Complex of zinc with enzymatic hydrolysate of pigspleen protein – in vivo investigation

Abstract

Experimental sample of complex zinc with enzymatic hydrolysate of pigspleen protein (Zn-EHPS) was produced in laboratory with ultra- and nanofiltration technologies; its composition was analyzed; male rats Wister (initial body weight 132Ѓ}2,4 g) were under observation in vivo: rats were given zinc-deficient ration (ZDR) ≪Zinc Deficient Diet, Egg White Base≫, containing not more than 1,3 mg zinc/kg, and water ad libitum during 18 days. Animals were divided into 3 groups (10 in each): group 1 was given ZDR and distilled water; group 2 – ZDR and water zinc sulphate solution (ZnSO4) with zinc concentration of 16,3 mcg/ml; group 3 – ZDR and water Zn-EHPS solution with zinc concentration of 16,3 mcg/ml. All rats were daily observed with registration of water consumption. Unconditioned reflex (photophobia) or crossing time from light to darkness on special system before the beginning of experiment was tested out.

An increase of body weight (ΔW) during the experiment, unconditioned reflex stability and training to conditioned passive avoidance reflex (CPAR) after paw painful electric stimulation were studied. On 18 day in 16 hours after paw painful electric stimulation alkaline phosphatase activity (AP) and corticosterone concentration in rat blood serum were examined. Insignificant changes in distribution of peptide fractions according its molecular mass and practical complete remove of free metal ions from final product were observed when Zn-EHPS-technology were used. During experiment in all groups correspondently ΔW was 23, 87 and 82% (p<0,05); AP activity – 1,70Ѓ}0,06; 3,10Ѓ}0,25; 4,19Ѓ} 0,26 mcmol/l/s (p<0,01); corticosterone concentration – 20,7Ѓ}7,2; 21,5Ѓ}6,3; 22,1Ѓ}6,5 ng/ml (p>0,1) were observed. Significant (p<0,05) worse change of unconditioned reflex (photophobia) in group 1 (ZDR) in comparison with group 2 and group 3 (latent period – LP, s: 50,9Ѓ}12,0; 18,2Ѓ}16,0; 16,0Ѓ}4,2) as well as to initial test (LP, s – 16,8Ѓ}8,0) was found on the 14th day of the experiment.

According to LP-test CPAR in all groups in 24 and in 96 hours after paw painful electric stimulation was found to be maintained. Data obtained let to suggest high bioavailability of new zinc organic form – Zn-EHPS and its usage possibility in fortification of special foods.

Keywords:enzymatic hydrolysis, ultra-and nanofiltration technology, essential microelement, zinc, pig spleen, passive avoidance

Вопр. питания. - 2014. - Т. 83 , № 5. - С. 58-63.

Глобальная проблема недостаточной микронутриентной обеспеченности населения различных регионов определяет необходимость научного обоснования, разработки инновационных технологических подходов, а также комплексной медико-биологической оценки безопасности и эффективности использования в питании новых пищевых источников микронутриентов, включая эссенциальные микроэлементы (ЭМ). Возможность эффективного использования в питании человека новых источников ЭМ в значительной степени определяется их способностью всасываться в пищеварительном тракте и ассимилироваться в организме. С общебиологических позиций, учитывающих эволюционный фактор, очевидна целесообразность использования в питании человека преимущественно органических форм микроэлементов [7, 8], в том числе связанных с пептидами. В серии работ нами были определены оптимальные условия ферментативного гидролиза пищевых белков различного происхождения: концентрата белков коровьего молока, белка куриного яйца, изолята соевых белков и некоторых других белковых источников и показана эффективность использования реакции их комплексирования с различными ЭМ-антиоксидантами (цинк, медь, марганец) для получения их органически связанных форм [2, 3]. Проведенные доклинические исследования in vitro и in vivo с использованием физико-химических, иммунохимических, физиолого-биохимических подходов и методов экспериментальной аллергологии, а также исследования биодоступности и влияния комплексов цинка с некоторыми ферментативными гидролизатами пищевых белков на состояние кишечного барьера у лабораторных животных показали перспективность безопасного и эффективного использования полученных комплексов микроэлементов в профилактическом и лечебном питании для восполнения микроэлементной недостаточности.

