Bioavailability of nanoparticles of ferric oxide when used in nutrition. Experimental results in rats

AbstractBioavailability of iron (Fe) introduced in the form of nanoparticles of ferric oxide and ferric sulphate was characterized in rats receiving Fe-deficient semi synthetic diet. Shown that nanoparticles of ferric oxide as well as the traditional form of this trace element (soluble salt of Fe) can restore the status of this trace element disturbances due to its scarcity in the diet.

Keywords:iron, deficiency, nanoparticles, rats, bioavailability

Как известно, железо (Fe) является эссенциальным микроэлементом, ответственным за реализацию множества физиологических функций, например, таких как транспорт кислорода, передача электронов по дыхательной цепи, активность многочисленных ферментов и т.д. Потребность в Fe составляет для взрослых мужчин 10 мг/сут, для женщин - 18 мг/сут [4]. Недостаток в рационе Fe, вызывающий развитие железодефицитной анемии (ЖДА), широко распространен в мире, особенно в экономически развитых странах. Это позволяет отнести недостаток Fe в питании человека к числу "глобальных алиментарных дефицитов" [9]. В качестве дополнительных пищевых источников усвояемого в организме Fe в последнее время рассматриваются такие его "нетрадиционные" формы, как биомасса микроводорослей [3] и наночастицы (НЧ) неорганических веществ - солей и окислов Fe (II) и Fe (III) и элементарного Fe [2]. Целью данной работы была оценка биодоступности Fe в составе НЧ оксида Fe (III) (Fe2O3) в эксперименте на лабораторных животных.

Материал и методы

В работе использовали стандартизованные препараты НЧ Fe2O3 производства фирмы "SigmaAldrich" (США-Германия), а также Fe сернокислое семиводное (FeSO4-7Н2О, х.ч.). Препарат НЧ был предварительно охарактеризован по размеру частиц и распределению по размерам методом фотонно-корреляционной спектроскопии. Измерения данным методом для порошка оксида железа определили средний размер частиц порядка 13,4 нм.

Исследование проведено на 43 крысах-самцах Вистар с исходной массой тела 30±2 г, полученных из питомника РАМН "Столбовая". Животные были разделены на 3 опытные (по 12 животных в каждой группе) и 1 контрольную (7 крыс) группы.

Во избежание контакта животных с источниками Fe в эксперименте использовали полиэтиленовые клетки, в днище которых были проделаны отверстия диаметром 5-10 мм для удаления мочи и фекалий [8]. Животных размещали в клетках по 6-7 особей.

На протяжении всего эксперимента, который продолжался 37 сут, крысы опытных групп получали полусинтетический железодефицитный корм производства фирмы "MP Biomedicals" (США), а контрольной группы - общевиварный рацион (ОВР). Содержание железа в корме животных опытных групп составило 4,9 мг/кг, контрольной группы - 212 мг/кг корма. Рацион и воду (деионизированную) крысы получали в режиме свободного неограниченного доступа.

Дополнительно к железодефицитному рациону крысы 2-й и 3-й опытных групп получали указанные выше препараты железа, которые вводили внутрижелудочно через зонд. Крысы 2-й опытной группы получали препараты железа в виде обработанной ультразвуком (44 кГц, 10 мин) дисперсии в деионизованной воде НЧ Fe2O3 из расчета 18 мг Fe на 1 кг массы тела, крысы 3-й опытной группы - в виде раствора FeSO4-7Н2О в деионизированной воде в той же дозе (в пересчете на Fe), что и животные 2-й опытной группы. Крысам 1-й опытной группы внутрижелудочно через зонд вводили только деионизированную воду.

Развитие у животных ЖДА контролировали по содержанию гемоглобина (Hb) в крови, взятой из хвостовой вены. В ходе эксперимента определение Hb у животных каждой группы проводили через 14 и 37 дней от начала опыта.

