Toxicological assessment of nanostructured silica. II. Enzymatic, biochemical indices, state of antioxidative defence

Abstract

Nanostructured silica (SiO2) ≪Aerosil≫ with the size of the primary nanoparticles (NPs) of 5–30 nm, in the form of ultrasound treated water suspension was administered to rats of 80Ѓ}4 g initial body weight for the first 30 days by intragastric gavage and then for 62 days with diets consumed in doses of 0,1; 1,0; 10 and 100 mg/kg body weight per day. The control group received vehicle of nanomaterial (NM) – deionized water. There were measured in liver of animals the content of total cytochromes P450 and b5 in the microsomal fraction of liver, activity (Vmax) of microsomal monooxygenases with the mixed function of isoforms CYP1A1, 1A2 and 2B1 on their specific substrates, the activity of conjugating liver enzymes glutathione-S-transferase and UDP-glucuronosyltransferase in microsomal fraction and cytosol, the total and non sedimentable activity of lysosomal hydrolases (β-glucuronidase, β-galactozydase, arylsulphatase А, В). The content of PUFA’s diene conjugates and TBA-reactive substances in the blood plasma and the activity of antioxidative enzymes (glutathionperoxidase, superoxidedismutase, glutathionreductase, katalase) in erytrocytes were estimated. A set of standard biochemical parameters of blood serum was also examined (total protein, albumin, glucose, creatinine, urea, uric acid, activities of hepatic transaminases). The studies revealed changes of a number of molecular markers that could be interpreted as unfavorable. These include isoforms of CYP2B1 activity decrease at a dose HM 1–10 mg/kg of body weight, decrease in the serum content of total protein, albumin and glucose levels in a dose range of 0,1–10 mg/kg. These changes were absent at the maximum dose of NM, which did not allow to clearly establish the dose-response. The remaining studied figures resided in the normal range or experienced changes that could not be interpreted as toxic.

Keywords:silica, nanoparticles, rats, subacute toxicity, microsomes, CYP450, lysosomes, non sedementable activity, lipid peroxidation

Аморфный диоксид кремния (SiO2) с первичными частицами размером менее 100 нм, известный также под техническим наименованием "Аэросил" (ГОСТ 14922-77), используется в настоящее время в пищевой промышленности в качестве пищевой добавки, а также в составе биологически активных добавок к пище, ароматизаторов, технологических вспомогательных средств и большого числа лекарственных препаратов. Содержание этого НМ в указанных видах продукции в настоящее время не нормируется, несмотря на имеющиеся данные о его токсичности в системах in vitro [18, 26, 29, 35-37] и in vivo [5, 6, 28, 30, 31]. В нашей предыдущей работе [13] было охарактеризовано влияние перорального введения в течение 92 сут наноструктурного SiO2 на интегральные показатели организма, проницаемость кишечного барьера, уровень тканевых тиолов, окислительное повреждение ДНК и когнитивную функцию у растущих крыс. При этом значительных эффектов, которые могли бы быть интерпретированы как вредные (токсические), не выявлено в дозе SiO2 до 100 мг/кг массы тела. Целью настоящей работы является дальнейшее исследование возможных изменений в организме этих животных на уровне молекулярных маркеров токсического действия [содержание, активность и межфракционное распределение ключевых микросомальных и лизосомальных ферментов, состояние процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), активность компонентов системы антиоксидантной защиты, биохимические показатели сыворотки крови].

Материал и методы

Использован коммерческий высокодисперсный аморфный SiO2, полученный методом газофазного гидролиза химически чистого тетрахлорсилана, под торговым наименованием "Орисил 300" по ТУ 24.1-31695418-002-2003 (ООО "Силика", Россия, Московская обл., г. Долгопрудный).

