Effect of polypeptides isolated from cattle abomasum on stomach regenerative processes in rats

Abstract

The effect of polypeptides isolated from cattle abomasum on regenerative processes of rat stomach upon simulating stomach mucosal damage caused by aspirin was studied. Experimental research was carried out on male Wistar rats with initial body weight of 230Ѓ}20 g. The duration of the experiment was 22 days. The rats were divided into 4 equal groups (n=11). The first (control) group consisted of the intact animals; animals from experimental groups 2–4 were intragastrically administered acetylsalicylic acid from the 1st to the 7th day for simulating stomach mucosal damage caused by aspirin (300 mg/100 g body weight). From day 8 to day 22, the animals were intragastrically administered the tested samples in the quantity of 2 ml per animal according to the scheme:

the 2nd group – distilled water, the 3rd group – native abomasum extract; the 4 th group – thermally treated abomasum extract. Abomasum extract was obtained by extraction with 0,87% aqueous sodium chloride crushed abomasum and represented a liquid of cream color with protein mass content of 1,3 g/100 g of the product with high content of glutamic acid (15,5 g/100 g protein) and B-group vitamins. Electrophoretic analysis of the extract revealed several high molecular weight fractions in the range of 72 to 55 kDa. The bands with molecular masses 52, 43, 40, 37, 34, 26, 17 kDa were most pronounced; the intensive bands in the area 12 kDa and in the range lower than 10 kDa were revealed. The results of the conducted study show that the abomasum extracts both in the native and thermally treated form exert therapeutic action on animal with stomach mucosal damage caused by aspirin, have good antiulcer and gastroprotective activities upon stomach mucosa exposure to chemical damaging agents. The analysis of the hematological indices of the animals from the 3rd and 4th groups, which received the test samples after simulation, revealed the normalization of leukocyte, lymphocyte, granulocyte and monocyte content.

This suggests the recovery of the animals after the disease. In the blood serum of these animals concentration of total bilirubin, cholesterol, triglycerides and glucose and the activity of gamma-glutamine transferase, ASAT and alkaline phosphatase decreased compared with those in animals with the model of stomach mucosal injury; while the total protein content, including the albumin fraction increased. The examination of the internal organs of the animals from the 3rd and 4th groups showed that the mucosal and submucosal membrane of the stomach were plicate, the signs of edema were absent, the hyperemia, any changes in mucosa, surface and glandular epithelium were not observed.

Keywords:polypeptides, abomasum extracts, rats, gastritis

Болезни органов пищеварения в структуре общей заболеваемости, особенно у детей, занимают одно из первых мест в мире, и общая тенденция к их росту сохраняется [4]. Медико-социальное значение указанной патологии определяется не только значительным распространением в наиболее ответственные периоды роста и развития ребенка, но и хроническим рецидивирующим течением, снижающим качество жизни, формированием осложненных форм заболеваний, в ряде случаев приводящих к инвалидизации. В структуре хронических заболеваний органов пищеварения у детей школьного возраста гастриты занимают второе место [2, 5].

Ведущая роль в профилактике и лечении данного заболевания принадлежит диетотерапии, основ- ные функции которой - устранение дефектов слизистой оболочки желудка (СОЖ) и восстановление ее нормальных функций. Наряду с диетотерапией в последние 10-15 лет появились новые методы лечения гастрита, основанные на применении полипептидов, обладающих тканеспецифическим действием и способных восстанавливать до оптимального уровня метаболизм в клетках тех тканей, из которых они выделены [5, 6].

Поскольку важным продуцентом биоактивных полипептидов является желудок крупного рогатого скота, так называемый железистый желудоксычуг, целью исследования была оценка влияния полипептидов, полученных в результате обработки сычуга, на восстановительные процессы слизистой оболочки желудка лабораторных животных с моделью острого аспиринового повреждения слизистой оболочки желудка.

Материал и методы

Технология выделения биоактивных полипептидов заключалась в измельчении сычуга в промышленной мясорубке "Mainca" PM-70/PM-12 (Испания) с диаметром отверстий решетки 2-3 мм, экстрагировании в физиологическом растворе (содержание хлорида натрия 0,87%) при температуре 22-24 °С в течение 22 ч в лабораторной диспергирующей установке, с верхнеприводной мешалкой и внешней охлаждающей рубашкой (ЛДУ, "Лаботекс", РФ) с частотой вращения 500 об/мин. Далее экстракт фильтровали через ватно-марлевый фильтр и центрифугировали на настольной центрифуге "СМ-6М" ("ELMI", Латвия) в течение 8 мин при частоте вращения 3500 об/мин с целью отделения осадка. Полученный экстракт представлял собой жидкость кремового цвета c массовой долей белка 1,3 г/100 г продукта.

