Isomeric specific analysis of hydroxyeicosatetraenoic acid in blood samples from obese patients with non-alcoholic and alcoholic steatohepatitis

Abstract

The aim of the study was to perform isomeric analysis of hydroxyeicosatetraenoic acid (HETE) in blood samples from obese patients with non-alcoholic (NASH) and alcoholic (ASH) steatohepatitis. Sixty nine obese patients with liver steatosis according to abdominal US data and chronic ALT elevation were assign into two groups according to the evaluation of alcohol consumption by GAGE and AUDIT questionnaires: NASH – 39 patients and ASH – 30 patients. The identification and quantification of 5(S)-hydroxyeicosatetraenoic acid (5-HETE), 15-HETE and also non-enzymatic oxidation product 11-HETE in blood plasma were carried out by HPLC-MS-TOF with using 2-hydroxyoctanoic acid as internal standard. The position of hydroxyl group in HETE was elucidated by HPLC-MS/MS. The MS/MS transitions were for 15-HETE m/z 319 → m/z 219; for 11-HETE m/z 319 → m/z 167; for 5-HETE m/z 319 → m/z 115. Patients’ body composition was evaluated by bioelectrical impedance, resting energy expenditures (REE) were assessed by indirect calorimetry and nutrition pattern was examined by food frequency questionnaire. Mean age, BMI and ALT serum level were similar in patients from ASH and NASH groups. Blood plasma 8+12-HETE concentration was also similar in both groups of patients, but concentration of 15-HETE (21,6Ѓ}20,2 vs 11,9Ѓ}13,7 μg/ml, р=0,02) and 11-HETE (20,8Ѓ}21,3 vs 11,2Ѓ}12,9 μg/ml, р=0,03) was significantly higher in NASH patients. ASH patients demonstrated higher lean body mass (68,1Ѓ}10,6 vs 57,9Ѓ}9,8 kg, p<0,001) and muscle mass (39,3Ѓ}6,1 vs 33,2Ѓ}6,8 kg, p<0,04) and higher rate of protein oxidation (98,5Ѓ}31 vs 76,2Ѓ}21,1 g/day, р=0,02) recalculated from REE. There were no differences found in blood lipids content as well as in consumption of total dietary fat, however, there was a trend to difference in saturated/unsaturated fatty acids ratio between groups (2,3Ѓ}0,2 in NASH and 1,4Ѓ}0,3 in ASH patients). In conclusion, the rate of production of eicosatetraenoic acid metabolites by lipoxygenase pathway is different in NASH and ASH overweight patients.

It means that possibly different mechanisms are responsible for formation of potentially toxic fatty acids metabolites in these two types of patients. It seems likely that differences in fatty acids consumption pattern are related to this metabolic pathway.

Keywords:non-alcoholic fatty liver disease, non-alcoholic steatohepatitis, alcoholic steatohepatitis, obesity, arachidonic acid, 5(S)-hydroxyeicosatetraenoic acid

Вопр. питания. - 2014. - Т. 83 , № 5. - С. 12-19.

В настоящее время большое значение придается нутриметаболомным исследованиям, в частности нутрилипидомным [1], в контексте которых изучают возможную связь незаменимых для человека жиров и их метаболитов с патогенезом целого ряда широко распространенных заболеваний, которые традиционно относят к заболеваниям, связанным с нарушением в жировом обмене. Среди них особое место занимает стеатогепатит. В последние 30 лет в экономически развитых и развивающихся странах наблюдается тенденция увеличения числа больных стеатогепатитом, при этом заболеваемость стеатогепатитом алкогольной природы остается стабильной на протяжении многих лет, так как она обусловлена уровнем потребления алкоголя в популяции. В связи с этим основной прирост числа новых случаев заболевания приходится на неалкогольный стеатогепатит (НАСГ) [2]. Полагают, что к 2030 г. цирроз печени в исходе НАСГ будет основным показанием к трансплантации печени в США и других экономически развитых странах, что делает данное заболевание важной социальной проблемой [10].