По данным изготовителя, продукт соответствовал ГОСТ 14922-77. Согласно представленным в предыдущей публикации [13] данным исследования образца методами трансмиссионной электронной микроскопии, атомно-силовой микроскопии, спектроакустики и динамического лазерного светорассеяния, образец представлял собой НМ, образованный непрочно агрегированными наночастицами (НЧ) размерами от 5 до 60 нм.

Эксперимент проведен на 75 крысах-самцах линии Вистар исходной массой 80±4 г, полученных из питомника РАМН "Столбовая". Дизайн и условия эксперимента были подробно изложены в предыдущей публикации [13]. Все животные были разделены на 5 групп равной численности, животные 1-й группы (контроль) получали носитель - деионизованную воду, а 2-5-й группы - SiO2 в дозах 0,1; 1,0; 10 и 100 мг на 1 кг массы тела ежедневно. В течение первых 30 сут обработанную ультразвуком суспензию НМ вводили внутрижелудочно через зонд, а затем добавляли к рациону. Общая продолжительность эксперимента ставила 92 сут.

Выведение животных из эксперимента осуществляли на 93-и сут опыта путем обескровливания из нижней полой вены под эфирной анестезией.

Кровь отбирали дробно на антикоагулянт (0,01% по массе трикалиевой соли ЭДТА) для проведения анализа показателей ПОЛ и активности антиоксидантных ферментов эритроцитов и в стерильную сухую пробирку для отделения сыворотки. Выделяли печень, разрезали на кусочки размером 0,5-1 см, троекратно промывали 0,1 М ТрисHCl буфером рН 7,4, охлажденным до 0-+2 оС, и далее гомогенизировали в том же буфере в соотношении 1:4 по массе. Гомогенат подвергали фракционированию методом дифференциального центрифугирования на препаративной ультрацентрифуге "L7-65" ("Beckman", США) с получением микросомальной и цитозольной фракций.

В микросомальной фракции определяли концентрацию цитохромов Р450 и b5 спектрофотометрически [27]. Содержание изоформ микросомальных монооксигеназ со смешанной функцией оценивали, используя специфические субстраты, по величине активности: этоксирезоруфин-деалкилазной (изоформа CYP1A1), 7-метоксирезоруфинО-деметилазной (CYP1A2) и 7-пентоксирезоруфинО-деалкилазной (CYP2B1) [15, 23].

Активность лизосомальных ферментов -глюкуронидазы, -галактозидазы, арилсульфатаз А и В исследовали согласно [4], в цельном гомогенате печени (общая активность) и во фракции цитозоля (неседиментируемая активность). Активность конъюгирующих ферментов глутатион-S-трансферазы и УДФ-глюкуронозилтрансферазы определяли суммарно в микросомах и цитозоле по методам [14, 21]. Все измерения ферментативных активностей проводили в условиях насыщения ферментов субстратами ([S] >>Km).

Биохимические показатели сыворотки крови [общий белок, альбумин, глюкоза, креатинин, мочевая кислота, мочевина, активность трансаминаз печени (аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы, (АСТ), а также суммарной щелочной фосфатазы (ЩФ)] определяли на биохимическом анализаторе ("Konelab", Финляндия) по стандартным методикам.

Исследования показателей системы антиоксидантной защиты проводили на биохимическом анализаторе "ФП-901" ("Labsystems OY", Финляндия). В эритроцитах определяли активность глутатионредуктазы на основе метода Tillotson и соавт. (1971) в адаптации, согласно [9], глутатионпероксидазы по методу Mille в модификации [10], каталазы согласно Oshino и соавт. в модификации [8], супероксиддисмутазы на основе метода Niashikimi и соавт. в модификации [8]. В плазме крови определяли содержание малонового диальдегида (МДА) по методу Mihara и соавт. [24] и диеновых конъюгатов ПНЖК спектрофотометрическим методом Placer в модификации [3].

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета SPSS 18.0 с помощью критерия Стьюдента, непараметрического рангового критерия Манна-Уитни и критерия ANOVA.