Исследование аминокислотного состава показало высокое содержание глутаминовой кислоты (15,5 г/100 г белка), которая является строительным материалом и поставщиком энергии для СОЖ, усиливает иммунный барьер слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта и препятствует проникновению через нее микроорганизмов. В экстракте содержатся витамины (мг/100 г продукта): В6 (0,83±0,04), В1 (0,03±0,002), РР (2,61±0,13). Срок годности 24 ч при 0-4 °С.

Анализ электрофоретического исследования экстракта выявил несколько высокомолекулярных фракций в диапазоне от 72 до 55 кДа. Наиболее заметными были полосы с молекулярными массами 52, 43, 40, 37, 34, 26, 17 кДа; выявлена интенсивная полоса в области 12 кДа и в диапазоне ниже 10 кДа.

Возможно, это указывает на присутствие в экстрактах различных эндопротеиназ [ренина (37 кДа), пепсина (32,7 кДа), трипсина и химотрипсина (25 кДа)], проферментов или зимогенов [например, пепсиногена, трипсиногена (42,5 кДа)], гормонов [гастрин, холицистин, секретин (от 4,2 до 2 кДа)].

Экспериментальные исследования проведены на 44 половозрелых белых крысах-самцах стока Вистар (масса тела 230±20 г), полученных из филиала "Андреевка" ГУ НЦБМТ РАМН (Московская область, Солнечногорский район, п. Андреевка). Содержание, питание, уход за животными и выведение их из эксперимента осуществляли в соответствии с требованиями "Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных", Международных рекомендаций (этический кодекс) по проведению медико-биологических исследований с использованием животных.

Животные содержались в клетках TECNIPLAST тип IV S в стандартных условиях вивария при сходных условиях в отношении температуры (23±2 °С), влажности (48±2%), освещения (с 6.00 до 18.00), при свободном доступе к воде и пище [3].

Эксперимент длился 22 дня; в течение этого срока животные получали полноценный стандартный рацион вивария по ГОСТ Р 50258-92. Крысы были рандомизированно по массе распределены на 4 группы (контрольная и 3 опытных). 1-я группа состояла из интактных животных, потреблявших на протяжении всего эксперимента стандартный рацион вивария. Животным 2-4-й опытных групп с 1-х по 7-е сутки эксперимента проводили моделирование аспиринового повреждения СОЖ по классической схеме, путем внутрижелудочного введения ацетилсалициловой кислоты из расчета 300 мг/100 г массы тела 1 раз в сутки [7, 8].

После завершения моделирования, с 8-х по 22-е сутки, животным внутрижелудочно через зонд вводили исследуемые образцы по 2 мл/сут на голову по схеме: 2-й группе животных - дистиллированную воду; 3-й группе - нативный экстракт сычуга; 4-й группе - термообработанный экстракт сычуга.

На протяжении всего эксперимента вели наблюдение за состоянием животных (поедаемостью корма, поведением, состоянием шерстного покрова, наличием или отсутствием диареи) и массой их тела, которую определяли с помощью электронных технических весов "Ohaus" ("Adventurer Pro", США) с точностью ±0,1 г. По окончании эксперимента производили забор крови и патологоанатомическое вскрытие. Макроскопически оценивали состояние внутренних органов, определяли абсолютную массу печени, почек, селезенки, сердца путем взвешивания на электронных весах ("AcculabVicon", США) с точностью ±0,001 г, после чего рассчитывали относительную массу внутренних органов (в % от общей массы тела животного [8, 9]). Общее клиническое исследование проб крови проводили на автоматическом ветеринарном гематологическом анализаторе "Abacusjuniorvet 2.7" ("Diatron Messtechnik GmbH", Австрия), используя наборы реактивов ("Diatron", Австрия). В крови животных определяли 18 показателей, представленных в табл. 1.

Биохимические исследования проводили на полуавтоматическом биохимическом анализаторе ("Bio Chem SA", США), используя наборы реактивов ("High Technology", США). В крови животных определяли: содержание общего белка, альбумина, билирубина общего, билирубина прямого, креатинина, мочевины, холестерина, триглицеридов, активность АСТ, АЛТ, ЛДГ, щелочной фосфатазы.