Эти изменения в эпидемиологических показателях связывают в первую очередь с широким распространением ожирения в развитых, а также в последние годы в развивающихся странах, так как при ожирении триглицериды (ТГ) накапливают- ся в гепатоцитах, вызывая стеатоз печени. Однако у значительного числа больных ожирением, у которых выявляется стеатоз печени, стеатогепатит не развивается. Механизмы развития НАСГ у таких пациентов остаются до конца неясными, что делает диагностику, лечение и прогнозирование исходов этого заболевания проблематичным. Термин "неалкогольный стеатогепатит" был предложен J. Ludwig в 1980 г., когда он впервые описал морфологическую картину поражения печени, не отличимую от таковой при алкогольном стеатогепатите (АСГ) у женщины, не употреблявшей алкоголь [4]. В связи с этим дифференциальная диагностика основывается на исключении употребления алкоголя лицами с характерной гистологической картиной в ткани печени или изменениями в активности аминотрансфераз в сыворотке крови и исключении других причин гепатита. Этиология НАСГ неизвестна, полагают, что в основе лежат нарушения обмена веществ, связанные с ожирением, характерной для него инсулинорезистентностью и нарушением метаболизма жирных кислот (ЖК) в печени, приводящим к стеатозу, а затем и повреждению гепатоцитов эндотоксинами или токсическими метаболитами ЖК [5]. В случае же алкогольного гепатита гепатоциты повреждаются в результате токсического действия метаболитов алкоголя, в частности ацетальдегида, однако, учитывая высокую степень стеатоза печени при алкогольном гепатите, вариант ее повреждения метаболитами ЖК также не исключен.

В связи с этим целью исследования было изучение метаболизма арахидоновой кислоты у пациентов с АСГ и НАСГ на фоне ожирения.

Материал и методы

В исследование были включены 69 пациентов (28 женщин и 41 мужчина) с ожирением (ИМТ 30 кг/м2) и хроническим гепатитом (в анамнезе увеличение активности АЛТ на протяжении как минимум 6 мес), находившихся в отделении гастроэнтерологии и гепатологии ФГБУ "НИИ питания" РАМН. Протокол исследования был одобрен этическим комитетом ФГБУ "НИИ питания" РАМН. Перед включением в исследование все пациенты подписали информированное согласие.

У 39 пациентов (26 женщин и 13 мужчин, средний возраст - 47,8±13,7 года), составлявших 1-ю группу, был установлен диагноз НАСГ на основании следующих критериев: хроническое увеличение активности АЛТ в сыворотке крови, признаки жирового гепатоза при УЗИ печени, отсутствие маркеров вирусных гепатитов в сыворотке крови (анти-HCV, HBsAg и анти-HAV класса IgM), отсутствие маркеров аутоиммунного поражения печени (антигладкомышечные и антимитохондриальные антитела в диагностическом титре не определялись), отсутствие в анамнезе приема потенциально гепатотоксичных лекарственных препаратов или биологически активных добавок (БАД) к пище, отсутствие употребления алкоголя в анамнезе (<8 баллов AUDIT; отрицательные ответы на все вопросы опросника CAGE). Во 2-ю группу вошли 30 пациентов (2 женщины и 28 мужчин, средний возраст - 45,1±10,4 года) со стеатогепатитом смешанного генеза (алкогольный + метаболический), у которых в отличие от пациентов 1-й группы имелись указания на хроническое употребление алкоголя в анамнезе и положительные значения тестов на употребление алкоголя (>8 баллов AUDIT; хотя бы 1 положительный ответ на вопросы опросника CAGE).

Оценку количества употребляемого алкоголя проводили несколькими способами:

- подробный сбор анамнеза, беседы с родственниками: потребление чистого этанола более 20 мл/нед у женщин и более 40 мл/нед у мужчин свидетельствовало о факте злоупотребления алкоголем;

- использование опросников на выявление факта злоупотребления алкоголем: AUDIT (The Alcohol Use Disorders Identification Test): >8 баллов - вероятное злоупотребление алкоголем; CAGE (Сut-Аnnoyed-Guilty-Eye): в случае хотя бы одного положительного ответа - вероятное злоупотребление алкоголем.

