических показателей и иммунологического статуса проводилась для подтверждения пробиотического действия изучаемых штаммов, так как известно, что одним из его аспектов является активация неспецифического иммунитета [4]ю.

Таблица 1. Состав микроорганизмов в используемых кисломолочных продуктах

Материал и методы

Экспериментальные исследования проведены на 35 белых крысах-самцах Вистар с исходной массой тела 61-75 г. Эксперимент длился 21 день; в течение этого срока животные получали полноценный стандартный виварный рацион и воду ad libitum. Крысы были распределены на 5 групп (по 7 животных в каждой). Дополнительно к рациону животные опытных групп (1-4-я) получали кисломолочные продукты, обогащенные пробиотическими штаммами лактобацилл и бифидобактерий (Lactobacillus acidophilus NK-1, Bifidobacterium bifidum 791) как в монокультуре, так и в сочетаниях. Животные 5-й группы (группа сравнения) получали кисломолочный продукт, содержащий жизнеспособные молочнокислые стрептококки (Streptococcus thermophilus) без пробиотических микроорганизмов. Состав микроорганизмов в используемых кисломолочных продуктах представлен в табл. 1. Образцы пробиотических продуктов выработаны на опытно-экспериментальном заводе ГНУ ВНИМИ РАСХН (Москва).

Объем вводимой порции составлял 1,5-2% от массы тела, что соответствовало суточному потреблению кисломолочных продуктов человеком. Животные группы сравнения получали продукт с молочнокислыми стрептококками в том же объеме.

Учитывая, что для обеспечения человека оптимальным рекомендуемым уровнем потребления живых пробиотических бактерий (в сутки не менее 5108 КОЕ для бифидобактерий и 5107 КОЕ для бактерий рода Lactobacillus)*, исследуемые продукты вводили животным индивидуально ежедневно per os. В процессе исследования вели наблюдение за состоянием животных (поедаемостью корма, поведением крыс, состоянием шерстного покрова, наличием или отсутствием диареи) и массой их тела, которую определяли с помощью электронных технических весов ежедневно и перед умерщвлением (под легким эфирным наркозом) по окончании эксперимента, после чего крыс подвергали патолого-анатомическому вскрытию. Макроскопически определяли состояние внутренних органов, отбирали кровь для иммунологических и гематологических исследований, выделяли толстую кишку (слепую кишку) и асептически отбирали ее содержимое для исследования микрофлоры.

Видовой состав и уровни основных популяций микрофлоры толстой кишки крыс определяли путем количественных посевов ее содержимого на дифференциально-диагностические и селективные среды для 9 групп микроорганизмов (бифидобактерии, лактобациллы, энтеробактерии, стафилококки, стрептококки, энтерококки видов faecium и faecalis, сульфитредуцирующие клостридии, дрожжеподобные и плесневые грибы).

Экспрессию CD45RA, CD3, CD4, CD8, CD161a на лимфоцитах периферической крови определяли с помощью метода прямого иммунофлюоресцентного окрашивания клеток цельной крови с использованием панели моноклональных антител, конъюгированных с флюоресцентными красителями: FITC, PC7, APC ("IO Test", "Beckman Coulter", США) и лизирующего/фиксирующего набора реагентов ImmunoPrep ("Beckman Coulter", США). В работе использованы следующие антитела: CD45RA (клон ОХ-33), CD3 (клон 1F4), CD4 (клон ОХ-38), CD8 (клон ОХ-38), CD161а (клон 10/78), которые экспрессируется соответственно на В-лимфоцитах, Т-лимфоцитах, Т-лимфоцитаххелперах, цитотоксических Т-лимфоцитах, NKклетках. Окрашенные клетки анализировали на проточном цитофлуориметре FC-500 ("Beckman Coulter", США). Популяцию лимфоцитов выделяли с помощью гетерогенного гейтирования (по параметрам бокового светорассеивания и экспрессии CD45-FITC). Определение субпопуляции лимфоцитов проводили у крыс всех групп, кроме 4-й.

Таблица 2. Содержание микроорганизмов в используемых в рационе животных кисломолочных продуктах, КОЕ/см3 (М)

Таблица 3. Динамика массы тела крыс при кормлении изучаемыми продуктами (г; M±m)

Гематологические показатели крови (содержание эритроцитов, концентрация гемоглобина - Hb, гематокрит, средний объем эритроцита, средняя концентрация Hb в эритроците, содержание лейкоцитов и лейкоцитарная формула) определяли на гематологическом анализаторе "Coulter AC TTM 5 diff OV" ("Beckman Coulter", США).

