Influence of enzymatic hydrolyzate of mussels meat on growth and some indicators of general adaptation syndrome in rats

Abstract

The impact of the 15-day consumption of enzymatic hydrolyzate of the mussels meat as a part of semi-synthetic diet on some stress biomarkers and apoptosis activity in various organs of growing male Wistar rats have been studied.

Enzymatic hydrolyzate of the mussels meat (EMM) was obtained in pilot conditions using the enzyme preparation ≪Protozim≫. The animals of control group 1 (n=8 with initial body weight of 179,4Ѓ}5,9 g) and experimental group 2 (n=8, 176,3Ѓ}4,5 g) received a semi synthetic diet; the animals of the experimental group 3 (n=8, 177,6Ѓ}4,0 g) received the same semi synthetic diet in which 50% of the casein was replaced by the peptides of EMM. On the penult day of the experiment animals of groups 2 and 3 were subjected to stress exposure by electric current on their paws (current 0,4 mA for 8 seconds) and were placed in metabolic cages for the collection of daily urine. At the 15th day of the study, all control and test animals were killed by decapitation under ether anesthesia and necropsied. The content of prostaglandin E2 and β-endorphin in blood plasma was determined by ELISA test. The concentration of urine corticosterone was measured by HPLC. DNA damage and percentage of apoptotic cells (apoptotic index) were calculated in thymus by single-cell gel electrophoresis assay (Comet assay). The relative body weight increase of animals treated with EMM was significantly (p<0,05) higher (68,2Ѓ}3,0%) than those in animals of groups 1 and 2 (57,2Ѓ}4,0 and 59,7Ѓ}2,8%, respectively). The apoptotic index in thymus cells of tested groups of animals (2 and 3) was significantly (p<0,05) higher (1,13Ѓ}0,09 and 1,09Ѓ}0,01%) compared to intact animals of control group (1,04Ѓ}0,01%). Determination of β-endorphin and prostaglandin E2 levels did not shown any significant differences between the groups. Significantly (p<0,05) lower concentrations of corticosterone was found in the daily urine of stressed animals from group 3 (452Ѓ}78 ng/ml), treated with EMM, compared to stressed animals of group 2 that received a casein diet (834Ѓ}167 ng/ml). It has been shown that consumption of EMM with a high content of short and medium peptides has an impact on effectiveness of body weight gain of growing laboratory animals, and restrict the increase of corticosterone level in rats blood, which is typical for general adaptation syndrome.

Keywords:mussels, enzymatic hydrolyzate, stress, adaptation, apoptosis, corticosterone, β-endorphin, prostaglandin E2

Использование мяса мидий как высокоценного пищевого сырья для получения специализированных продуктов имеет в нашей стране уже более чем полувековую традицию.

Начиная с 1960-х гг. и до настоящего времени проведены многочисленные экспериментальные и клинические исследования, подтверждающие безопасность и эффективность применения в лечебном и профилактическом питании гидролизатов мяса мидий, полученных по технологии, основанной на кислотном гидролизе сырья [12, 13]. Результаты этих испытаний свидетельствуют о том, что кислотные мидийные гидролизаты обладают широким спектром фармакологического действия: радиопротекторной, гемостимулирующей, иммуностимулирующей и антивирусной активностью [2, 15]. Однако недостаточно удовлетворительные органолептические свойства, низкая биологическая ценность вследствие разрушения некоторых незаменимых аминокислот в процессе кислотного гидролиза и высокое содержание солей в конечном продукте препятствуют широкому использованию кислотных гидролизатов в оздоровительном питании [9-11]. Эти недостатки в значительной степени могут быть устранены применением технологии ферментолиза. Результаты по разработке и оптимизации процесса ферментативного гидролиза мяса мидий в лабораторных и полупромышленных условиях представлены в ряде отечественных публикаций [4, 5, 16].

В одной из наших предыдущих публикаций по сравнительной оценке биологической ценности гомогената мяса мидий (ГММ) и ферментативного гидролизата мяса мидий (ФММ) было высказано предположение о возможном наличии у ФММ заданного состава адаптогенных свойств [17].

В данной работе представлены результаты сравнительного определения аминокислотного скора ГММ и ФММ и исследования in vivo влияния потребления ФММ на рост и показатели общего адаптационного синдрома (ОАС) у крыс линии Вистар, подвергнутых дистрессу путем электрокожного раздражения.

Материал и методы

В работе использован ФММ, полученный в полупромышленных условиях с применением ферментного препарата "Протозим" ("ЕНЗИМ", Украина), микрофильтрации и распылительной сушки [1].

