Biologically active substances of cornelian cherry fruits (Cornus mas L.)

Abstract

10 samples of fresh-frozen cornelian cherry fruits (Cornus mas L.), collected in the Tambov and the Caucasus regions, were investigated for the total amount and composition of the main biologically active substances (BAS): anthocyanins (AC), proanthocyanidins (OPC), dihydroxycinnamic acids (DHCA), iridoids, organic acids, mono- and disaccharides and antiradical activity in the DPPH-test in vitro. Total phenolics content determined by Folin-Ciocalteu method, was 150–400 mg/100 g fresh fruit weight. The OPC content, estimated by Bate–Smith method, varied from 20–25 mg/100 g of unripe cornelian cherries to 80–430 mg/100 g of mature cornelian cherries. Total AC amount evaluated by pH-differential spectrophotometry was minimal in unripe fruits (11,2 mg /100 g), and maximal in mature fruits (92,2 mg/100 g). Profile of individual AC was determined by HPLC with UV/Vis and ESI-TOF-MS detections. 3-galactosides of cyanidin (19,0–80,3%) and pelargonidin (15,1–75,6%) were found as main anthocyanins. An original methodology for iridoid determination based on HPLC with UV and ESI-TOF-MS detection was developed. The main iridoids were identified as loganic acid, loganin, sweroside and cornuside. Total iridoids content was 130–400 mg/100 g, and loganic acid was predominant in all samples (87,6–94,8%). Only minor amount of the DHCA derivatives (<10 mg/100 g) were found. The malic acid was predominant among organic acids, the total content of which varied from 0,4 to 2,8%. Relatively high amount of ascorbic acid (35–60 mg/100 g) was found. The carbohydrates profile of cornelian cherries was represented by fructose (2,2–3,8%) and glucose (2,5–7,0%). 70% water-ethanol extracts of Cornus mas fruits have showed pronounced antiradical activity in DPPH-test (470,5–932,0 mg TE/100 g). The data on specific minor BAS can be used in the standardization and evaluation of potential biological activity of extracts and dietary supplements based on the cornelian cherry fruits.

Keywords:cornelian cherry (Cornus mas L.), polyphenols, proanthocyanidins, anthocyanins, iridoids, organic acids, DPPH

Вопр. питания. - 2014. - Т. 83 , № 5. - С. 86-94.

Кизил - род древесных и кустарниковых растений семейства кизиловые (Cornaceae), включающий около 50 видов. В России наиболее распространен кизил обыкновенный (Cornus mas L.).

В диком виде кизил обыкновенный произрастает на Кавказе, широко культивируется в южных областях России.

Плоды кизила обыкновенного имеют давнюю традицию пищевого применения как в свежем виде, так и в виде джемов, соков, мармелада, сиропов, соусов и настоек. В традиционной медицине плоды кизила применяются для лечения лихорадки, диареи, заболеваний почек. Изучение биологической активности экстрактов плодов кизила показало наличие выраженной антиоксидантной, противовоспалительной, антимикробной активности. В доклинических и клинических исследованиях показано антидиабетическое, антиатеросклеротическое, гиполипидемическое действие плодов кизила [6, 14, 19].

Широкий спектр биологической активности плодов кизила обыкновенного обусловлен комплексом биологически активных веществ: полифенольных соединений (антоцианов, проантоцианидинов), иридоидов, органических кислот.

Так, антоцианы, выделенные из плодов кизила обыкновенного, в опытах in vitro и in vivo стимулировали секрецию инсулина β-клетками поджелудочной железы, снижали инсулинорезистентность клеток и концентрацию триглицеридов в печени [11, 15]. Показано антигенотоксическое, нейропротекторное, антидиабетическое действие иридоидов кизила in vitro [8, 12, 13, 19]. Иридоиды, характерные для кизила обыкновенного, выделенные из других растений, обладали противовоспалительной, антибактериальной, анти-грибковой, спазмолитической (логанин, сверозид) активностью [9].

Целью работы явилось определение основных минорных биологически активных веществ плодов отечественного дикорастущего и культивируемого кизила обыкновенного и их содержания (антоцианинов, олигомерных проантоцианидинов, иридоидов, органических кислот, моно- и дисахаридов), а также определение антирадикальной активности в тесте in vitro.

Материал и методы

Исследовано 10 образцов свежезамороженных плодов кизила обыкновенного, из них 8 сортов выведены в Мичуринске и заготовлены в Тамбовской области в 2012 г. (№ 1-8 в таблицах); 2 образца дикорастущего кизила из Кавказского региона (зрелые ягоды - № 9, недозрелые ягоды - № 10).