Различия признавали достоверными при уровне значимости р<0,05.

Результаты

Показатели системы детоксикации ксенобиотиков в печени

Как следует из данных, представленных в табл.1, показатели, характеризующие состояние системы детоксикации ксенобиотиков в печени крыс опытных групп, в ряде случаев достоверно отличались от значений для 1-й (контрольной) группы. Так, в 5-й группе, получавшей наибольшую дозу SiO2, отмечалось достоверное (p<0,05) повышение содержания общего хромопротеина цитохрома b5 и активности изоформы СУР1А1 соответственно на 17 и 32%. Однако величина и направленность этих изменений не свидетельствовали о наличии токсического эффекта. Активность изоформы СУР2В1, напротив, снижалась у животных, получавших SiO2, причем наиболее выраженным (на 46%) и достоверным (p<0,05) это снижение было в 3-й группе (доза 1 мг на 1 кг массы тела).

Вместе с тем при наибольшей дозе НМ подобный эффект, как видно из полученных данных, не наблюдался. Активность глутатион-S-трансферазы также менялась немонотонно с ростом дозы SiO2, достигая максимума во 2-й и 4-й группах (рост на 25 и 28% в сравнении с контролем, p<0,05). Подобные выявленным, немонотонные изменения показателей системы детоксикации ксенобиотиков под действием НМ, вводимых перорально, были известны ранее. Так, в работе [32] было обнаружено аналогичное изменение активности глутатион-S-трансферазы и изоформы СУР1А1 при средних (но не максимальных) дозах фуллеренола С60. Немонотонным было изменение активности глутатион-S-трансферазы и с ростом дозы немодифицированного фуллерена С60 [12].

Такой характер изменения изучаемых показателей ферментативной активности (зависящей как от общего содержания ферментного белка, так и от его функционального состояния) указывает на их зависимость от комплекса факторов, т.е. при различных вводимых дозах НМ эффект может реализоваться как на уровне экспрессии гена [16, 20], так и за счет посттрансляционных эффектов воздействия на конформацию белка и структуру биологических мембран [34]. Для выяснения этих механизмов необходимы дополнительные исследования с привлечением постгеномных и протеомных технологий.

Общая и неседиментируемая активность лизосомальных гидролаз

Данные табл. 2 свидетельствуют о том, что у крыс, получавших SiO2 в дозах 1 и 100 мг/кг, отмечалось небольшое по абсолютной величине (на 23 и 19%), но достоверное повышение активности общих лизосомальных арилсульфатаз А и В. Эти лизосомальные гидролазы ответственны за протекание в организме комплекса катаболических процессов, и при их недостаточности возможно развитие некоторых лизосомальных болезней накопления, проявляющихся, в частности, в отложении в тканях животных липофусцина [22]. В случае воздействия наноструктурного SiO2 направленность и абсолютная величина изменения активности арилсульфатаз при максимальной дозе НМ свидетельствовала, скорее, о развитии адаптивной реакции и не могла рассматриваться как признак токсического действия. Остальные показатели, представленные в табл. 2, достоверно не отличались у животных опытных групп от контроля. В частности, это относится к процентной доле неседиментируемых активностей лизосомальных ферментов, что указывает на отсутствие значимого влияния наноматериала на стабильность лизосомальных мембран. Таким образом, неблагоприятные изменения в общей и неседиментируемой активности лиосомальных гидролаз не отмечались при дозе наноструктурного SiO2 до 100 мг на 1 кг массы тела.

