Toxicological assessment of nanostructured silica. The acute oral toxicity

Abstract

Nanostructured amorphous silica (SiO2 ) is one of the priorities of nanomaterials, exposing human to the ever-increasing scale as a component of food additives, drugs and cosmetic products. According to numerous publications SiO2 nanoparticles (NPs) possess deleterious effects on animal and human cells in vitro and also exhibit inhalation toxicity. However, the biological effects in vivo of silica NPs taken orally are studied insufficiently. This article represents the first section of this study which aim is identification of silica preparation as nanomaterial and estimating of acute toxicity after oral administration in the form of aqueous suspension. Studies of size and shape of the particles in aqueous suspension of silica used in the study by electron and atomic force microscopy, spectroaqustic analysis and dynamic laser light scattering showed that the test substance is a nanomaterial. Estimation of acute toxicity of an aqueous suspension of nanostructured silica with a single intragastric gavage to male BALB/C mice allowed to conclude that the test material has LD 50 by the oral route greater than 10 000 mg/kg and consequently belongs to class IV (low danger agents). Pathological changes in jejunum and colon of mice in the acute experiment (at a dose of 10 000 mg/kg) haven’t been identified. Thus SiO2 NPs possess low toxicity when administered in the gastrointestinal tract.

The available data, however, do not exclude possible presence of adverse effects under their long-term administration by oral way.

Keywords:silica, nanoparticles, mice, acute toxicity, morphology, small intestine, colon

Вопр. питания. - 2014. - № 2. - С. 42-49.

Широкое распространение и общественное признание достижений нанотехнологий сдерживается опасениями, обусловленными возможным наличием у наночастиц (НЧ) и наноматериалов (НМ) потенциально неблагоприятных эффектов для здоровья человека. Необходимость оценки безопасности НМ обосновывается в постановлении Главного государственного санитарного врача РФ № 54 от 23.07.2007 "О надзоре за продукцией, полученной с использованием нанотехнологий и содержащей наноматериалы" и информационном письме Роспотребнадзора "О надзоре за производством и оборотом продукции, содержащей наноматериалы" [5, 6]. В связи с этим в последние годы были проведены исследования по оценке безопасности НМ, наиболее важных с позиций перспектив их использования в пищевой и фармацевтической промышленности, в экспериментах на лабораторных животных при пероральном пути поступления [2, 3].

Одним из приоритетных видов наноматериалов, возможно, поступающих в организм человека во все возрастающих масштабах, является наноструктурный аморфный диоксид кремния (кремнезем). Этот НМ, известный также как "Аэросил" (ГОСТ 14922-77), широко используется в качестве сорбента и наполнителя, в том числе пищевой добавки, а также компонента косметической продукции и лекарственных препаратов [1, 10, 15, 16].

Вместе с тем, по данным ряда работ, можно предположить, что в определенных условиях наночастицы (НЧ) аморфного SiO2 могут оказывать неблагоприятное, в том числе токсическое, воздействие на организм. Для них характерна каталитическая генерация реакционноспособных форм кислорода, которая была выявлена в бесклеточной системе [21], в культуре кератиноцитов [17] и альвеолярных эпителиоцитов человека [11].

По данным [13], наночастицы SiO2 поглощались клетками HeLa и астроцитами по механизму эндоцитоза. В ряде исследований были охарактеризованы цитотоксические эффекты наноразмерного кремнезема в отношении культур нетрансформированных клеток. Так, сообщается о токсичности этих НЧ диаметром 14-16 нм для клеток линии EAHY926 [18]. В отличие от них частицы субмикронного размера (100-330 нм) не были токсичны. В культуре стволовых клеток эмбриона мыши НЧ аморфного SiO2 диаметром 10 и 30 нм (но не 80 нм) подавляли дифференцировку в нормальные кардиомиоциты [19].Апоптоз и изменения в экспрессии белков р53, Вах и Bcl-2 под действием наночастиц SiO2 размером 21 нм были выявлены также в нормальных клетках печени линии L-02 [25]. О наличии у НЧ кремнезема цитотоксических свойств и их влиянии на апоптоз указывают также данные работ, выполненных на альтернативных клеточных моделях [12, 23, 24].

Вместе с тем вопрос о биологических эффектах НЧ SiO2 in vivo при пероральном поступлении в организм исследован недостаточно.

В связи с этим токсикологическое исследование указанной формы наноструктурного диоксида кремния при пероральном пути поступления представляет большой интерес как для решения фундаментальных проблем нанотоксикологии, так и для практики гигиенического нормирования.