Химический состав препарата (табл. 1) и молекулярно-массовое распределение пептидных фракций в составе ФММ были определены в нашей предыдущей работе [17]. Суммарное содержание пептидов (средне- и короткоцепочечных) с молекулярной массой менее 3,5 кДа и аминокислот в ФММ составляло более 45%.

Аминокислотный скор исходного ГММ и ФММ определяли на анализаторе "ААА-835" ("Hitachi", Япония) с последующей компьютерной обработкой данных по программе Мультихром для Windows; содержание триптофана в составе ГММ и ФММ определяли методом щелочного гидролиза [7].

В опытах при проведении исследования использовали половозрелых крыс-самцов линии Вистар, полученных из питомника "Столбовая". Животных разделили случайным образом на 3 группы по 8 особей в каждой. Исходная масса тела животных контрольной и опытных групп достоверно не различалась.

Животные 1-й (контрольной) группы и 2-й опытной группы получали изокалорийный (381 ккал/100 г сухого корма) и изоазотистый (20,2% казеина по калорийности) полусинтетический рацион (табл. 2) [18]. Животные 3-й опытной группы получали полусинтетический рацион, в котором 50% казеина было заменено пептидами ФММ (табл. 3).

Воду и корм животные всех групп получали без ограничений.

Крыс ежедневно осматривали и периодически взвешивали.

В предпоследний день эксперимента животных 2-й и 3-й опытных групп подвергали стрессорному воздействию, используя установку ("PanLab", Испания), представляющую собой большое освещенное белое отделение и маленькое черное отделение, разделенные опускными моторизированными воротами. Решетчатый пол малого черного отделения электрифицирован (выход 0-2 мА).

Крысу помещали в светлый отсек камеры спиной к темному отсеку. Как только крыса переходила в темный отсек камеры, она получала электрокожное раздражение на лапы (ток 0,4 мА в течение 8 с).

Затем животных помещали в обменные клетки и в течение следующих суток собирали мочу. На 15-е сутки эксперимента животных выводили из эксперимента декапитацией под легким эфирным наркозом и подвергали патологоанатомическому вскрытию для извлечения тимуса, взвешивали его.

Кровь собирали в пробирки с предварительно добавленным раствором Трилона Б (1,25%, 400 мкл) и отбирали плазму крови центрифугированием при t=4 °С в течение 25 мин на центрифуге "J-6B" ("Beckman", Австрия). Образцы хранили в замороженном состоянии.

В плазме крови иммуноферментным методом с использованием коммерческих наборов определяли содержание β-эндорфина (набор "Peptide Enzyme immunoassay (EIA) kit", "Peninsula lab. immunoassay", США) и простагландина Е2 (набор "Rat Prostaglandin E2 (PGE2) ELISA Kit", "CUSABIO", Китай).

Содержание в моче кортикостерона определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), согласно [21] c некоторыми модификациями. К 0,75 мл мочи добавляли 100 мкл раствора внутреннего стандарта (дексаметазон) с концентрацией 10 мкг/мл, затем 5,0 мл этилового спирта. Пробу помещали на лабораторный встряхиватель на 30 мин при комнатной температуре.

После чего смесь фильтровали через шприцевой фильтр (0,45 мкм) и упаривали на роторном испарителе. Анализируемый образец смывали 0,5 мл 50% этилового спирта и вводили в хроматографическую систему. Хроматографический анализ проводили на колонке Нуклеосил С18 (250×5 мм, 5 мкм) в условиях линейного градиента от 20 до 60% ацетонитрила (в воде) в течение 45 мин при скорости элюирования 0,75 мл/мин и объеме петли 100 мкл. В качестве детектора использовали спектрофотометрический проточный детектор "V/VIS-151" ("GILSON", США) при длине волны 254 нм [14].

Активность апоптоза в изолированных клетках тимуса определяли методом щелочного гель-электрофореза (метод ДНК-комет) по степени ДНК повреждений, а также рассчитывали процент апоптотических клеток (индекс апоптоза) [3, 20].

Микроскопический анализ проводили на микроскопе "Zeiss Axio Imager Z1" ("Zeiss", Германия) при увеличении 400. Полученные изображения ДНК-комет (краситель SYBR Green I) анализировали с использованием программного обеспечения Comet Imager system ("Metasystems GmbH", Германия). В качестве показателя поврежденности ДНК использовали процентное содержание ДНК в хвосте ДНК-комет (% ДНК в хвосте). Апоптотическими считали клетки с содержанием ДНК в хвосте ДНК-кометы 75%. С каждого микропрепарата анализировали не менее 100 клеток [22].