Показатели перекисного окисления липидов и системы антиоксидатной защиты

Результаты определения продуктов ПОЛ (диеновых конъюгатов ПНЖК и малонового диальдегида) в плазме крови, а также активности ферментов системы антиоксидантной защиты в эритроцитах приведены в табл. 3. Анализ этих показателей представляет особый интерес, поскольку, по данным ряда исследований, в системах in vitro токсический эффект НЧ SiO2 может реализоваться за счет усиления гетерофазной каталитической генерации реакционноспособных форм кислорода (оксидантов) [17, 25, 33]. Как следует из полученных данных, в условиях in vivo при пероральном введении этого НМ какого-либо усиления процессов ПОЛ не наблюдалось. Напротив, при дозах SiO2 0,1 и 10 мг/кг имело место небольшое по абсолютной величине (на 15 и 27%), но достоверное (p<0,05) снижение образования диеновых конъюгатов ПНЖК. Остальные изученные показатели, включая активность ферментов антиоксидантной защиты эритроцитов, в опытных группах животных оставались без изменений. Таким образом, пероральное введение наноструктурного SiO2 в дозе до 100 мг/кг массы тела, во всяком случае не приводит, судя по изученным показателям, к усилению ПОЛ и ослаблению антиоксидантной защиты.

Биохимические показатели сыворотки крови

Результаты определения биохимических показателей сыворотки крови крыс представлены в табл. 4. При оценке этих показателей и их возможной связи с предполагаемой токсичностью НМ следует учитывать не только величину и направленность их изменений, но и соотношение с величиной нормальных значений для животных данного вида, пола и возраста. Соответствующие данные, полученные из доступных источников литературы, а также из результатов собственных исследований на протяжении 2008-2012 гг. (внутрилабораторная норма) также приведены в табл. 4.

Как следует из представленных данных, активность АЛТ была достоверно повышена во 2-й группе по сравнению с контролем при минимальной дозе НМ. Однако среднее значение этого показателя находилось вблизи или даже ниже известных нижних значений его нормы и тем самым не свидетельствовало о значимом усилении деструктивных процессов в ткани печени. Содержание общего белка и альбумина во всех опытных группах было снижено незначительно по абсолютной величине (максимум на 10 и 9% соответственно) и приблизительно равномерно, не демонстрируя какой-либо зависимости от дозы НМ. Видно, что по некоторым данным литературы эти изменения незначительно выходят за пределы нижней границы нормы. Причина этих изменений, возможно, состоит в тормозящем действии НМ, обладающего высокой сорбционной способностью, на всасывание в кишке некоторых эссенциальных пищевых факторов, участвующих в синтезе белка. В то же время их биодоступность в неменьшей степени зависит и от состава рациона и поэтому возможные эффекты требуют дополнительного изучения при варьирующих уровнях определенных макро- и миконутриентов в диете.

Уровень мочевины в крови был достоверно повышен в сравнении с контролем у крыс 2-й группы (на 27%) и 5-й группы (на 11%), однако при этом он оставался вблизи нижней границы нормы и тем самым не свидетельствовал о развитии токсического эффекта.

У крыс 3-й группы при дозе НМ 1 мг/кг отмечалось достоверное (p<0,05) снижение уровня глюкозы на 16% по сравнению с контролем; при этом данный показатель выходил за пределы интервала нормальных значений. Однако при более высоких дозах НМ данный эффект не воспроизводился, т.е. зависимость "доза-ответ" отсутствовала.

Остальные изученные биохимические показатели у крыс опытных групп достоверно не отличались от контроля и находились в пределах изменений, характерных для здоровых животных.