Для оценки функционального состояния печени у обследованных пациентов определяли следующие показатели с помощью биохимического анализатора "Konelab30i" ("Thermo scientific", Финляндия): активность АЛТ (норма 0-40 МЕ/л), АСТ (норма 0-35 МЕ/л), щелочной фосфатазы (норма 50-128 МЕ/л), гамма-глутамилтранспептидазы (ГГТП) (норма 0-40 МЕ/л), уровень общего билирубина (норма 0-20,0 мкмоль/л), прямого билирубина (норма 0-5,0 мкмоль/л).

Для оценки состояния углеводного обмена определяли уровень глюкозы крови натощак (норма 3,3-5,8 ммоль/л) с помощью биохимического анализатора "Konelab30i", инсулина (норма 2,0-25,0 мкЕд/мл) и С-пептида (норма 0,5-3,2 нг/мл) с использованием стандартных наборов ("DRGElisa", Германия).

Индекс инсулинорезистентности (ИИР) определяли расчетным методом по формуле (D.R. Matthews и соавт.):

Липидный обмен оценивали по содержанию в сыворотке крови общего холестерина (ОХС) (норма до 5,2 ммоль/л), холестерина (ХС) липо- протеинов высокой плотности (ЛПВП) (норма от 1,15 ммоль/л), ХС липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) (норма до 3,80 ммоль/л), ТГ (норма до 1,70 ммоль/л).

Для оценки состояния белкового обмена определяли в сыворотке крови содержание общего белка (норма 64-83 г/л), мочевой кислоты (норма 200-420 мкмоль/л). Определение всех показателей проводили на биохимическом анализаторе "Konelab30i".

Показатели общего анализа крови оценивали с помощью анализатора "Becman Coulter LH 750 Analyzer" ("Becman Coulter", США).

Определение уровня изомеров гидроксиарахидоновой кислоты проводили следующим образом.

Экстракция липидов из плазмы крови.

К каждому образцу плазмы (5 мл) предварительно добавляли 100 мкл раствора бутилгидрокситолуола (БГТ) с концентрацией 500 мкM в качестве антиоксиданта. Для экстракции липидов в пробирку объемом 20 мл добавляли 1 мл плазмы, 100 мкл водного раствора внутреннего стандарта (2-гидроксиоктановая кислота) с концентрацией 8 мкг/мл, 4 мл насыщенного водного раствора сульфата аммония, 5 мл н-гексана, 5 мл ацетона, встряхивали на вортексе в течение 5 мин. Аликвоту (5 мл) верхнего липидного слоя упаривали досуха в токе азота. К остатку добавляли 1 мл 1 н. раствора гидроксида натрия, проводили омыление в течение 1 ч при 20-22 оС. рН реакционной смеси доводили до 2-3 добавлением примерно 100 мкл 97% водного раствора муравьиной кислоты (А). Свободные ЖК экстрагировали 600 мкл н-гексана, гексановый экстракт упаривали в токе азота и перерастворяли в 100 мкл компонента В подвижной фазы (ацетонитрил-метанол 65:35).

ВЭЖХ-МС анализ. Идентификацию и количественный анализ изомерных гидроксиэйкозатетраеновых кислот (HETE) осуществляли с помощью метода ВЭЖХ-МС. В работе использовали систему ВЭЖХ "Agilent 1100" ("Agilent Technologies", США), оснащенную бинарным насосом, дегазатором и термостатируемым автосэмплером. В качестве детектора использовали времяпролетный массдетектор "Agilent 6210-TOF". Условия ВЭЖХ-разделения: колонка ProtecolC 18 4,6×250 мм, 5 мкм, подвижная фаза - 0,1% водный раствор муравьиной кислоты (А) и смесь метанол-ацетонитрил (35:65) (B). Скорость подачи элюента - 0,8 мл/мин, режим градиента: 30-55% B - 10 мин; 55-75% B -

15 мин; 75-100% B - 5 мин; 100% B - 10 мин. Объем вводимой в инжектор пробы 10 мкл. Детектирование проводили в режиме ионизации электрораспылением и регистрации отрицательных ионов, поток газа-осушителя - 9 л/мин, температура газаосушителя - 325 °C, напряжение на фрагменторе - 175 В, на скиммере - 65 В, на капилляре - 3500 В.