Экстракцию полифенольных соединений и олигомерных проантоцианидинов проводили метанолом в отношении 1:100. Антоцианины, иридоиды извлекали 70% водным этанолом, гидроксикоричные кислоты - 50% водным этанолом в отношении 1:100. Органические кислоты и сахара из растительного сырья экстрагировали дистиллированной водой в отношении 1:100.

Суммарное содержание полифенольных соединений в пересчете на галловую кислоту определяли с помощью модифицированного метода Фолина-Чокальтеу, содержание суммы проантоцианидинов - модифицированным методом Бейта-Смита [5].

Определение суммы антоцианинов в пересчете на цианидин-3-глюкозид проводилось методом рН-дифференциальной спектрофотометрии [2, 5] на спектрофотометре "UV-1800 Shimadzu" ("Shimadzu Corporation", Япония) с диапазоном длин волн 190-1100 нм.

Состав антоцианинов и иридоидов определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с фотометрическим и массспектрометрическим (МС) детектированием на жидкостном хроматографе "Agilent 1100 series" ("Agilent Technologies", США) с диодно-матричным спектрофотометрическим детектором "Agilent 1100 Series Diode Array", времяпролетным массселективным детектором "Agilent 6200 TOF LC/MS" с ионизацией электрораспылением.

Условия ВЭЖХ для определения антоцианинов: колонка Phenomenex Luna C18 250×4,6 мм 5 мкм; бинарная подвижная фаза: А - 4% водный раствор ортофосфорной кислоты (рН 2,1), В - ацетонитрил (0 мин - 10% В, 10 мин - 15% В, 15 мин - 20% В); температура колонки 40 °С; скорость потока растворителя 1,0 мл/мин; объем вводимой пробы 10 мкл; фотометрическое детектирование при λ=520 нм. Для ВЭЖХ-МС: А - 1% водный раствор муравьиной кислоты, В - ацетонитрил (0 мин - 10% В, 10 мин - 15% В, 20 мин - 20% В); температура колонки 40 °С; скорость потока растворителя 0,5 мл/мин. Сканирование масс - в режиме регистрации положительных ионов в диапазоне m/z 100-1000; напряжение на капилляре - 3,5 кВ, поток газа-осушителя (азот) - 9 л/мин, температура - 325 °С, давление на распылителе - 0,27 МПа.

Условия ВЭЖХ для определения иридоидов: колонка ProteCol C18 HPH125 250×4,6 мм, 5 мкм; подвижная фаза А - 0,1% водный раствор муравьиной кислоты, В - метанол (0 мин - 5% В, 40 мин - 80% В); температура колонки - 30 оС; скорость потока растворителя - 0,5 мл/мин. Объем вводимой пробы - 5 мкл. Фотометрическое детектирование при λ=235 нм. Параметры масс-детектирования описаны нами ранее [3].

Содержание гидроксикоричных кислот определяли методом ВЭЖХ с УФ-спектрофотометрическим детектированием [4].

Содержание органических кислот и аскорбиновой кислоты определяли методом ВЭЖХ [1, 5].

Содержание свободных моно- и дисахаридов определяли методом капиллярного электрофореза на системе "Agilent 7100" ("Agilent Technologies", США) с диодно-матричным спектрофотометрическим детектором на кварцевом капилляре Agilent L=72 см, ID=50 мкм, буфер - Agilent Basic Anion Buffer.

Температура термостата 25 оС, напряжение - 30 кВ. Косвенное фотометрическое детектирование проводили при длине волны 350 нм, контрольная длина волны - 275 нм.

Антирадикальную активность оценивали в DPPHтесте (2,2-дифенил-1-пикрилгидразил) in vitro и выражали в мг тролоксового эквивалента (ТЭ) на 100 г плодов [7].

Результаты и обсуждение

Содержание основных групп полифенольных соединений кизила обыкновенного (мг/100 г свежих плодов) представлено в табл. 1.

Содержание полифенольных соединений варьировало в диапазоне от 150 до 400 мг/100 г свежих плодов. Содержание олигомерных проантоцианидинов составило 20-25 мг/100 г в недозрелых плодах кизила и 80-430 мг/100 г в зрелых.

Антоцианины. Суммарное содержание мономерных антоцианинов отечественного кизила составило от 10 до 92 мг/100 г (см. табл. 1). Наибольшее количество антоцианинов найдено в образце № 8, наименьшее - в образце № 10. Полученные результаты сопоставимы с данными литературы по содержанию антоцианинов в плодах кизила обыкновенного из других регионов. Так, в плодах кизила, собранных в Словакии, содержание анто-цианинов составило 29-111 мг/100 г, в Польше - 50 мг/100 г, в Турции - 65 мг/100 г [10, 16-18].

Впервые установлен профиль индивидуальных антоцианов отечественного кизила. В качестве основных антоцианинов в отечественных плодах кизила найдены 3-галактозиды цианидина и пеларгонидина. Минорные антоцианины идентифицированы как 3-глюкозиды дельфинидина, цианидина и пеларгонидина соответственно (рис. 1).