Обсуждение

Для частиц наноразмерного SiO2 характерно наличие свойств цитотоксичности in vitro, проявляющихся в отношении ряда линий клеток животных и человека [18, 26, 29, 35-37]. Механизм этих эффектов, как и в случае других видов оксидных НЧ (диоксида титана, оксида алюминия и др.), крайне мало растворимых в биологических средах, является, скорее всего, неспецифическим и опосредуемым продукцией цитотоксических реакционноспособных форм кислорода на межфазных границах [33]. Вместе с тем с учетом низких величин биодоступности НЧ SiO2 (как и других нерастворимых оксидных НЧ) в желудочно-кишечном тракте остается неясным, могут ли такие эффекты проявляться in vivo. Данные ранее проведенных экспериментов по оценке острой и подострой токсичности НЧ SiO2 дали противоречивые результаты [2, 5, 6]. При этом по своим характеристикам примененные в этих работах НМ значительно различались между собой и не соответствовали наноструктурному SiO2 типа "Аэросил", используемому в пищевой и фармацевтической промышленности [13]. В нашей работе был использован максимально чистый образец наноструктурного SiO2, с размером подавляющей доли частиц в суспензии менее 100 нм, который в наибольшей степени отвечал по своим характеристикам продукту такого рода, применяемому в качестве пищевой добавки. Как показано в предыдущей работе [13], этот НМ при пероральном введении крысам в течение 3 мес в дозе до 100 мг/кг массы тела не оказывал дозозависимого неблагоприятного воздействия на интегральные и физиологические показатели организма животных, повреждение ДНК, уровень тканевых тиолов и когнитивную функцию. Как следует из данных, представленных в настоящей статье, в интервале доз 0,1-100 мг/кг массы тела в течение 92 сут опыта наноструктурный SiO2 способен оказывать отдельные воздействия, которые можно интерпретировать как неблагоприятные (снижение активности CYP2B1, уровня общего белка, альбумина, глюкозы в сыворотке крови). Впрочем, для всех этих показателей не удалось установить однозначную зависимость доза - эффект. Для уточнения токсиколого-гигиенической характеристики изучаемого НМ необходимо изучение альтернативных биомаркеров, связанных с предполагаемыми процессами развития его токсического действия. Они могут реализоваться, во-первых, на тканевом уровне, после проникновения НЧ во внутреннюю среду организма и возможного захвата клетками [19].

Наиболее вероятными мишенями такого воздействия являются быстрообновляемые клетки организма, в первую очередь входящие в состав системы кроветворения и иммунной системы.

Во-вторых, токсический эффект НЧ может реализоваться опосредованно, за счет их влияния на видовой состав, численность и активность компонентов кишечного микробиоценоза. Данные о возможности проявления указанных эффектов под действием наноструктурного SiO2 будут представлены в последующих публикациях.

Литература

1. Ананич И.В., Дерхо М.А. Биохимические показатели крови крыс // Ветеринар. клиника. - 2008. - № 10. - С. 18-19.

2. Верников В.М., Распопов Р.В., Арианова Е.А. и др. Токсиколого-гигиеническая оценка препаратов наноструктурированного диоксида кремния в эксперименте на лабораторных животных // Инновационные технологии в управлении, образовании, промышленности "АСТИНТЕХ-2010". - Астрахань: Астраханский университет, 2010. - С. 4-7.

3. Гаврилов В.Б., Мишкорудная М.И. Спектрофотометрическое определение содержания гидроперекисей липидов в плазме крови // Лаб. дело. - 1983. - № 3. - С. 33-35.

4. Дингл Д. Лизосомы. Методы исследования: Пер. с англ. - М.: Мир, 1980.- 342 с.

5. Зайцева Н.В., Землянова М.А., Звездин В.Н., Саенко Е.В. Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности водной суспензии нанодисперсного диоксида кремния, синтезированного методом жидкокристаллического темплатирования // Анализ риска здоровью. - 2013. - № 1. - С. 65-72.

6. Зайцева Н.В., Землянова М.А., Лебединская О.В. и др. Влияние нанодисперсного диоксида кремния на структурные особенности внутренних органов экспериментальных животных // Морфология. - 2013. - Т. 144, № 5. - С. 78-79.

7. Кавешникова С.В., Иванов В.М. Биохимические особенности крови крыс линии Вистар в постнатальном онтогенезе при интоксикации их оксидами азота // Вестн. Ставропольского гос. ун-та. - 2011. - Т. 74, № 1. - С. 100-105.