Цель работы - идентификация исследуемого вещества физико-химическими методами в качестве НМ и оценка острой токсичности при его пероральном пути поступления в виде водной суспензии.

Материал и методы

Использован коммерческий препарат высокодисперсного аморфного диоксида кремния "Орисил 300" (ООО "Силика", Россия, Московская обл., г. Долгопрудный). Индекс "300" в наименовании продукта означает удельную площадь поверхности в м2 /г, определенную методом изотерм адсорбции инертных газов. По физическим свойствам это рентгеноаморфный легкий белый порошок, дающий при диспергации ультразвуком в воде опалесцирующий бесцветный коллоидный раствор, стабильный в течение не менее 2 сут.

Размер и форму тестируемого материала оценивали методом трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) на просвечивающем электронном микроскопе "JEM-100СХ" ("JEOL", Япония); методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) на приборе "SmartSPM" ("АИСТ-НТ", Россия); спектроакустическим методом на спектроакустическом анализаторе "DT-1202" ("Dispersion technology Inc.", США); методом динамического лазерного светорассеяния на анализаторе размера частиц "Nanotrack Wave" ("Microtrac Inc.", США). В двух последних случаях исследование образца проводили после ультразвуковой обработки.

Параметры острой токсичности водной суспензии диоксида кремния при пероральном пути поступления оценивали в соответствии с МУ 1.2.252009 [9]. Для получения водной суспензии препарат диспергировали в дистиллированной воде с помощью ультразвукового гомогенизатора "Sonopuls Hd 3200" ("Bandelin", Германия) при комнатной температуре в режиме непрерывной пульсации при 65% мощности в течение 4 мин. Концентрация диоксида кремния в водной суспензии составила 195 мг/мл.

Для установления параметров острой токсичности выполнен эксперимент методом одной точки [7] на 20 половозрелых самцах белых мышей BALB/C массой тела 25,0±2,0 г, возрастом 2,2±0,2 мес.

Опытной группе (10 особей) исследуемую водную суспензию диоксида кремния в дозе 10 000 мг/кг вводили однократно внутрижелудочно через зонд в объеме не более 1,5 мл. Во избежание нефизиологического растяжения желудка животных вещество вводили в 2 приема с перерывом в 35 мин; при этом вводимый одномоментно объем жидкости не превышал 0,75 мл. Контрольная группа (10 особей) получала аналогичным способом дистиллированную воду в соответствующем объеме. Критерии токсичности: летальный эффект, среднее время гибели животных, клиническая картина развития интоксикации. Срок наблюдения за животными после введения тестируемого вещества составил 14 сут.

Работа с животными выполнена в соответствии с "Руководством по уходу и использованию лабораторных животных (ILAR, DELS)" [14]. Содержание животных и наблюдение за ними в течение инкубационного периода и во время проведения эксперимента выполняли в соответствии с МУ 1.2.2520-09 [9]. Для унификации исследований животные на протяжении всего эксперимента получали полусинтетический рацион, пищевая и биологическая ценность которого полностью удовлетворяла физиологические потребности [20]. Корма и вода для экспериментальных животных не содержали патогенных организмов и вредных примесей и не влияли на результаты исследований. Доступ к пище и воде не ограничивали.

Животных (контрольной и опытной групп) выводили из эксперимента в соответствии с существующими правилами [14]. Отобранный материал (ободочную и тощую кишку) фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине, далее проводили обезвоживание кусочков тощей и ободочной кишки в спиртах восходящей концентрации, пропитывание хлороформом и парафином, а затем заливали гомогенизированной парафиновой средой "Histomix". Для получения гистологических препаратов изготавливали срезы толщиной 4 мкм на санном микротоме "JUNG SM 2000R" ("Leica", Германия) и окрашивали по общепринятой методике гематоксилином и эозином. Полученные препараты исследовали в светооптическом микроскопе "Axiostar" ("Carl Zeiss", Германия). Микрофотографии выполняли на светооптическом микроскопе "MEIJI" ("Techno", Япония), снабженном камерой "microscopy VISION" ("VISION", Канада), при увеличении ×100, ×200, ×400, ×800.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием двустороннего t-критерия Стьюдента в программе SPSS 17.0.

Результаты и обсуждение

На основании результатов проведенных исследований размера и формы частиц диоксида кремния независимыми методами установлено, что изученный образец диоксида кремния является НМ. Об этом свидетельствует исследование суспензии образца в концентрации 1 мкг/мл методом ТЭМ (рис. 1, а-в). Установлено, что НЧ диоксида кремния на сеточке распределялись в основном в виде больших агрегатов, состоящих из первичных частиц размером 5, 20, 30, 40, 100 нм, и очень небольшого количества отдельных частиц размером 5-20 нм.

