Effect of vitamin sufficiency on adaptation syndrome in growing rats

Abstract

The influence of vitamin supply of growing male Wistar rats (n=21) with an initial body weight 53,5Ѓ}0,9 g on their resistance to a single distress induced by the electric shock has been investigated. Control rats within 21 days received a complete semisynthetic diet, providing adequate amounts of vitamins. Combined vitamin deficiency in experimental rats was caused by 5-fold decrease of vitamin mixture amount in the feed and the total vitamin E exclusion from the mixture.

On the 21st day, one day before the end of the experiment, both groups of rats were subjected to stress impact (electrocutaneous irritation on paws, 0,4 mA for 8 sec) and then animals were placed in metabolic cages to collect urine. By the end of the experiment, the animals with the combined vitamin deficiency lag behind in growth. Vitamin B2, A, B1 and E liver content decreased in experimental rats by 1,6, 2,3, 4,4 and 15 fold accordingly. Retinol plasma concentration was significantly reduced by 18%, α-tocopherol level – by 5 fold, urinary excretion of riboflavin and 4-pyridoxic acid (vitamin B6 metabolite) was significantly reduced by 6,5 and 2,46 times accordingly. MDA blood plasma concentration and the urinary ratio of oxidized and not oxidized form of 8-hydroxy-2’-deoxyguanosine did not differ in both groups of rats. Urinary excretion of stress biomarker corticosterone in rats with combined vitamin deficit was 2,5-fold higher than in control rats. Thus, reducing of vitamins supply resulted in an increase of urine corticosterone in stressed rats, that characterized the intensity of general adaptation syndrome. This fact shows the importance of optimal sufficiency with vitamins in nonspecific (general) resistance to stress.

Keywords:vitamin deficiency, stress, electrocutaneous irritation, corticosterone, rats

Вопр. питания. - 2014. - Т. 83 , № 5. - С. 20-25.

Сопротивляемость организма к самым разнообразным повреждающим воздействиям в значительной степени определяется его обеспеченностью макро- и микронутриентами. Не вызывает сомнений участие в процессах регуляции и адаптации витаминов как естественных метаболитов, способных усиливать функции защитных систем организма при стрессе [13, 15]. Так, уровень стресс-биомаркера и стресс-медиатора кортикостерона в плазме крови крыс при дефиците витамина А увеличивался на 38% [16]. Как при изолированном дефиците витаминов С, А, Е, В1, В6, так и при сочетанном недостатке в рационе всех витаминов повреждающее действие на систему антиоксидантной защиты организма носит более выраженный характер по сравнению с ответом на стресс у животных, обеспеченных витаминами [11]. Диетическая коррекция витаминного статуса способствует восстановлению адаптационного потенциала организма - неспецифической (общей) способности сопротивляться неблагоприятным факторам различной природы [17]. Развитие стресса в свою очередь приводит к ухудшению витаминного статуса организма (витамины Е, А, С) [11]. Например, истощающая физическая нагрузка в ходе интенсивных тренировок и спортивных соревнований может усиливать окислительный метаболизм, сопровождающийся в организме окислительным стрессом и повышенным расходом витаминовантиоксидантов [3]. К сожалению, в современных условиях среди населения России достаточно часто встречается одновременная недостаточность сразу нескольких витаминов [8]. Такого рода поливитаминная необеспеченность может быть промоделирована в экспериментах in vivo c использованием лабораторных животных (растущих крыс) [6].

Целью исследования была оценка влияния недостаточной витаминной обеспеченности на некоторые показатели протекания общего адаптационного синдрома в условиях стресса, моделируемого воздействием электрическим током.

Материал и методы

Исследования выполнены на растущих крысахсамцах линии Вистар (n=21) с исходной массой тела 53,5±0,9 г (47,0-60,5 г), полученных из питомника НЦБМТ РАМН "Столбовая". Содержание лабораторных животных осуществляли в соответствии с Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых в экспериментах и других научных целях (Совет Европы, Страсбург, 2004 г.).

На протяжении всего эксперимента крысы содержались индивидуально в клетках из прозрачного полимерного материала (высокотемпературного полисульфона) при приглушенном естественном освещении (средняя продолжительность светового дня составила 12,1 ч), относительной влажности воздуха 40-60%, температуре 23±2 °С. Животные получали корм ad libitum и имели постоянный доступ к воде. Животные были рандомизированы по массе тела на 2 группы: контрольную (n=10) и опытную (n=11). Продолжительность эксперимента составила 22 сут.