8. Мальцев Г.Ю., Васильев А.В. Способ определения активности каталазы и суперок-сиддисмутазы эритроцитов на анализаторе открытого типа. // Вопр. мед. химии. - 1994. - № 2. - С. 56-58.

9. Мальцев Г.Ю., Орлова Л.А. Оптимизация определения активности глутатионредуктазы эритроцитов человека на полуавтоматическом анализаторе // Вопр. мед. химии. - 1994. - № 2. - С. 59-61.

10. Мальцев Г.Ю., Тышко Н.В. Методы определения содержания глютатиона и активности глутатионпероксидазы в эритроцитах // Гиг. и сан. - 2002. - № 2. - С. 69-72.

11. Толстикова Т.Г., Жукова Н.А., Семенов Д.Е. и др. Биохимические показатели крови и количество гепатоцитов в печени крыс с токсическим гепатитом при действии аланинамида бетулоновой кислоты // Фундаментальные исследования (Fundamental Research). - 2012. - № 5. - С. 120-123.

12. Шипелин В.А., Арианова Е.А., Трушина Э.Н. и др. Токсиколого-гигиеническая характеристика фуллерена С60 при его введении в желудочно-кишечный тракт крыс // Гиг. и сан. - 2012. - № 2. - С. 90-94.

13. Шумакова А.А., Арианова Е.А., Шипелин В.А. и др. Токсикологическая оценка наноструктурного диоксида кремния. I. Интегральные показатели, аддукты ДНК, уровень тиоловых соединений и апоптоз клеток печени // Вопр. питания. - 2014. - Т. 83, № 3. - С. 52-62.

14. Burchell B., Weatherill P. 4-Nitrophenol UDP-glucuroniltransferase (rat liver) // Methods Enzymol. - 1981. - Vol. 77. - P. 169-176.

15. Burke M.D., Thompson S., Elcombe C.R. et al. Ethoxy-, pentoxy- and benzyloxyphenoxazones and homologues: a series of substrates to distinguish between different induced cytochromes P-450 // Biochem. Pharmacol. - 1985. - Vol. 34, N 18. - P. 3337-3345.

16. Dhawan A., Taurozzi J.S., Pandey A.K. et al. Stable colloidal dispersions of C60 fullerenes in water: Evidence for genotoxicity // Environ. Sci. Technol. - 2006. - Vol. 40, N 23. - P. 7394-7401.

17. Eom H.J., Choi J. Oxidative stress of silica nanoparticles in human bronchial epithelial cell, Beas-2B // Toxicol. In Vitro. - 2009. - Vol. 23, N 7. - P. 1326-1332.

18. Eom H.J., Choi J. Nanoparticles induced cytotoxicity by oxidative stress in human bronchial epithelial cell, Beas-2B // Environ. Health Toxicol. - 2011. - Vol. 26.- P. e2011013.

19. Fisichella M., Dabboue H., Bhattacharyya S. et al. Mesoporous silica nanoparticles enhance MTT formazan exocytosis in HeLa cells and astrocytes 2009 // Toxicol. In Vitro. - 2009. - Vol. 23, N 4. - P. 697-703.

20. Fujita K., Morimoto Y., Endoh S. et al. Identification of potential biomarkers from gene expression profiles in rat lungs intratracheally instilled with C60 fullerenes // Toxicology. - 2010. - Vol. 274, N 1-3. - P. 34-41.

21. Habig W.H., Pabst M.J., Jakoby W.B. Glutathione-S-transferases. The first enzymatic step in mercapturic acid formation // J. Biol.Chem. - 1974. - Vol. 249, N 22. - P. 7130-7139.

22. Jolly R.D., Walkley S.U. Lysosomal storage diseases of animals: an essay in comparative pathology // Vet. Pathol. - 1997. - Vol. 34, N 6. - Р. 527-548.