Количественное определение содержания HETE осуществляли в режиме селективного ионного детектирования по соответствующим депротонированным молекулярным ионам изомеров НЕТЕ [(M-H) m/z 319] и внутреннего стандарта (m/z 159).

Корреляцию порядка выхода изомеров НЕТЕ при ВЭЖХ с положением гидроксильных групп в молекулах изомеров НЕТЕ устанавливали с помощью ВЭЖХ-МС/МС по характерным переходам: 5-HETE (m/z 319 m/z 115), 8-HETE (m/z 319 m/z 163), 11-HETE (m/z 319 m/z 167), 12-HETE (m/z 319 m/z 179) и 15-HETE (m/z 319 → m/z 219). Порядок выхода изомеров НЕТЕ при ВЭЖХ представлен на рисунке.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием программы Statistica for Windows 8.0 ("StatSoft, Inc.", США).

Результаты

По данным исследования антропометрических показателей пациентов с НАСГ и АСГ оказалось, что масса тела пациентов, ИМТ и количество жировой массы достоверно не различались между группами. Количество общей жидкости оказалось достоверно больше у пациентов с НАСГ.

В то же время количество мышечной и тощей массы было достоверно больше у пациентов с АСГ соответственно на 71 и 64% (табл. 1). Причина таких различий лежит, очевидно, не в разнице физической активности, а, скорее, в различии в питании между указанными группами пациентов. При исследовании уровня основного обмена, а также скорости окисления жиров (СОЖ) и углеводов (СОУ) достоверных различий между обследуемыми группами пациентов выявлено не было.

Однако скорость окисления белка (СОБ) была достоверно выше у пациентов с АСГ в среднем на 20 г/сут (табл. 2), что, по-видимому, связано с увеличенным потреблением белка по сравнению с пациентами с НАСГ. При анализе фактического потребления пищи пациентами обеих групп различий по потреблению общего жира, насыщенных ЖК (НЖК) и полиненасыщенных ЖК (ПНЖК) не выявлено (табл. 3). Однако соотношение потребления НЖК и ПНЖК между группами было близко к достоверным различиям (2,3±0,2 при НАСГ против 1,4±0,3 при АСГ, р=0,058).

При изучении содержания в крови пациентов метаболитов арахидоновой кислоты оказалось, что содержание 15-НЕТЕ и 11-НЕТЕ достоверно в 2 раза выше у пациентов с НАСГ (табл. 4). При этом содержание 8+12-НЕТЕ и эпоксиэйкозатриеновой кислоты (ЕЕТ) достоверно между собой не различались. Также не достоверными были различия в содержании 5-НЕТЕ между группами (см. табл. 4).

Обсуждение

В нашем исследовании впервые были показаны различия в метаболизме арахидоновой кислоты у больных с НАСГ и АСГ. Это чрезвычайно интересно, поскольку гистологически, как было показано ранее, изменения печени при этих заболеваниях идентичны [4, 6]. Следовательно, можно сказать, что нами впервые установлены важные и, скорее всего, патогенетические различия между НАСГ и АСГ. В пользу этого говорит тот факт, что, хотя накопление жира в гепатоцитах наблюдается при обоих заболеваниях, имеет место разный механизм патологического процесса. В случае с НАСГ накопление жира связано с тем, что основной путь окисления арахидоновой кислоты (β-окисление в митохондриях) нарушается в результате изменений метаболизма углеводов и жиров, обусловленных инсулинорезистентностью. В связи с этим скорость β-окисления арахидоновой кислоты уменьшается и усиливается метаболизм арахидоновой кислоты, осуществляющийся посредством альтернативных путей с участием липооксигеназы и неэнзиматическим путем [3]. В пользу этого говорит обнаруженное нами у пациентов с НАСГ почти двукратное увеличение гидроксиарахидоновой кислоты с расположением гидроксильной группы в 15-м и 11-м положениях. Преимущественно такие метаболиты образуются при окислении арахидоновой кислоты с помощью липооксигеназы. Эти метаболиты являются более токсичными по сравнению с гидроокисями арахидоновой кислоты с расположением гидроксильных групп в 5-, 8+12-м положениях. Более того, именно 15- и 11-НЕТЕ являются предшественниками лейкотриенов и других биологически активных веществ, стимулирующих воспаление и способствующих апоптозу гепатоцитов, вызванному цитотоксическими лимфоцитами [5], таким образом, они непосредственно участвуют в патогенезе НАСГ. Напротив, при АСГ β-окисление в значительной мере не страдает, в связи с этим содержание 15- и 11-НЕТЕ у этих больных в среднем в 2 раза ниже, чем у пациентов с НАСГ (см. табл. 4). При этом повреждение гепатоцитов у данной категории пациентов происходит в основном за счет трансформации клеточных мембран продуктом окисления алкоголя - ацетальдегидом, которая приводит к тому, что лимфоциты начинают распознавать эти изменения мембраны как чужеродные и повреждают клетки, что сопровождается их гибелью [7]. Таким образом, при изучении гистологических срезов печени больных с НАСГ и АСГ морфолог видит одни и те же гистологические изменения в ткани печени, однако их причины и последовательность событий, приводящих к ним, у этих больных совершенно разные.