Результаты исследований приведены в виде М±m, где М - выборочное среднее измеряемых величин, m - стандартная ошибка. Статистическую обработку полученных результатов провод с использованием пакета программ SPSS Statistics 20, используя непараметрический ранговый критерий Манна-Уитни и критерий Стьюдента. Критический уровень значимости нулевой статистической гипотезы (p) принимали равным 0,05.

Результаты и обсуждение

Аминокислотный скор белка мяса мидий и его ферментативного гидролизата относительно шкалы идеального белка представлен в табл. 4.

Как следует из представленных результатов, ферментолиз в основном не приводил к существенной деградации незаменимых аминокислот в исходном сырье, за исключением суммы ароматических аминокислот (фенилаланин + тирозин).

Аминокислотный скор ФММ, также как и аминокислотный скор мяса мидий, был лимитирован в первую очередь по сумме серосодержащих аминокислот, однако, как об этом свидетельствуют нижеприведенные результаты, полученные в опыте in vivo, замена в полусинтетическом рационе 50% белка казеина на ФММ не имела негативных последствий. Действительно, общее состояние всех животных при ежедневном осмотре на протяжении всего эксперимента было удовлетворительным: по внешнему виду, качеству шерстного покрова, потреблению корма и воды, поведению не было выявлено отличий у животных, потреблявших ФММ, по сравнению с животными контрольных группы.

В табл. 5 приведены средние значения (по группе) относительного прироста массы тела животных по дням эксперимента.

Потребление ФММ в составе рациона оказало выраженное положительное влияние на рост массы тела крыс. Начиная с 8-х суток относительное увеличение массы тела животных, получавших ФММ, стало достоверно выше данного показателя животных 1-й и 2-й групп. Одним из возможных объяснений наблюдаемого феномена может быть наличие у пептидов ФММ анаболических свойств.

Визуальная оценка тимуса не выявила какихлибо неблагоприятных изменений этого органа, масса тимуса достоверно не различалась у животных всех групп. Однако было выявлено достоверное увеличение в тимусе индекса апоптоза (табл. 6) у животных 2-й и 3-й групп, подвергнутых воздействию электрического тока, по сравнению с интактными животными контрольной группы.

Этот результат свидетельствовал о том, что электрокожное раздражение крыс, использован- ное в данном исследовании, позволило достаточно корректно промоделировать дистресс.

Интенсивность протекания общего адаптационного синдрома определяется взаимосвязанным функционированием центральной стресссистемы и лимитирующих стресс-систем и характеризуется биохимическими биомаркерами - кортикостероидами, эндорфинами, простагландинами и другими биологически активными соединениями. Некоторые из этих показателей были определены в нашем исследовании.

В табл. 7 представлены результаты определения содержания β-эндорфина и простагландина Е2 в плазме крови крыс и кортикостерона в суточной моче животных всех групп по окончании эксперимента.

Определение содержания в крови β-эндорфина - нейропептида, рассматриваемого некоторыми авторами в качестве "возможного информативного показателя адаптабельности организма" [8, 19], не выявило достоверных различий этого показателя между группами животных. Содержание простагландина Е2 в плазме крови также достоверно не различалось для животных опытных и контрольной групп. Однако статистически достоверно более низкие значения концентраций кортикостерона обнаружены в суточной моче подвергнутых стрессу животных 3-й опытной группы, потреблявших ФММ, по сравнению с аналогичным показателем у стрессированных животных 2-й опытной группы, получавших казеиновый рацион.

Таким образом, прием ФММ с высоким содержанием средне- и короткоцепочечных пептидов ограничивал характерное для общего адаптационного синдрома увеличение в суточной моче крыс классического стресс-гормона кортикостерона, что в определенной степени соответствует высказанному ранее предположению о наличии у ФММ адаптогенных свойств [17]. В работе [6] было показано, что радиозащитная и гемостимулирующая активность ГММ возрастают с увеличением содержания в их составе низкомолекулярных пептидных фракций. Выяснение вопроса о зависимости адаптогенных свойств ФММ от содержания низкомолекуляных пептидов и свободных аминокислот также представляет существенный интерес при разработке новых специализированных продуктов для лиц, связанных с неблагоприятными условиями труда, и должно стать предметом дальнейших исследований.

Литература

1. Арнаутов М.В., Абрамова Л.С., Абрамов Д.В. и др. Отработка технологии ферментативного гидролиза мяса мидий в полупромышленных масштабах // Рыбное хозяйство. - 2013. - № 1. - С. 112-116.

2. Гончаренко Е.Н., Деев Л.И., Кудряшов Ю.Б., Пархоменко И.М. Мидийный кислотный гидролизат и его биологическое действие // Успехи соврем. биологии. - 1995. - Т. 115, вып. 2. - С. 213-224.