23. Lake B.G. Preparation and characterization of microsomal fractions for studies on xenobiotic metabolism // Biochemical Toxicology. A Practical Approach / Eds K. Snell, B. Mullock. - Oxford, UK: IRL Press, 1990. - P. 183-215.

24. Mihara M., Uchiyama M., Fukuzawa K. Thiobarbituric acid value on fresh homogenate of rat as a parameter of lipid per- oxidation in aging, CCl4 intoxication and vitamin E deficiency // Biochem. Med. - 1980. - Vol. 23, N 3. - P. 302-311.

25. Nabeshi H., Yoshikawa T., Matsuyama K. et al. Amorphous nanosilica induce endocytosis-dependent ROS generation and DNA damage in human keratinocytes // Part. Fibre Toxicol. - 2011. - Vol. 8, N 1. - P. 1-10.

26. Napierska D., Thomassen L.C., Rabolli V. et al. Size-dependent cytotoxicity of monodisperse silica nanoparticles in human endothelial cells // Small. - 2009. - Vol. 5, N 7. - P. 846-853.

27. Omura T., Sato R. The carbon monoxide binding pigment of liver microsomes. I. Evidence for its hemoprotein nature // Biol. Chem. - 1964. - Vol. 239, N 7. - P. 2370-2377.

28. Park E.J., Park K. Oxidative stress and pro-inflammatory responses induced by silica nanoparticles in vivo and in vitro // Toxicol. Lett. - 2009. - Vol. 184, N 1. - P. 18-25.

29. Park M.V., Annema W., Salvati A. et al. In vitro developmental toxicity test detects inhibition of stem cell differentiation by silica nanoparticles // Toxicol. Appl. Pharmacol. - 2009. - Vol. 240, N 1. - P. 108-116.

30. Rossi E.M., Pylkkдnen L., Koivisto A.J. et al. Airway exposure to silica-coated TiO2 nanoparticles induces pulmonary neutrophilia in mice // Toxicol. Sci. - 2010. - Vol. 113, N 2. - P. 422-433.

31. Sayes C.M., Reed K.L., Glover K.P. et al. Changing the dose metric for inhalation toxicity studies: short-term study in rats with engineered aerosolized amorphous silica nanoparticles // Inhal. Toxicol. - 2010. - Vol. 22, N 4. - P. 348-354.

32. Shipelin V.A., Trushina E.N., Avreneva L.I. et al. Toxicological and sanitary characteristics of fullerenol (hydroxylated fullerene C60) in 28-day in vivo experiment // Nanotechnologies in Russia.- 2013. - Vol. 8, N 11-12. - Р. 799-809.

33. Thomassen L.C., Aerts A., Rabolli V. et al. Synthesis and characterization of stable mono-disperse silica nanoparticle sols for in vitro cytotoxicity testing // Langmuir. - 2010. - Vol. 26, N 1. - P. 328-335.

34. Ueng T.H., Kang J.J., Wang H.W. et al. Suppression of microsomal cytochrome P450-dependent monooxygenases and mitochondrial oxidative phosphorylation by fullerenol, a polyhydroxylated fullerene C60 // Toxicol. Lett. - 1997. - Vol. 93, N 1. - P. 29-37.

35. Yang H., Wu Q., Tang M. et al. In vitro study of silica nanoparticleinduced cytotoxicity based on real-time cell electronic sensing system // J. Nanosci. Nanotechnol. - 2010. - Vol. 10, N 1. - P. 561-568.

36. Yang X., Liu J., He H. SiO2 nanoparticles induce cytotoxicity and protein expression alteration in HaCaT cells // Part. Fibre Toxicol. - 2010. - Vol. 7, N 1. - P. 1-10.

37. Ye Y., Liu J., Xu J. et al. Nano-SiO2 induces apoptosis via activation of p53 and Bax mediated by oxidative stress in human hepatic cell line // Toxicol. In Vitro. - 2010. - Vol. 24, N 3. - P. 751-758.