Имеют ли установленные нами закономерности какое-то значение не только для понимания патогенеза НАСГ и АСГ, но и для лечения? Что касается АСГ, то единственным эффективным способом лечения является абстиненция, поскольку при ней исчезает избыток ацетальдегида в печени, гепатоциты перестают повреждаться, процессинг жиров восстанавливается и, вслед за воспалением в печени, уменьшается и стеатоз. Что касается больных НАСГ, то здесь возможно применение в лечении заболевания подходов на основе установленных нами закономерностей. Анализ фактического питания пациентов показал, что в отличие от больных НАСГ больные АСГ получают больше животных жиров, на что указывает и большее потребление ими белка, достоверно большее количество у них тощей массы и большая скорость окисления белка в основном обмене. При этом общее потребление жира между этими двумя группами больных не различалось. Нам также не удалось выявить различия в потреблении НЖК и ПНЖК (см. табл. 3), однако при подсчете соотношения НЖК/ПНЖК они оказались существенными. Следует отметить, что процесс окисления ЖК в печени зависит от двух условий - активности фермента и количества субстрата для окисления.

В связи с этим может быть выдвинута гипотеза о том, что обнаруженный феномен увеличения содержания в крови 11- и 15-НЕТЕ у больных НАСГ может быть обусловлен не только преимущественно альтернативным путем окисления арахидоновой кислоты, но также определенным соотношением субстратов - различных ЖК, поступающих с пищей.

В пользу такой гипотезы указывают данные, согласно которым гипокалорийная диета с уменьшенным содержания жиров дает худшие результаты и реже приводит к ремиссии НАСГ, нежели изокалорий- ная диета с адекватным потреблением жира [9].

Учитывая полученные нами данные, результаты этих исследований можно объяснить тем, что пул ЖК, захваченных печенью из кровотока, состоит из двух компонентов: ЖК, образующихся в результате липолиза периферической жировой ткани, который усилен при НАСГ вследствие инсулинорезистентности, и ЖК, которые попали в кровоток из кишечника, фактически из принятой пациентом жирной пищи. Безусловно, по химическому составу оба эти компонента различны, так как при периферическом липолизе образуются в основном ТГ, включая среднецепочечные ЖК. В то же время пул ЖК, поступающих с пищей, может быть различен и включать в себя как длинноцепочечные ЖК, так и мононенасыщенные ЖК (МНЖК) и ПНЖК. Исходя из этого весьма вероятныо, что соотношение различных ЖК в крови влияет на скорость и темпы метаболизма их в печени.

Таким образом, при гипокалорийной диете со сниженным содержанием жиров в крови доминируют ЖК, практически полностью поступающие за счет липолиза периферической жировой ткани, а в случае с изокалорийной диетой - имеется смесь разных ЖК. В последнем случае, вероятнее всего, гораздо меньше задействован липооксигеназный путь, что приводит к уменьшению образования 11- и 15-НЕТЕ, снижению общей липотоксичности этих продуктов и уменьшению образования провоспалительных веществ из арахидоновой кислоты. Результатом этого является довольно быстрое уменьшение воспаления печени в виде достаточно быстрой нормализации уровня АЛТ, что и было показано в цитируемых исследованиях.