В ходе эксперимента крыс всех групп еженедельно взвешивали на электронных весах и определяли динамику прироста массы тела с точностью ±0,5 г. По окончании опыта животных обескровливали под эфирной анестезией и подвергали патологоанатомическому вскрытию. На секции брали следующие внутренние органы: печень, почки, селезенку, сердце, семенники, тимус, легкие. Путем взвешивания на электронных весах определяли (с точностью ±0,01 г) абсолютную массу внутренних органов, затем вычисли их относительную массу. С помощью набора "КлиниТест-Fe/ЖСС" (Россия) в сыворотке крови определяли содержание сывороточного Fe (ССЖ) и ненасыщенную железосвязывающую способность сыворотки (НЖСС). Степень насыщения (СН) железом связывающих железо белков сыворотки крови вычисляли расчетным методом. Методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии на атомно-абсорбционном спектрофотометре "Solaar 969 AA Sbeam" [6] определяли содержание Fe в печени*. Гематологические показатели (количество эритроцитов, гематокрит, средний объем эритроцита, содержание и концентрацию Hb в эритроците, общее количество лейкоцитов, лейкоцитарную формулу, общее количество тромбоцитов) определяли на гематологическом анализаторе "Coulter AC TTM 5 diff OV" (фирма "Beckman Coulter", США) в соответствии с [5]. Hb в крови определяли гемоглобинцианидным методом [1]. Состояние апоптоза клеток печени (гепатоцитов) изучали на проточном цитофлуориметре "FC 500" (фирма "Beckman Coulter International S.A.", Австрия) [7]. Для этого с помощью автоматической системы для механической гомогенизации ткани "BD Medimachine" (фирма "Becton Dickenson and Company", США) получали суспензию гепатоцитов, клетки однократно отмывали забуференным фосфатами до рН 7,2-7,4 раствором 0,15 М хлорида натрия и готовили пробу с концентрацией клеток 1Ч106 см-3. Гепатоциты окрашивали конъюгированным с флюорохромом (FITC) аннексином V (AnV-FITC) и витальным красителем 7-аминоактиномицином (7-AAD) (фирма "Beckman Coulter Int.",США). Взятые на вскрытии животных кусочки печени и клеточную суспензию в процессе обработки хранили на льду. Результаты выражали как процентное соотношение живых клеток и гепатоцитов, находящихся на разных стадиях апоптоза, в расчете на 10 тыс. просчитанных объектов в каждом образце.

Статистическую обработку результатов измерений проводили с помощью пакета программ SPSS 18.0, используя односторонний критерий ANOVA, t-тест Стьюдента, непараметрические ранговые критерии Манна-Уитни и Крускала-Уоллиса, среднюю арифметическую и ее ошибку (М±m).

Результаты и обсуждение

На протяжении всего эксперимента масса тела животных во всех опытных группах была практически одинаковой. Различия в относительной массе органов у животных опытных групп были также незначительными и не зависели от типа рациона и уровня обеспеченности Fe.

Через 14 дней после начала эксперимента у животных всех опытных групп концентрация Hb в крови составляла 61,4±3,3 г/л, в контрольной группе - 130,7±8,2 г/л, (р<0,05). Однако к концу опыта (через 37 сут эксперимента) у животных, получавших препараты железа, особенно у крыс 2-й опытной группы, которым вводили НЧ Fe, дефицит железа полностью купировался. При этом был весьма характерен и внешний вид животных (см. рисунок).

Как известно, развитие ЖДА характеризуется существенным снижением содержания Hb в крови по сравнению с наблюдаемым при истощении запасов Fe в депо, в том числе в печени. Это сопровождается уменьшением содержания Fe в сыворотке крови и степени насыщения трансферрина (табл. 1). Как следует из данных, приведенных в табл. 2, концентрация Hb в крови у животных 1-й группы, находившихся на протяжении всего эксперимента (в течение 37 сут) на железодефицитном рационе, продолжала оставаться на том же уровне, что и через 14 дней после начала эксперимента. Это сопровождалось достоверным уменьшением количества эритроцитов, показателя гематокрита, среднего объема эритроцита и среднего содержания Hb в эритроците (см. табл. 2). Все это свидетельствовало о развитии выраженной ЖДА, характер которой был подтвержден снижением уровня железа в сыворотке крови, степени насыщения трансферрина и содержания Fe в печени (см. табл. 1).

Внешний вид крыс 1-й (внизу) и 2-й опытных групп к концу опыта

Таблица 1. Показатели, характеризующие обеспеченность крыс железом (M±m)

Введение на протяжении 23 дней различных форм железа (НЧ Fe и сульфат Fe) животным с ЖДА (опытные 2-я и 3-я группы) обусловливало однотипные изменения, характеризующиеся полной нормализацией гематологических и биохимических показателей обмена Fe в организме (см. табл. 1, 2). Единственным показателем, который не вписывался в общую картину, являлось содержание Fe в печени у животных 3-й группы, получавших сульфат Fe. Притом что остальные изученные гематологические и биохимические показатели, характеризующие обмен Fe у животных 2-й и 3-й групп, были практически одинаковыми, содержание Fe в печени у животных 3-й группы было существенно выше. По-видимому, всасывание сульфата Fe в желудочно-кишечном тракте было выше, чем НЧ Fe, что и стало отражением накопления элемента в печени. Вместе с тем следует отметить, что повышенное поступление Fe не всегда является адекватным. Оно показано в случае быстрого восполнения уровня Fe в организме при его дефиците и дальнейшего поступления в оптимальных количествах, поддерживающих его пул. В случае, когда поступление Fe оcтается на том же высоком уровне, это может приводить к его избыточному накоплению в органах и тканях и проявлению прооксидантного действия этого микроэлемента. Таким образом, в рассматриваемом случае различия в уровнях накопления Fe в печени можно объяснить более высокой степенью всасывания Fe2+, находящегося в составе сульфата Fe, чем входящего в состав НЧ Fe3+. С другой стороны, сравнение данных по содержанию Fe в печени у животных 2-4-й групп показало, что у животных контрольной группы его уровень сравним с таковым во 2-й опытной группе, что указывает на определенное, более "мягкое" действие НЧ Fe, не приводящее к избыточному накоплению железа.