В то же время использованные нами ранее для получения ферментолизатов пищевые белки достаточно дорогостоящи, уже давно востребованы сами по себе и успешно применяются в пищевой промышленности. Встает вопрос о поиске новых пищевых белков и их ферментолизатов для получения органических форм ЭМ, так как необходимо иметь максимально широкий выбор ферментативных гидролизатов [5] с учетом возможной непереносимости некоторых из них отдельными лицами. Это может быть достигнуто, в частности, разработкой технологии с использованием ферментолизатов различного белоксодержащего сырья животного происхождения за счет дешевых отходов мясоперерабатывающей промышленности, например, селезенки свиньи.

Цели исследования - получить в лабораторных условиях комплекс цинка с ферментативным гидролизатом белка селезенки свиньи (Zn-ФГСС), оценить in vivo усвояемость полученной органической формы цинка и его влияние на ростовые показатели и устойчивость рефлексов.

Материал и методы

Для получения Zn-ФГСС использовали ферментативный гидролизат белка селезенки свиньи (ФГСС), представленный ООО "Петрохим" (РФ). Содержание белка (Nх6,25) в ФГСС составляло 79%, золы - 10%, влаги - 5%. Zn-ФГСС получали в результате реакции комплесообразования ФГСС с хлористым цинком (ZnCl2 семиводный) при их определенных весовых соотношениях и рН 7,0 с последующей микрофильтрацией (мембрана 0,65 мкм) и нанофильтрацией на лабораторной установке ("Владисарт", РФ). После концентрирования и двукратной отмывки дистиллированной водой собранную высокомолекулярную фракцию высушивали на сублимационной сушке ЛС-500 ("Проинтех", РФ).

Анализ молекулярно-массового распределения белково-пептидных фракций в составе ФГСС и ZnФГСС проводили методом эксклюзионной жидкостной хроматографии среднего давления [4].

Исследования in vivo усвояемости полученной органической формы цинка и его влияния на ростовые показатели, активность щелочной фосфатазы и устойчивость условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) проведены в эксперименте с использованием половозрелых крыс-самцов линии Вистар. Животные после их поступления из питомника "Столбовая" в течение 7 дней проходили адаптацию, получая в этот период времени стандартный рацион вивария.

Перед началом эксперимента крыс взвешивали и тестировали на проявление безусловного рефлекса пассивного избегания на установке ("PanLab", Испания) в виде камеры из двух отсеков: большое освещенное белое и маленькое черное отделения, разделенные опускными автоматическими воротами. Крысу однократно помещали в светлый отсек камеры спиной к темному отсеку, в который животное стремилось зайти в силу врожденного предпочтения темных участков пространства и исследовательского поведения. Латентный период (ЛП) перехода из светлого отсека камеры в темный регистрировали (тест 1, табл. 4), а затем крыс переводили в индивидуальные клетки. Исходя из данных тестирования в эксперимент были отобраны животные, ЛП перехода которых не превышал 120 с (2 мин); животные были равномерно распределены по группам с учетом значения ЛП и массы тела.

Исследования проведены на 30 животных со средней массой 132-133 г, которые в течение 18 сут получали ad libitum питье и коммерческий цинкдефицитный рацион (ЦДР) "Zinc Deficient Diet, Egg White Base" ("MP Biomedicals, LLC", Франция), содержащий следовые количества цинка (не более 1,3 мг цинка/кг корма).

На 14-е сутки эксперимента у всех животных вырабатывали УРПИ: регистрировали ЛП перехода из светлого отсека установки в темный (тест 2, табл. 4), и как только крыса переходила в темный отсек камеры, она получала болевое электрокожное раздражение на лапы (ток 0,4 мА). Затем крысу сразу же переводили в жилую клетку. В результате проведенного обучения животное должно избегать перехода в темную камеру при повторном тестировании, т.е. должно находиться в светлом отсеке [1].

Проверки сохранения УРПИ (воспроизведения рефлекса) состояли в повторном помещении животного в освещенный отсек на 15-е и 18-е сутки эксперимента (через 24 и 96 ч после обучения УРПИ).

В данном исследовании тестирование завершали, когда животное входило в темный отсек или если не делало этого в течение 3 мин (тесты 3 и 4, табл. 4).

В предпоследний день эксперимента за 16 ч до выведения из эксперимента животных подвергали стрессорному воздействию электрическим током, для этого крысу принудительно помещали в темный отсек камеры для УРПИ, где она получала болевое электрокожное раздражение на лапы (ток 0,4 мА в течение 8 с). На 19-е сутки животных выводили из эксперимента декапитацией под легким эфирным наркозом в соответствии с приказом Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23.08.2010 № 708н "Об утверждении правил лабораторной практики".