Напротив, при гипокалорийной диете в течение месяца содержание АЛТ не только не снижалось, но и у части пациентов оказалось выше исходного [8]. Таким образом, для подтверждения этой гипотезы требуется проспективное исследование содержания метаболитов арахидоновой кислоты на фоне диеты, содержащей разное количество МНЖК и ПНЖК. При этом, учитывая накопленные данные, можно предположить, что эффект можно будет получить достаточно быстро - в течение 1-2 мес при условии соблюдения соответствующей диеты. Интересно, что в процессе изучения липидного спектра у пациентов с АСГ и НАСГ не обнаружено достоверного различия в уровнях ОХС, ТГ, ЛПВП, ЛПНП. Однако, если учесть, что установленные нами различия реализуются на стадии окисления ЖК (внутри митохондрий или комплекса Гольджи), то отсутствие изменений в указанных показателях липидного спектра не выглядит удивительным, так как транспортная система обеспечивает формирование липопротеидов, происходящее в другой области гепатоцита.

Это подтверждается отсутствием различий показателей в липидном спектре у больных с НАСГ и без такового (см. табл. 3).

Таким образом, нами впервые выявлены различия в метаболизме ЖК при НАСГ и АСГ, которые, несмотря на то что приводят к аналогичным гистологическим изменениям в печени, представляют собой совершенно разные с биохимической точки зрения процессы. Обнаруженные нами закономерности могут стать основой для разработки совершенно нового подхода к диетотерапии НАЖБ и, в частности, НАСГ.

Литература

1. Васильев А.В, Шаранова Н.Э, Кулакова С.Н. Нутриметаболомика - новый этап развития биохимии питания. Роль нутрилипидомных исследований // Вопр. питания. - 2014. - Т. 83, № 1. - С. 4-11.

2. Argo C.K., Caldwell S.H. Epidemiology and natural history of nonalcoholic steatohepatitis // Clin. Liver Dis. - 2009. - Vol. 13, N 4. - P. 511-531.

3. Bechmann L.P., Hannivoort R.A., Gerken G. et al. The interaction of hepatic lipid and glucose metabolism in liver diseases // J. Hepatol. - 2012. - Vol. 56, N 4. - P. 952-964.

4. Ludwig J., Viggiano T.R., McGill D.B., Oh B.J. Nonalcoholic steatohepatitis: Mayo Clinic experiences with a hitherto unnamed disease // Mayo Clin. Proc. - 1980. - Vol. 55, N 7. - P. 434-438.

5. Neuschwander-Tetri B.A. Hepatic lipotoxicity and the pathogenesis of nonalcoholic steatohepatitis: the central role of nontriglyceride fatty acid metabolites // Hepatology. - 2010. - Vol. 52, N 2. - P. 774-788.

6. Pinto H.C., Baptista A., Camilo M.E. et al. Nonalcoholic steatohepatitis. Clinicopathological comparison with alcoholic hepatitis in ambulatory and hospitalized patients // Dig. Dis. Sci. - 1996. - Vol. 41, N 1. - P. 172-179.

7. Ribeiro P.S., Cortez-Pinto H., Sola S. et al. Hepatocyte apoptosis, expression of death receptors, and activation of NF-kappaB in the liver of nonalcoholic and alcoholic steatohepatitis patients // Am. J. Gastroenterol. - 2004. - Vol. 99, N 9. - P. 1708-1717.

8. Selezneva K., Kirillova O., Vorozhko I. et al. Short-term effect of low-calorie diet versus isocalorie diet on to blood aminotransferases level and lipids profile in patients with non-alcoholic steatohepatitis // J. Hepatol. - 2014. - Vol. 60, N 1. - P. 353.

9. Topilskaya N., Isakov V., Kaganov B. Diet therapy of non-alcoholic fatty liver disease // J. Hepatol. - 2012. - Vol. 56. N 2. - P. 522.

10. Vernon G., Baranova A., Younossi Z.M. Systematic review: the epidemiology and natural history of non-alcoholic fatty liver disease and non-alcoholic steatohepatitis in adults // Aliment. Pharmacol. Ther. - 2011 - Vol. 34. N 3. - P. 274-285.