3. Дурнев А. Д., Жанатаев А. К., Анисина Е. А. и др. Применение метода щелочного гель-электрофореза изолированных клеток для оценки генотоксических свойств природных и синтетических соединений: Методические рекомендации. - М., 2006. - 27 с.

4. Зорин С.Н., Бучанова А.В., Матяш А.И. и др. Влияние комплекса органического цинка с ферментативным гидролизатом мяса мидий на всасываемость в желудочно-кишечном тракте потенциально аллергенных пищевых белков // Вопр. питания. - 2010. - Т. 79, № 2. - С. 73-77.

5. Зорин С.Н., Матяш А.И., Нгуан Иен и др. Одностадийный ферментативный гидролиз мяса мидий // Вопр. дет. диетологии. - 2008. - Т. 6, № 3. - С. 36-38.

6. Кудряшов Ю.Б. Фундаментальные механизмы лучевого поражения и противолучевой защиты. Принцип "четвертого состояния" и МИГИ-К // Материалы межвузовского координационного совещания по проблеме модификации лучевых повреждений. - 1989. - С. 11-21.

7. Лисицын А.Б., Иванкин А.Н., Неклюдов А.Д. Методы практической биотехнологии. Анализ компонентов и микропримесей в мясных и других пищевых продуктах. - М.: ВНИИМП, 2002.

8. Лишманов Ю.Б., Трифонова Ш.Б., Цибин А.Н. и др. Эндорфин и стресс-гормоны плазмы крови при состояниях напряжения и адаптации // Бюл. экспер. биол. - 1987. - Т. 103, № 4. - С. 422-424.

9. Моллин Р., Панек Я., Мияхара М. Белковые гидролизаты в пищевых продуктах // Мясные технологии. - 2007. - № 11. - С. 30-31.

10. Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н., Бердутина А.В. Свойства и применение белковых гидролизатов (обзор) // Приклад. биохим. - 2000. - Т. 36, № 5. - С. 525-534.

11. Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н., Бердутина А.В. Получение и очистка белковых гидролизатов (обзор) // Приклад. биохим. - 2000а. - Т. 36, № 4. - С. 371-379.

12. Новикова М.В. Гидробионты как промышленное сырье: Учебное пособие. - М.: Изд-во ВНИРО, 2005. - 116 с.

13. Новикова М.В., Абрамова Л.С., Котенев Б.Н. Технология получения и применения биологически активных добавок из беспозвоночных и отходов их разделки. Методические рекомендации по комплексному использованию морских и пресноводных беспозвоночных для получения пищевых и кормовых биологически активных добавок. - М.: Изд-во ВНИРО, 2008. - Вып. 3. - 24 с.

14. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. - М.: Наука, 1985. - Гл. 4. - С. 109-166.

15. Рехина Н.И., Новикова М.В., Беседина Т.В. и др. Пищевой продукт из мяса мидий для лечебно-профилактического применения // Рыбное хозяйство. - 1995. - № 4. - С. 53-56.

16. Сидорова Ю.С., Зорин С.Н., Мазо В.К. и др. Новый источник органических форм цинка // Вопр. питания. - 2011. - Т. 80, № 6. - С. 72-75.

17. Сидорова Ю.С., Арнаутов М.В., Байгарин Е.К. и др. Сравнительная оценка влияния гомогената и ферментолизата мяса мидий на рост и усвоение белка крысами Вистар // Вопр. питания. - 2013. - Т. 82, № 2. - С. 17-22.

18. Тышко Н.В., Жминченко В.М., Пашорина В.А., Селяскин К.Е. Сравнительная характеристика влияния экспериментальных рационов на рост и развитие крыс // Вопр. питания. - 2011. - Т. 80, № 5. - С. 30-38.

19. Яременко К.В. Оптимальное состояние организма и адаптогены. - СПб.: ЭЛБИ-СПб, 2008. - С. 129.

20. Chandna S. Single-cell gel electrophoresis assay monitors precise kinetics of DNA fragmentation induced during programmed cell death // Cytometry A. - 2004. - Vol. 61, N 2. - P. 127-133.

21. Petra Quillfeld, Maud Poisbleau Measuring corticosterone in seabird egg yolk and the presence of high yolk gestagen concentrations // Gen. Comp. Endocrinol. - 2011. - Vol. 173. - P. 11-14.

22. Smith C.C., Adkins D.J., Martin E.A., O’Donovan M.R. Recommendations for design of the rat comet assay // Mutagenesis. - 2008. - Vol. 23, N 3. - P. 233-240.