В течение первых 3 сут все животные получали полноценный полусинтетический рацион [4], содержащий 20% казеина по ГОСТ 53667-2009 (содержание белка 82-84%), 64% кукурузного крахмала, 9% жира (смесь подсолнечного масла и лярда 1:1), 3,5% стандартной солевой смеси, 2% микрокристаллической целлюлозы, 1% сухой витаминной смеси, 0,30% L-цистеина, 0,25% холина битартрата.

В течение последующих 18 сут крысы контрольной группы продолжали получать полноценный полусинтетический рацион, обеспечивающий поступление с рационом витаминов в адекватном количестве. Полигиповитаминоз у крыс опытной группы вызывали уменьшением в корме количества витаминной смеси в 5 раз и полным исключением из нее витамина Е [6]. Поступление витамина Е крысам опытной группы обеспечивалось за счет естественного содержания токоферолов в подсолнечном масле и составило 2,2 МЕ на 100 г рациона, т.е. 32,8% от содержания этого витамина в рационе контрольной группы [9]. Аналитически определенное поступление витаминов В1 и В2 с витаминдефицитным рационом (за счет витаминной смеси и казеина) составило 24% от их потребления крысами контрольной группы. Контроль массы тела животных проводили 2 раза в неделю.

На 21-й день, за сутки до завершения эксперимента, крыс подвергали стрессорному воздействию, используя установку ("PanLab", Испания), представляющую собой большое освещенное белое отделение и маленькое черное отделение, разделенные опускными моторизированными воротами. Решетчатый пол малого темного отделения электрифицирован. Крысу помещали в светлый отсек камеры спиной к темному отсеку. Как только крыса переходила в темный отсек камеры, она получала электрокожное раздражение лап (сила тока 0,4 мА в течение 8 с).

Животных, подвергнутых стрессу, помещали на 16 ч в метаболические клетки для сбора мочи.

По окончании сбора мочу хранили при -20 °С.

Предварительно анестезированных эфиром крыс выводили из эксперимента путем декапитации.

Собранную с гепарином после декапитации животного кровь центрифугировали в течение 15 мин при 500 g, отбирали плазму и хранили при -20 °С.

Содержание витаминов А (ретинол и пальмитат ретинола) и Е (токоферолы) в плазме крови и в печени, а также в подсолнечном масле определяли методом ВЭЖХ, витаминов В1 и В2 в печени, моче и казеине - флуориметрически, 4-пиридоксиловой кислоты в моче - флуориметрически, как описано ранее [2, 5, 10, 14].

Интенсивность процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали по содержанию в сыворотке крови малонового диальдегида (МДА) - вторичного продукта ПОЛ [1].

Содержание в моче кортикостерона определяли методом ВЭЖХ согласно [22] c некоторыми модификациями. К 0,75 мл мочи добавляли 0,1 мл раствора внутреннего стандарта (дексаметазон) с концентрацией 10 мкг/мл, затем 5,0 мл этилового спирта. Пробу встряхивали в течение 30 мин при комнатной температуре, фильтровали через шприцевой фильтр с диаметром пор 0,45 мкм, затем упаривали на роторном испарителе. Анализируемый образец растворяли в 0,5 мл 50% этилового спирта и вводили на колонку с помощью петли объемом 0,1 мл. Хроматографический анализ проводили на колонке "Нуклеосил С18" (250×5 мм, 5 мкм) в условиях линейного градиента концентрации ацетонитрила (в воде) 20-60% в течение 45 мин при скорости элюирования 0,75 мл/мин.

В качестве детектора использовали спектрофотометрический проточный детектор "UV/VIS-151" ("GILSON", США) при длине волны 254 нм.

Концентрацию окисленной и неокисленной формы 8-гидрокси-2’-дезоксигуанозина в моче определяли с помощью обращеннофазовой ВЭЖХ [7, 18] на колонке "Supersphere 100 RP18" (125×2 мм, 4 мкм) с предколонкой "Supersphere 100 RP18" (10×2 мм) ("Merck", Германия), уравновешенной 10 мМ ацетат-аммонийным буфером, рН 4,3, в градиенте концентрации метанола 1-80%.

В качестве детектора использовали трехуровневый квадрупольный масс-спектрометр "API 3000" ("PE Biosystems", Германия), на котором определяли содержание иона с M/Z=168. Подготовку пробы проводили, как указано в работе [12].

Экспериментальные данные обрабатывали с помощью статистических пакетов Statistica 6.0 и SPSS Statistics для Windows (версия 20.0). Для выявления статистической значимости различий непрерывных величин использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни и непараметрический критерий Краскела-Уоллиса для независимых переменных. Различия между анализируемыми показателями считали достоверными при уровне значимости р≤0,05.