Параметры удерживания, максимумы поглощения в видимой области и результаты масс-спектрометрического анализа антоцианинов представлены в табл. 2.

Состав антоцианинов во всех образцах идентичен, при этом варьирует только относительное содержание антоцианинов. В плодах кизила № 1, 3-5 преобладает пеларгонидин-3-галактозид (56,6-75,6% от суммы антоцианинов), в плодах кизила №2, 9 и 10 - цианидин-3-галактозид (61,0-80,3% от суммы антоцианинов), а в образцах №6-8 цианидин-3-галактозид и пеларгонидин-3галактозид содержатся в отношении приблизительно 1:1 (табл. 3).

Иридоиды. Разработана оригинальная методика определения иридоидов кизила методом ВЭЖХ с УФ- и МС-детектированием. В качестве основных иридоидов плодов кизила обыкновенного обнаружены 2 иридоидных гликозида (логаниновая кислота и логанин) и 2 секоиридоидных гликозида (сверозид и корнузид), что соответствует данным литературы [8].

Параметры удерживания, максимумы поглощения в УФ-области и результаты МС-анализа иридоидов представлены в табл. 4.

ВЭЖХ-МС хроматограмма выделенных ионов [M+Na] иридоидов кизила обыкновенного представлена на рис. 2. Спектрофотометрическое детектирование при ВЭЖХ иридоидов проводили при длине волны 235 (±2) нм, соответствующей основному максимуму поглощения иридоидов в УФ-области (рис. 3).

Результаты количественного определения иридоидов в образцах плодов кизила обыкновенного представлены в табл. 5.

Суммарное содержание иридоидов в кизиле обыкновенном составило 130-400 мг/100 г.

Во всех исследованных образцах среди иридоидов преобладает логаниновая кислота, составляя от 87,6% (образец № 4) до 94,8% (образец № 3) от суммарного содержания иридоидов.

Гидроксикоричные кислоты. Содержание производных гидроксикоричных кислот в плодах кизила составило 7,3-11,4 мг/100 г в пересчете на хлорогеновую кислоту.

Органические кислоты. Содержание органических кислот в плодах кизила колебалось от 417 до 2793 мг/100 г (0,4-2,8%). В качестве основных были найдены яблочная (400-2730 мг/100 г) и лимонная (16-80 мг/100 г) кислота. Во всех образцах превалирует яблочная кислота, составляя от 95,9 до 97,8% от суммарного содержания органических кислот.

Аскорбиновая кислота. В исследованных образцах плодов кизила обыкновенного обнаружено довольно высокое содержание аскорбиновой кислоты - 35,0-60,0 мг/100 г, сопоставимое с ее содержанием в апельсинах (53 мг/100 г), красной смородине (58-81 мг/100 г), клубнике (29-57 мг/100 г), малине (23-32 мг/100 г) [20].

Моно- и дисахариды. Электрофореграмма сахаров плодов кизила обыкновенного представлена на рис. 4.

Во всех исследованных образцах найдены фруктоза в количестве 2210-3880 мг/100 г (2,2-3,8%) и глюкоза - 2530-6970 мг/100 г (2,5-7,0%). Соотношение глюкоза/фруктоза в образцах составило 1,1-1,5, за исключением образцов № 7 и 5 (соотношение - 2,2-2,3).

DPPH-тест. В результате проведенных нами исследований показано, что антирадикальная активность плодов кизила обыкновенного, в DPPH-тесте in vitro варьировавшая в диапазонеот 470 до 932 мг ТЭ/100 г (см. табл. 1), примерно эквивалентна антирадикальной активности клюквы (409 мг ТЭ/100 г), брусники (709 мг/100 г), черной смородины (474-987 мг ТЭ/100 г) и черники (680-1200 мг/100 г). Прослеживается прямая зависимость антирадикальной активности плодов кизила от общего содержания и содержания отдельных групп полифенольных соединений и аскорбиновой кислоты (см. табл. 1).

Заключение

На основе разработанных оригинальных аналитических методик впервые систематически исследованы основные показатели, характеризующие пищевую ценность и содержание биологически активных веществ плодов кизила обыкновенного (Cornus mas L.): общее содержание и профиль органических кислот, углеводов, полифенольных соединений (антоцианинов, проантоцианидинов, гидроксикоричных кислот), иридоидов, а также антирадикальная активность экстрактов в DPPH-тесте in vitro.

Полученные результаты могут быть использованы для оценки пищевой и биологической ценности, потенциальной фармакологической активности, установления хемотаксономических индикаторов и стандартизации продуктов на основе плодов кизила.