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью пакета программ SPSS 11,5 для Windows. Математическая обработка данных включала расчет средних значений со стандартными ошибками (М±m). Достоверность различий показателей между группами определяли в соответствии с t-критерием Стьюдента; различия считали достоверными при р<0,05.

Результаты и обсуждение

Содержание пробиотических и молочнокислых микроорганизмов определяли во всех вводимых животным кисломолочных продуктах (еженедельно при поступлении каждой новой партии). Как видно из табл. 2, в продуктах, которые получали животные 3-й и 4-й опытных групп, пробиотические микроорганизмы были представлены преимущественно лактобациллами, причем средний их уровень составлял сотни миллионов клеток в 1 см3. В то же время в продуктах со смесью бифидобактерий и лактобацилл (1-я и 2-я опытные группы) их суммарное содержание находилось в диапазоне (3,1-4,8)107 КОЕ/см3, т.е. десятков миллионов клеток. Соответственно, животные 1-й и 2-й опытных групп получали с используемыми продуктами меньшие (на порядок) количества пробиотических микроорганизмов, чем животные 3-й и 4-й опытных групп. В продуктах, которые получали животные в группе сравнения, содержалась только культура молочнокислых термофильных стрептококков (1,0108 КОЕ/г).

Наблюдения за животными в течение 21 дня введения изучаемых продуктов свидетельствуют об отсутствии отклонений в состоянии здоровья и поведении крыс. В то же время проводимый нами мониторинг за массой тела животных показал, что добавление в рацион крыс пробиотических продуктов положительно сказывается на усвоении корма: к концу эксперимента прирост массы тела всех крыс был в пределах 176,5-268,2%. Как видно из табл. 3, наибольший абсолютный прирост отмечен в 1-й опытной группе, в которой крысы получали пробиотический продукт, содержащий Lactobacillus acidophilus NK-1, Bifidobacterium bifidum 791, Streptococcus thermophilus. Однако по сравнению с животными группы сравнения, получавшими с продуктом только Streptococcus thermophilus, различия были недостоверными.

Результаты изучения основных популяций микрофлоры толстой кишки крыс представлены в табл. 4-5. Как видно из табл. 4, все вводимые продукты не оказали существенного влияния на средние уровни защитных представителей микробиоценоза толстой кишки крыс. При сравнительной оценке общего числа анаэробных микроорганизмов, количества лактофлоры и стрептококков наиболее высокие значения зафиксированы у животных, получавших продукт с Lactobacillus acidophilus NK-1 (соответственно 10,0; 9,0 и 8,6lg КОЕ/г). Уровни бифидобактерий существенно не различались и соответствовали значениям, характерным для животных данного вида [4]. Кроме того, при сопоставлении с животными группы сравнения выявлена выраженная тенденция к увеличению содержания ферментативно полноценных энтеробактерий, типичных для нормофлоры крыс.

Благоприятное воздействие вводимых продуктов наиболее ярко выражается в улучшении состава транзиторных популяций (присутствие и содержание которых непостоянно - см. табл. 5) и в первую очередь характерно для продукта, содержащего Lactobacillus acidophilus NK-1 (4-я опытная группа). Так, у животных этой группы условнопатогенные микроорганизмы (коагулазоположительные стафилококки, клостридии и дрожжеподобные грибы) не обнаружены. Частота выявления гемолитических стрептококков и цитратассимилирующих энтеробактерий была в 2 раза ниже, чем у животных группы сравнения (соответственно 42,9 и 14,3% в отличие от 85,7 и 28,6%). Уровень гемолитических стрептококков в 4-й группе был самым низким среди животных.

Таким образом, в результате микроэкологических исследований установлено положительное влияние продукта, содержащего пробиотические Lactobacillus acidophilus NK-1. Это проявлялось в более высоком количестве анаэробных и аэробных бактерий, уровне защитных популяций энтеробактерий, а также в снижении численности условнопатогенной микрофлоры. Полученные данные свидетельствуют о выраженном проявлении антагонистической активности пробиотического штамма лактобацилл в составе продукта в отношении потенциально патогенных микроорганизмов, что согласуется с данными литературы [5].

Результаты иммунологических исследований представлены в табл. 6. Как следует из этих данных, статистически достоверной разницы показателей клеточного иммунитета крыс опытных групп и группы сравнения не обнаружено. Использованные в эксперименте кисломолочные продукты, содержащие штаммы пробиотических микроорганизмов, не оказали существенного влияния на относительное количество В-лимфоцитов, Т-лимфоцитов (хелперов и цитотоксических), а также естественных киллеров (NK-клеток) в периферической крови крыс.