Результаты и обсуждение

Среднесуточное потребление корма крысами, получавшими витаминдефицитный рацион, было достоверно ниже (р=0,002) и составило 85,8% от соответствующего показателя для животных контрольной группы (табл. 1). Нахождение на витаминдефицитном рационе достоверно замедлило рост крыс на 10-е сутки (р=0,036) и через 21 день привело к снижению массы тела (р=0,006) и абсолютной массы печени (р=0,010) примерно на 19%, прироста массы тела - на 26,8% (р=0,005) по сравнению с показателями животных контрольной группы (см. табл. 1) и не отражалось на относительной массе печени. Вследствие худшей поедаемости витаминдефицитного рациона по сравнению с рационом с нормальным содержанием витаминов различия их эффективности, выражаемой в граммах прироста массы тела на 1 г корма, были недостоверны. Внешние признаки развития недостаточности витаминов (выпадение шерсти, алопеция и дерматит) не проявлялись.

Снижение содержания витаминов в рационе приводило к развитию выраженного полигиповитаминоза [6], о чем свидетельствует достоверное уменьшение концентрации витаминов в печени и плазме крови (табл. 2), а также экскреции с мочой рибофлавина и метаболита витамина В6 - 4-пиридоксиловой кислоты (табл. 3).

8-гидрокси-2’-дезоксигуанозин - это модифицированное нуклеозидное основание, представляющее побочный продукт повреждения ДНК, экскретируемый с мочой при репарации ДНК. Соотношение его окисленной и неокисленной форм является маркером окислительного повреждения ДНК и оксидативного стресса. Обнаруженное в нашем исследовании отсутствие сколько-нибудь значимых различий этого показателя у животных сравниваемых групп (см. табл. 3) может свидетельствовать в пользу предположения о том, что снижение обеспеченности животных опытной группы витаминами-антиоксидантами существенно не усиливало окислительное повреждение ДНК.

Выяснение вопроса о том, влияет ли само по себе электрокожное раздражение на окислительное повреждение ДНК должно стать предметом дальнейшего исследования. В данном эксперименте показатели ПОЛ сыворотки крови также не имели достоверных различий для сравниваемых групп.

Однако о положительном влиянии адекватной витаминной обеспеченности на адаптационную устойчивость животных к стрессу, моделируемому электрокожным раздражением, свидетельствует достоверное повышение в 2,5 раза экскреции кортикостерона с мочой животных опытной группы с полигиповитаминозом (см. табл. 3). В пользу этого предположения свидетельствуют данные о том, что при глубоком дефиците витамина А уровень свободного кортикостерона в плазме крови крыс увеличивался на 38% [16], 20-кратное обогащение диеты витамином Е само по себе вызывало достоверное снижение уровня кортикостерона в сыворотке крови у мышей [21], а у подвергнутых воздействию стресса крыс дополнительный прием витамина Е снижал концентрацию этого гормона в сыворотке крови [19], а также предотвращал вызванное гипероксией увеличение его секреции [20].

Таким образом, резюмируя результаты исследования, отметим, что адекватная витаминная обеспеченность ограничивала характерное для общего адаптационного синдрома увеличение в крови крыс важнейшего для этих животных кортикостероидного гормона - стресс-биомаркера и стрессмедиатора - кортикостерона. Это свидетельствует о снижении интенсивности протекания общего адаптационного синдрома, вызванного стрессом, моделируемым воздействием электрического тока.

Полученный результат подтверждает важную роль оптимальной обеспеченности организма витаминами в неспецифической (общей) резистентности к стрессорным воздействиям и обосновывает необходимость коррекции витаминного статуса, в том числе путем включения витаминов в состав специализированных продуктов адаптогенного действия.

Литература

1. Андреева Л.И., Кожемякин Л.А., Кишкун А.А. Модификация метода определения перекисей липидов в тесте с тиобарбитуровой кислотой // Лаб. дело. - 1988. - № 11. - С. 41-43.

2. Бекетова Н.А., Вржесинская О.А., Коденцова В.М. и др. Сравнение методов определения 4-пиридоксиловой кислоты в моче //Вопр. питания. - 1992. - № 4. - С. 67-69.

3. Богдан А.С., Еншина А.Н., Ивко Н.А. Подходы к разработке дифференцированных норм потребления витаминов спортсменами // Вопр. питания. - 2007. - Т. 76, № 4. - С. 49-53.

4. Вржесинская О.А., Бекетова Н.А., Коденцова В.М. и др. Влияние обогащения витаминдефицитного рациона крыс полиненасыщенными жирными кислотами семейства ω-3 на биомаркеры витаминного и антиоксидантного статуса // Вопр. питания. - 2013. - Т. 82, № 1. - С. 45-52.