Литература

1. ГОСТ 31643-2012 Продукция соковая. Определение аскорбиновой кислоты методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

2. ГОСТ Р 53773-2010 Продукция соковая. Методы определения антоцианинов.

3. Жогова А.А., Эллер К.И., Самылина И.А. ВЭЖХ-масс-спектрометрия в анализе индикаторных иридоидов растительного сырья // Фармация. - 2012. - № 7. - С. 14-17.

4. Медведев Ю.В., Передеряев О.И., Арзамасцев А.П. и др. Определение гидроксикоричных кислот в лекарственном растительном сырье и объектах растительного происхождения // Вопр. биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2010. - № 3. - С. 25-31.

5. Методы анализа минорных биологически активных веществ пищи / Под ред. В.А. Тутельяна, К.И. Эллера. - М.: Династия, 2010. - С. 28-40.

6. Asgary S., Kelishadi R., Rafieian-Kopaei M. et al. Investigation of the Lipid-Modifying and Antiinflammatory Effects of Cornus mas L. Supplementation on dyslipidemic children and adolescents // Pediatr. Cardiol. - 2013. - 34 (7). - 1729-1735.

7. Bondet V., Brand-Williams W., Berset C. Kinetics and mechanisms of antioxidant activity using the DPPH- Free Radical Method // Lebensm.-Wiss. Technol. - 1997. - Vol. 30. - P. 609-615.

8. Deng S., West B.J., Jensen C.J. UPLC-TOF-MS Characterization and Identification of Bioactive Iridoids in Cornus mas Fruit // J. Anal. Methods Chem. - 2013. - Vol. 2013. - P. 1-7. 9. Dinda B., Debnath S., Harigaya Y. Naturally occurring secoiridoids and bioactivity of naturally occurring iridoids and secoiridoids. A review, part 2 // Chem. Pharm. Bull. - 2007. - Vol. 55, N 5. - P. 689-728.

10. Gunduz K., Saracoglu O., Цsgen M. et al. Antioxidant, physical and chemical characteristics of cornelian cherry fruits (Cornus mas L.) at different stages of ripeness // Acta Sci. Pol., Hortorum Cultus. - 2013. - Vol. 12, N 4. - P. 59-66.

11. Jayaprakasam B. Olson L.K., Schutzki R.E. et al. Amelioration of obesity and glucose intolerance in high-fat-fed C57BL/6 mice by anthocyanins and ursolic acid in Cornelian cherry (Cornus mas) // J. Agric. Food Chem. - 2006. - Vol. 54, N 1. - P. 243-248.

12. Jeong E. J. Kim T.B., Yang H. et al. Neuroprotective iridoid glycosides from Cornus officinalis fruits against glutamate-induced toxicity in HT22 hippocampal cells // Phytomedicine. - 2012. - Vol. 19, N 3. - P. 317-321.

13. Lee K.Y., Sung S.H., Kim S.H. et al. Cognitive-enhancing activity of loganin isolated from Cornus officinalis in scopolamineinduced amnesic mice // Arch. Pharm. Res. - 2009. - Vol. 32. - P. 677-683.

14. Mirbadalzadeh R., Shirdel Z. Antihyperglycemic and antihyperlipidemic effects of Cornus mas extract in diabetic rats compared with glibenclamide // Elixir (Hormo. & Signal). - 2012. - Vol. 47. - P. 8969-8972.

15. Nair M. G., Jayaprakassam B., Olsom L.K. et al. Insulin secretion by anthocyanins and anthocyanidins: пат. 7737121 США. 2010.

16. Paulovicsova B., Turianica I., Jurikova T. et al. Antioxidant properties of selected less common fruit species // Lucrari stiintifice Zootehnie si Biotehnologii. Timisoara. - 2009. - Vol. 42, N 1.

17. Pyrkosz-Biardzka K., Kucharska A.Z., Sokol-Letowska A. et al. A comprehensive study on antioxidant properties of crude extracts from fruits of Berberis vulgaris L., Cornus mas L. and Mahonia aquifolium Nutt // Pol. J. Food Nutr. Sci. - 2014. - Vol. 64, N 2. - P. 6-17.

18. Vareed S.K., Reddy M.K., Schutzki R.E. et al. Anthocyanins in Cornus alternifolia, Cornus controversa, Cornus kousa and Cornus florida fruits with health benefits // Life Sci. - 2006. - Vol. 78. - P. 777-784.

19. Yamabe N., Noh J.S., Park S.H. et al. Evaluation of loganin, iridoid glycoside from Corni Fructus, on hepatic and renal glucolipotoxicity and inflammation in type 2 diabetic db/db mice // Eur. J. Pharmacol. - 2010. - Vol. 648, N 1. - P. 179-187.

20. URL: http://ndb.nal.usda.gov/ndb/ USDA National Nutrient Database for Standard reference.