Кровь животных собирали и центрифугировали при t=4 °С в течение 25 мин при 1500 об./мин на центрифуге J-6B ("Beckman", Австрия) для получения сыворотки. Образцы отобранной сыворотки крови хранили в замороженном состоянии.

Об усвояемости цинка косвенно судили по активности щелочной фосфатазы (ЩФ) в сыворотке крови, определяемой с использованием коммерческого набора реактивов ("BioLaTest", Чешская Республика). В сыворотке крови иммуноферментным методом с использованием коммерческого набора "Corticosterone EIA kit" определяли содержание кортикостерона ("Immunodiagnostic System", Великобритания).

Величины определяемых показателей приведены в виде М±m, где М - выборочное среднее измеряемых величин, m - стандартная ошибка среднего. Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета программ SPSS Statistics 20, используя непараметрический ранговый критерий Манна-Уитни и критерий Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Полученный комплекс Zn-ФГСС представляет собой мелкодисперсный порошок коричневого цвета со слабым мясным запахом и вкусом; практически полностью растворимый в воде и содержащий в среднем 8,8% цинка (88 мг/г). Результаты исследования молекулярно-массового распределения пептидных фракций представлены в табл. 1.

Из приведенных результатов следует, что стадия нанофильтрации приводит к относительно незначительному изменению распределения фракций по молекулярным массам и практически полному удалению свободных ионов металла из конечного продукта.

Ежедневный осмотр животных в течение эксперимента (19 сут) показал, что их общее состояние в опытных группах (2-й и 3-й) было удовлетворительным по внешнему виду, качеству шерстного покрова, потреблению корма и воды, поведению и скорости роста (табл. 2).

На 4-е сутки у животных 1-й группы (цинк-дефицит), не получавших дополнительно цинка с водой, отмечались покраснения кожного покрова, расчесы, язвочки, изменение цвета и качества шерстного покрова. Масса тела и прирост массы тела у животных 1-й группы на 4-е сутки были достоверно ниже, чем у крыс 2-й и 3-й групп, получавших неорганическую соль цинка или Zn-ФГСС, а после 8 сут и до окончания эксперимента масса тела животных 1-й группы практически не увеличивалась (прирост составил всего 3%).

Во 2-й и 3-й группах прирост массы тела за период эксперимента составил соответственно 87 и 82% и достоверно не отличался друг от друга. Полученные результаты позволяют с достаточным основанием предположить, что на протяжении первых 7-8 дней эксперимента дефицит цинка в корме крыс 1-й группы компенсировался за счет физиологической способности организма снижать эндогенные потери цинка при его недостаточном поступлении с пищей.

О выраженной недостаточной обеспеченности цинком животных 1-й группы, т.е. о снижении их цинкового статуса, свидетельствуют результаты определения активности ЩФ (табл. 3), которая, являясь цинкзависимым ферментом, наиболее адекватно, по мнению ряда исследователей, реагирует на обеспеченность организма животного цинком [9, 10].

Активность ЩФ в сыворотке крови крыс 1-й группы оказалась почти в 2,5 и в 1,8 раза ниже (р<0,05) аналогичного показателя для крыс 3-й и 2-й групп, которые соответственно получали органическую или неорганическую формы цинка.

Одновременно активность щелочной фосфатазы в сыворотке крови крыс 2-й группы была достоверно ниже по сравнению с таковой у животных 3-й группы (p<0,05), получавших Zn-ФГСС. Этот результат при практически одинаковом потреблении цинка с водой животными 2-й и 3-й групп (разница недостоверна, p>0,05) (табл. 4) свидетельствует о лучшем, на наш взгляд, усвоении органической формы цинка, что может служить дополнительным аргументом в пользу преимуществ потребления органических соединений этого микроэлемента.

Данные тестирования рефлексов по длительности ЛП перехода животными в темный отсек представлены в табл. 4.

Как свидетельствуют представленные результаты при 2-м тестировании, нахождение на цинкдефицитном рационе привело к достоверному увеличе- нию латентного периода перехода в темный отсек для животных контрольной, 1-й, группы. Очевидно, потребление крысой в течение 14 сут цинкдефицитного корма, приводящее к резкому снижению обеспеченности животного цинком, ухудшает воспроизведение безусловного рефлекса (фотофобии). У животных опытных 2-й и 3-й групп, потреблявших цинк в количествах, обеспечивающих физиологическую потребность в этом ЭМ, безусловный рефлекс сохранялся в полном объеме.