5. Вржесинская О.А., Коденцова В.М., Спиричев В.Б и др. Оценка рибофлавинового статуса организма с помощью различных биохимических методов // Вопр. питания. - 1994. - Т. 63, № 6. - С. 9-12.

6. Вржесинская О.А., Коденцова В.М., Бекетова Н.А. и др. Экспериментальная модель алиментарного полигиповитаминоза разной степени глубины у крыс // Вопр. питания. - 2012. - Т. 81, № 2. - С. 51-56.

7. Жанатаев А.К., Дурнев А.Д., Середенин С.Б. Перспективы определения 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина в качестве биомаркера окислительного стресса в эксперименте и клинике // Вестн. РАМН. - 2002. - № 2. - С. 45-49.

8. Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Спиричев В.Б. Изменение обеспеченности витаминами взрослого населения Российской Федерации за период 1987-2009 гг. (к 40-летию лаборатории витаминов и минеральных веществ НИИ питания РАМН) // Вопр. питания. - 2010. - Т. 79, № 3. - С. 68-72.

9. Коденцова В.М., Бекетова Н.А., Вржесинская О.А. Витаминный состав экспериментальных рационов крыс // Вопр. питания. - 2012. - Т. 81, № 4. - С. 65-70.

10. Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Спиричев В.Б. Об использовании величин экскреции витаминов и их метаболитов в качестве показателей обеспеченности витаминами В2, В6 и РР // Вопр. мед. химии. - 1992. - № 1. - С. 22-24.

11. Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Мазо В.К. Витамины и окислительный стресс // Вопр. питания. - 2013. - Т. 82, № 3. - С. 11-18.

12. Распопов Р.В., Верников В.М., Шумакова А.А. и др. Токсикологогигиеническая характеристика наночастиц диоксида титана, вводимых в виде дисперсии в желудочно-кишечный тракт крыс. Сообщение 1. Интегральные, биохимические и гематологические показатели, степень всасывания макромолекул в тонкой кишке, повреждение ДНК// Вопр. питания. - 2010. - Т. 79, № 4. - С. 21-30.

13. Тутельян В.А., Гаппаров М.Г. Стресс и питание человека // Руководство по реабилитации лиц, подвергшихся стрессовым нагрузкам / Под ред. В.И. Покровского. - М.: Медицина, 2004. - С. 81-85.

14. Якушина Л.М., Бекетова Н.А., Бендер Е.Д. и др. Использование методов ВЭЖХ для определения витаминов в биологических жидкостях и пищевых продуктах // Вопр. питания. - 1993. - № 1. - С. 43-48.

15. Яременко К.В. Оптимальное состояние организма и адаптация. - СПб.: Элби-СПб, 2007. - 130 с.

16. Bonhomme D., Minni A. M., Alfos S. et al. Vitamin A status regulates glucocorticoid availability in Wistar rats: consequences on cognitive functions and hippocampal neurogenesis? // Front. Behav. Neurosci. - 2014. - Vol. 8. - Р. 20.

17. Da Costa L.A., Badawi A., El-Sohemy A. Nutrigenetics and modulation of oxidative stress // Ann. Nutr. Metab. - 2012. - Vol. 60, suppl. 3. - P. 27-36.

18. De Martinis B.S., Bianchi M.L.P. Methodology for urinary 8-hydroxy-2’deoxyguanosine analysis by HPLC with electrochemical detection // Pharmacol. Res. - 2002. - Vol. 46, N 2. - P. 129-131.

19. Ibrahim A.A.I, Kamisah Y., Nafeeza M.I., Nur Azlina M.F. The effects of palm vitamin E on stress hormone levels and gastric lesions in stressinduced rats // Arch. Med. Sci. - 2012. - Vol. 8, N 1. - Р. 22-29.

20. Kobayashi N., Machida T., Takahashi T. et al. Elevation by oxidative stress and aging of hypothalamic-pituitary-adrenal activity in rats and its prevention by vitamin E // J. Clin. Biochem. Nutr. - 2009. - Vol. 45, N 2. - Р. 207-213.

21. Lim T.S, Putt N., Safranski D. et al. Effect of vitamin E on cellmediated immune responses and serum corticosterone in young and maturing mice // Immunology. - 1981. - Vol. 44, N 2. - Р. 289-295.

22. Quillfeld Р., Poisbleau M. Measuring corticosterone in seabird egg yolk and the presence of high yolk gestagen concentrations // Gen. Comp. Endocrinol. - 2011. - Vol. 173. - P. 11-14.