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы Statistica 6.0, с применением t-критерия Стьюдента, статистически достоверными считали различия при p<0,05.

Математическая обработка данных включала расчет средних значений со стандартными ошибками (M±m).

Результаты и обсуждение

Наблюдения за интактными животными (1-я группа) не выявили никаких отклонений - состояние животных на протяжении всего эксперимента находилось в пределах физиологической нормы.

При моделировании аспиринового повреждения СОЖ у животных 2-4-й групп начиная с 3-х суток отмечалось угнетенное состояние, снижение двигательной активности, размягчение кала и частая дефекация, в остальном состояние животных находилось в пределах физиологической нормы.

На 7-е сутки моделирования был произведен забой 5 крыс из 2-4-й групп выборочно, при проведении аутопсии наблюдалось вздутие желудочно-кишечного тракта, в особенности желудка и тонкого кишечника, макроскопическое исследование органов желудочно-кишечного тракта выявило наличие точечных геморрагий в пилорической части и дна желудка размером 0,3-0,6 мм.

Наблюдение за динамикой изменения массы тела лабораторных животных в ходе эксперимента (рис.) показало, что животные 1-й группы (интактные) набирали массу тела в среднем по 3-5 г/сут. Животные 2-й группы, не получавшие лечения после моделирования аспиринового повреждения СОЖ, с 1-х по 7-е сутки теряли в массе тела (до 10 г/сут), начиная с 9-х суток и до окончания эксперимента наблюдалось некоторое увеличение массы тела.

У животных 3-й и 4-й групп начиная с первых суток отмечено аналогичное снижение массы тела, при этом, начиная с 9-х суток, животные этих групп достаточно стабильно набирали массу тела, на 21-е сутки масса тела животных незначительно превышала первоначальный показатель.

Максимальный прирост массы тела отмечен у интактных животных (1-я группа) - 15,2%.

У животных 3-й группы он составил 3,3%, у крыс 4-й группы - 2,05%. У животных с моделью аспиринового повреждения СОЖ по окончании эксперимента был отмечен отрицательный прирост массы тела (-18,2%).

Анализ результатов гематологического исследования крови животных 2-й группы, которым после воспроизведения заболевания вводили дистиллированную воду, показал увеличение количества лейкоцитов, лимфоцитов, моноцитов, гранулоцитов. Содержание эритроцитов, гемоглобина и тромбоцитов достоверно не отличалось от показателей интактных животных. При анализе гематологических показателей крови животных 3-й и 4-й группы, которым после моделирования вводили исследуемые образцы полипептидов, была выявлена нормализация содержания лейкоцитов, лимфоцитов, гранулоцитов и моноцитов, что косвенно свидетельствует о восстановлении состояния животных после перенесенного заболевания (табл. 1).

Результаты биохимического исследования сыворотки крови крыс представлены в табл. 2.

У животных 2-й группы после моделирования аспиринового повреждения СОЖ в сыворотке крови (табл. 2) отмечены достоверно сниженные уровени общего белка на 7% и альбумина на 25%, а содержание глюкозы, общего билирубина, холестерина, триглицеридов и активность щелочной фосфатазы, гамма-глутаминтрансферазы очень высокое. Снижение содержания белка, в том числе альбуминовой фракции, косвенно указывает на обезвоживание организма, являющееся следствием диареи. Увеличение активности АСТ, щелочной фосфатазы и гамма-глутаминтрансферазы в 1,3-1,4 раза и концентрации глюкозы, общего билирубина, холестерина и триглицеридов можно связать с повреждающим фактором аспириновой кислоты на печень экспериментальных животных [10].

При сравнительном анализе основных биохимических показателей сыворотки крови животных, в рацион которым вводили исследуемые образцы (3-я и 4-я группы), относительно показателей животных 2-й группы можно отметить положительную тенденцию. Так, отмечено снижение концентрации общего билирубина, холестерина, триглицеридов, активности гамма-глутаминтрансферазы, АСТ, щелочной фосфатазы у животных 2-й и 3-й групп по сравнению с показателями животных с моделью повреждения СОЖ; нормализация содержания общего белка, в том числе альбуминовой фракции, а также глюкозы (табл. 2).

Эти данные, по-видимому, свидетельствует о нивелировании патологических процессов, а также о нормализации метаболизма в организме животных, которым вводили как нативный, так и термообработанный экстракт сычуга.