Согласно полученным на третьем этапе данным тестирования УРПИ можно судить о том, что приобретенный крысами навык пассивного избегания остается сохранным через 24 ч после обучения для животных всех групп (ни одно животное не вошло в клетку) независимо от количества и формы потребляемого микроэлемента. В процедуре угасания через 96 ч после обучения (18-е сутки эксперимента) также наблюдалось длительное сохранение воспроизведения условного рефлекса на сформированном уровне у животных всех групп.

Содержание кортикостерона в сыворотке крови стрессированных на 18-е сутки крыс достоверно не отличалось во всех группах и составило соответственно 20,7±7,2; 21,5±6,3 и 22,1±6,5 нг/мл.

Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии влияния обеспеченности цинком и вида потребленного цинка на изученные показатели УРПИ и содержание кортикстерона в крови стрессированных животных в условиях проведенного эксперимента.

Проведенные исследования подтверждают опубликованные нами ранее данные по биодоступности некоторых новых пищевых источников органически связанных форм цинка, обобщенные в монографии [6]. В этих публикациях было показано достоверное снижение цинкового статуса, в том числе задержка в росте массы тела крыс, получавших корм с выраженным дефицитом цинка. Также было показано, что при последующем добавлении в корм цинка в виде комплекса с ферментативным гидролизатом белков коро- вьего молока в течение 14 дней (восстановительное 2-недельное кормление) обеспеченность животных этим ЭМ возрастала, что приводило к увеличению массы тела. При этом у животных другой группы, получавших параллельно в тех же условиях сульфат цинка, масса тела была достоверно ниже, а содержание цинка в костях определялось на том же уровне, что и у крыс, получавших дефицитный по цинку рацион в течение 28 дней [7].

Таким образом, установленная в опытах in vivo высокая биодоступность полученного комплекса Zn-ФГСС свидетельствует о его перспективности для использования в биологически активных добавках к пище и специализированных пищевых продуктах, предназначенных для восполнения микроэлементной недостаточности.

Литература

1. Буреш Ян. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения. - М.: Высшая школа, 1991. - Гл. 3. - С. 182-186.

2. Зорин С.Н. Ферментативные гидролизаты пищевых белков и органические комплексы эссенциальных микроэлементов на их основе // Вопр. питания. - 2009. - Т. 78, № 6. - С. 60-66.

3. Зорин С.Н., Баяржаргал М. Получение ферментативных гидролизатов пищевых белков с использованием некоторых коммерческих ферментных препаратов и различных схем проведения гидролиза // Биомедицинская химия. - 2009. - Т. 55, вып. 1. - С. 73-80.

4. Зорин С.Н., Баяржаргал М., Бурдза Е.А., Мазо В.К. Получение и характеристика ферментативного гидролизата изолята соевых белков // Вопр. питания. - 2006. - Т. 76, № 1. - С. 10-12.

5. Зорин С.Н., Сидорова Ю.С., Смирнова А.А. и др. Оптимизация аминокислотного состава белково-пептидных продуктов, используемых при изготовлении функциональных напитков // Вопр. питания. - 2012. - Т. 81, № 3. - С. 30-34.

6. Мазо В.К., Гмошинский И.В., Ширина Л.И. Новые пищевые источники эсссенциальных микроэлементов-антиоксидантов. - М., 2009. - 207 с.

7. Баяржаргал М., Мазо В.К., Гмошинский И.В. Изучение биодоступности нового пищевого источника цинка // Вопр. детской диетологии. - 2007. - Т. 5, № 2. - С. 11-14.

8. Mazo V.K., Gmoshinski I.V., Zorin S.N. New food sources of essential trace elements produced by biotechnology facilities//Biotechnol. J. - 2007. - Vol. 2, Issue 10. - Р. 1297-1305.

9. Prasad A.S. Laboratory diagnosis of zinc deficiency // J. Am. Coll.Nutr. - 1985. - Vol. 4, N 6. - P. 591-598.

10. Windisch W. Development of zinc deficiency in 65Zn labeled, fully grown rats as a model for adult individuals // J. Trace Elem. Med. Biol. - 2003. - Vol. 17, N 2. - P. 91-96.