Исследование лейкоцитарной формулы (общее содержание лейкоцитов, нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов, базофилов, процент незрелых клеток) не выявило достоверных различий между группами животных. В то же время количество эозинофилов у крыс 2-й (0,21±0,06%) и 3-й (0,24±0,04%) групп было несколько выше, чем в 1-й опытной и контрольной группах (соответственно 0,10±0,06 и 0,03±0,02%).

Таблица 2. Показатели эритропоэза у крыс разных групп (M±m)

Таблица 3. Показатели, характеризующие состояние апоптоза гепатоцитов у крыс (%; M±m)

Примененный в настоящей работе принцип метода цитофлюориметрического учета апоптоза клеток печени основан на свойстве аннексина V (AnV) связываться с фосфатидилсерином клеточной мембраны и способности 7-AAD встраиваться между цитозином и гуанином 2-цепочечной ДНК клеток с нарушенной целостностью мембраны. На ранних стадиях апоптоза целостность мембраны клеток сохраняется, но происходит конверсия мембранных фосфолипидов с появлением фосфатидилсерина на поверхности клетки. AnV с высокой аффинностью связывается с фосфатидилсерином и идентифицирует "ранний" апоптоз в AnV-FITC+ (позитивных)/7-AAD- (негативных) клетках. Поздняя фаза апоптоза сопровождается не только утратой асимметрии фосфолипидов мембраны, но и нарушением целостности мембраны, фрагментацией ДНК и резким возрастанием мембранной проницаемости для катионных красителей. Такая стадия апоптоза детектируется в AnV-FITC+ (позитивных)/7-AAD+ (позитивных) клетках. Мертвые клетки могут быть также AnV-FITC- (негативными)/7-AAD+ (позитивными). Живые клетки, не входящие в апоптоз, не связывают AnV-FITC и непроницаемы для 7-AAD, т.е. являются AnV-FITC- (негативными)/7-AAD- (негативными).

Данные о состоянии апоптоза клеток печени, представленные в табл. 3, свидетельствуют о существенном статистически достоверном повышении относительного числа гепатоцитов, подвергшихся апоптозу, и мертвых клеток у животных 1-й опытной группы по сравнению с остальными опытными группами. Показатели апоптоза гепатоцитов у крыс 2-й и 3-й опытных групп, получавших соответственно НЧ Fe и сульфат Fe, не различались между собой. Однако следует отметить, что относительное число гепатоцитов, находящихся в состоянии апоптоза, у крыс, получавших препараты Fe, несколько выше, чем у крыс контрольной группы.

Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют, что использование НЧ Fe в течение ограниченного времени (37 сут) приводит к практически полной нормализации показателей, характеризующих обмен Fe в организме, и в то же время не способствует избыточному накоплению данного микроэлемента в печени, что наблюдается при применении сульфата Fe.

Литература

1. Биохимические методы исследования в клинике: справочник / Под ред. А.А. Покровского. - М.: Медицина, 1969. - 420 с.

2. Верников В.М., Арианова Е.А., Гмошинский И.В. и др. // Вопр. питания. - 2009. - Т. 78, № 2. - С. 4-17.

3. Гмошинский И.В., Зарецкая Е.С., Мазо В.К. // Успехи современного естествознания. - 2004. - Т. 1, № 6, прил. 1. - С. 121-123.

4. МР 2.3.1.2432-08. "Нормы физиологических потребностей в энергии и пищевых веществах для различных групп населения Российской Федерации". - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2008. - 41 с.

5. МУ 1.2.2520-09. Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009. - 36 с.

6. Руководство по методам анализа качества и безопасности пищевых продуктов / Под ред. И.М. Скурихина, В.А. Тутельяна. - М.: Брандес-медицина, 1998. - 340 с.

7. Хайдуков С.В., Зурочка А.В. Вопросы современной проточной цитометрии, клиническое примечание. - Челябинск: Бумажный двор, 2008. - 112 с.

8. Хотимченко С.А., Алексеева И.А. // Вопр. питания. - 1999. - № 5-6. - С. 13-15.

9. Stephenson L.S. et al. // Parasitology. - 2000. - Vol. 121, suppl. 1. - P. S5-S22.