Таблица 4. Содержание основных популяций микрофлоры толстой кишки крыс после включения в рацион пробиотических продуктов

Исследование гематологических показателей, характеризующих состояние эритроцитов у экспериментальных животных, не выявило статистически достоверной разницы у крыс опытных групп и группы сравнения. Исследованные показатели (содержание эритроцитов, концентрация Hb, гематокрит, средний объем эритроцита, среднее содержание Hb в эритроците) находятся в пределах физиологической нормы для крыс [3, 6, 7].

Таблица 5. Содержание условно-патогенных популяций микрофлоры толстой кишки крыс после включения в их рацион пробиотических продуктов

Таблица 6. Относительное содержание субпопуляций лимфоцитов периферической крови крыс 1-3-й опытных групп и группы сравнения (M±m)

Результаты свидетельствуют о статистически достоверном повышении относительного числа нейтрофильных лейкоцитов у животных, получавших кисломолочные продукты с пробиотическими микроорганизмами, по сравнению с крысами группы сравнения, которые получали кисломолочный продукт на основе молочнокислых микроорганизмов Streptococcus thermophilus. Поскольку нейтрофильные лейкоциты выполняют фагоцитарную функцию, повышение их числа свидетельствует об активации неспецифической резистентности организма в ответ на введение крысам указанных выше продуктов, обогащенных микроорганизмами (табл. 7).

Таким образом, нами обнаружены тенденция к повышению общего числа анаэробных и аэробных бактерий, а также увеличение уровня защитных популяций энтеробактерий. Отмечено снижение численности условно-патогенной транзиторной микрофлоры с факторами патогенности как следствие потребления экспериментальными животными пробиотического кисломолочного продукта, содержащего Lactobacillus acidophilus NK-1 на уровне сотен миллионов КОЕ в суточной порции (1,7108 КОЕ/см3 в среднем) на протяжении 21-дневного эксперимента. При применении других кисломолочных продуктов влияния на состав микрофлоры не выявлено.

Установлено, что все используемые нами пробиотические продукты, содержащие в 1 см3 от 3107 до 9108 КОЕ лактобацилл и бифидобактерий, не оказывают существенного влияния на параметры клеточного иммунитета (относительное содержание В-лимфоцитов, Т-лимфоцитов, естественных киллеров - NK-клеток) и состояние эритроцитов в крови крыс.

Следует подчеркнуть, что поступление в пищеварительный тракт пробиотических штаммов Lactobacillus acidophilus NK-1 и Bifidobacterium bifidum 791 на уровне сотен миллионов КОЕ в день (от 1,7108 до 9108 КОЕ) в составе кисломолочных продуктов оказывает в целом положительное, но статистически незначимое влияние на показатели микрофлоры толстой кишки и иммунный статус крыс и для достижения достоверногго эффекта должно быть увеличено.

Таблица 7. Средние гематологические показатели, характеризующие состояние лейкоцитов крыс опытных групп и группы сравнения (M±m)

Работа выполнена в рамках Контракта № 02.522.12.2009 "Разработка технологий универсального быстропереориентируемого производства заквасок прямого внесения для биотехнологической промышленности" Федеральной целевой программы "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники на 2007-2012 годы".

Литература

1. Байгарин Е.К, Жминченко В.М., Зилова И.С. и др. // Вопр. питания. - 2009. - Т. 78 № 3. - С. 33-37.

2. Батищева С.Ю., Поздняков А.Л., Кузнецова Г.Г. и др. // Вопр. питания. - 2002. - Т. 72, № 4. - С. 44-46.

3. Сидорчук А.А., Глушков А.А. Инфекционные болезни лабораторных животных. - М.: Лань, 2009. - 128 с.

4. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Т. 1. Микрофлора человека и животных и ее функции. - М.: Медицина, 1998. - 288 с.

5. Joint FAO/WHO Working Group Report on Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food. - London, Ontario, Canada. 30.04-01. 05. 2002. - 11 р.

6. Lewi P. J., Marsboom R.P. Toxicology reference data - Wistar rat. - Amsterdam: Elsevier/North-Holland Biochemical Press, 1981. - 381 p.

7. Suckow M.A., Weisbroth S.H., Franklin C.L. The Laboratory Rat. - Burlington, USA: Elsevier Academic Press, 2006.