Патологоанатомическое исследование животных 1-й группы не продемонстрировало никаких внешних проявлений воспалительных или иных патологических процессов во внутренних органах (пищеварительном тракте, поджелудочной железе и печени, дыхательной системе, органах кровообращения и кроветворения, мочевыделительной системе). Печень и селезенка имели однородный насыщенный бордовый цвет и упругую консистенцию. У животных с аспириновым повреждением СОЖ, получавших дистиллированную воду (2-я группа), выявлены следующие макроскопические изменения: слизистая оболочка желудка отечная, сглаженная, гиперемированная, в 100% случаях обнаруживаются точечные кровоизлияния в области дна желудка, в 70-60% - эрозии, сохраняются язвенные дефекты.

Исследование внутренних органов животных 3-й и 4-й групп показало, что слизистая и подслизистая оболочка желудка складчатая, явления отечности, гиперемии отсутствовали, каких-либо изменений слизистой, покровного и железистого эпителия не отмечалось.

В результате проведенных исследований показано, что экстракты сычуга как в нативном, так и в термообработанном виде оказывают терапевтическое действие на организм животных при моделировании аспиринового повреждения СОЖ. Экстракты способствуют нормализации биохимических показателей крови, сохранению складчатости слизистой, предотвращают дальнейшее развитие деструктивных изменений покровного и железистого эпителия: оказывают стимулирующее влияние на регенераторные процессы структурно-функциональной организации СОЖ.

Выявленный нами терапевтический эффект экстрактов сычуга при воздействии химических повреждающих агентов на СОЖ, возможно, обусловлен содержанием в экстрактах целого комплекса биологически активных веществ, в том числе проферментов. Дополнительным фактором является усиление местного синтеза простагландинов, способных улучшать микроциркуляцию в слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта.

Литература

1. Александрова Ю.Н. О системе цитокинов // Педиатрия - 2007. - Т. 86, № 3. - С. 124-128.

2. Баранов А.А., Щербаков П.Л. Актуальные вопросы детской гастроэнтерологии // Вопр. соврем. педиатрии. - 2002. - Т. 1, № 1. - С. 12.

3. Бекетова Н.А., Кравченко Л.В., Кошелева О.В. и др. Влияние биологически активных соединений индол-3 карбинола и рутина на обеспеченность крыс витаминами А и Е при различном содержании жира в рационе // Вопр. питания. - 2013. - Т. 82, № 2. - С. 23-30.

4. Волков А.И., Усанова Е.П. Динамика эпидемиологических показателей за болеваемости органов пищеварения у детей // Тезисы докладов Всероссийского совещания "Детская гастроэнтерология: настоящее и будущее". - М., 2002. - С. 54-55.

5. Волынец Г.В., Гаранжа Т.А., Сперанский А.И. и др. Этиологическая характеристика основных типов хронического гастрита у детей // Рус. мед. журн. - 2005. - Т. 13, № 18. - С. 1208-1214.

6. Ерпулева Ю.В. Смеси на основе пептидов у больных с патологией желудочно-кишечного тракта: современные позиции // Лечащий врач. - 2008. - № 2 . - С. 80-82.

7. Максарова Д.Д. Оценка эффективности действия цеолита на течение аспиринового повреждения слизистой оболочки желудка у крыс // Вестник Бурятского государственного университета -2009. Вып. 4. Биология, география. - С. 83-85.

8. Максарова Д.Д. Модифицированное фитобактериальное средство при аспириновом повреждении слизистой оболочки желудка белых крыс // Вестник Бурятского государственного университета - 2012. Вып. 4. - С. 220-225.

9. Полтырев С.С., Курцин И.Т. Физиология пищеварения. - М.: Высшая школа, 1980. - С. 256.

10. Самонина Г.Е., Копылова Г.Н., Герман C.B. и др. Эндогенные пептиды и гомеостаз слизистой оболочки желудка // Патофизиология органов и систем. Типовые патологические процессы (экспериментальные и клинические аспекты). Материалы I Российского конгресса по патофизиологии. - М., 9-12 окт. 2000. - С. 133.

11. Сурменёв Д.В., Баженов С.М., Дубенская Л.И., Ермачкова Е.Н. Показатели периферической крови как маркёры хронических воспалительных заболеваний верхних отделов пищеварительного тракта // Математическая морфология. Электронный математический и медико-биологический журнал. - 2010. - Т. 9, вып. 3. - С. 12.

Вопр. питания. - 2014. - Т. 83 , № 5. - С. 26-32.