Исследование суспензии образца в концентрации 1 мг/мл методом АСМ показало на сканированных изображениях присутствие НЧ диоксида кремния, находящихся преимущественно в агрегированном состоянии. Агрегаты НЧ присутствовали на всех сканах с размером сканируемой области 20×20 мкм2 . Примеры характерных агрегатов приведены на рис. 2а (размеры агрегатов варьировали, достигая максимальной величины до 2 мкм в одном из измерений). Для всех агрегатов отмечено, что структурным элементом является частица с размерами менее 100 нм. Популяция НЧ в составе агрегатов была однородной по морфологии, состояла из сферических частиц размером от 20 до 60 нм. На рис. 2б представлены агрегаты, полученные при большом увеличении, в результате чего на изображениях хорошо различимы отдельные НЧ в составе агрегатов.

Спектроакустическое исследование водной суспензии диоксида кремния в концентрации 5% по массе показало бимодальное распределение частиц по размерам с преобладанием фракции НЧ со средним размером 20-40 нм (рис. 3).

Анализ размера частиц образца в концентрации 1% по массе методом динамического лазерного светорассеяния позволило установить, что в препарате преобладала фракция НЧ со среднечисловым гидродинамическим диаметром 56,6±32,1 нм, 90-й перцентиль размера - 91,7 нм (рис. 4). Содержание фракции частиц с диаметром более 100 нм не превышало 10% от общего числа частиц.

Результаты изучения острой токсичности показали, что клиническая картина при однократном внутрижелудочном введении через зонд водной суспензии наноструктурного диоксида кремния в высокой дозе (10 000 мг/кг массы тела) характеризовалась снижением двигательной активности животных в первые 20 мин после введения вещества, слабой реакцией на звуковые раздражители, поверхностным дыханием, что обусловлено неспецифической реакцией на процедуру введения через зонд. У мышей контрольной группы были зафиксированы схожие изменения.

В последующий период наблюдения животные сохраняли обычную двигательную активность, безусловные рефлексы и реакции на внешние раздражители исходной высоты, корм поедали охотно. Шерсть животных была чистая, блестящая, гладкая.

На протяжении всего срока наблюдения внешний вид, поведение и динамика прибавки массы тела у животных опытной группы не отличались от аналогичных показателей животных контрольной группы (см. таблицу). Снижения поедаемости корма, наличия признаков интоксикации и гибели животных в обеих группах в течение всего срока наблюдения не было.

Макроскопическое исследование тканей внутренних органов животных не выявило патологических изменений в изучаемой дозе (10 000 мг/кг массы тела). На примере морфологических исследований тощей и ободочной кишки показано, что у мышей опытной группы в гистологических препаратах ободочной кишки все слои хорошо дифференцируются (рис. 5): слизистая покрыта призматическим эпителием, видны бокаловидные клетки, крипты дифференцируются, имеют широкие просветы. Подслизистый слой рыхлый, представлен нежноволокнистой соединительной тканью с тонкостенными сосудами слабого кровенаполнения.

В слизистой и подслизистой оболочках визуализируются единичные лимфоциты (рис. 6). Мышечная оболочка типичного вида: в виде 2 слоев (продольного и циркулярного) гладкомышечных клеток. Серозная оболочка тонкая. Гистологические препараты тощей кишки характеризуются сохранностью слоев (рис. 7): кишечные ворсины слизистой тонкие, крипты хорошо дифференцируются, бокаловидные клетки прослеживаются на всем протяжении. Во всех отделах слизистой оболочки небольшие скопления лимфоцитов (рис. 8). Мышечная оболочка тонкая, состоит из двух слоев разнонаправленных пучков гладкомышечных волокон. Серозная оболочка тонкая, содержит единичные лимфоциты.

У животных контрольной группы (данные не приведены) в гистологических препаратах ободочной кишки визуализируется неизмененная структура стенки. В гистологических препаратах тощей кишки отмечается сохранность структуры стенки, кишечные ворсинки тонкие с рыхлой стромой, прослеживаются бокаловидные клетки.

Таким образом, каких-либо различий в морфологии препаратов тощей и ободочной кишки между животными контрольной и опытной групп не выявлено.

Анализ полученных результатов позволяет сделать заключение, что водная суспензия наноструктурного диоксида кремния при однократном внутрижелудочном введении через зонд мышам в дозе 10000 мг/кг не вызывает гибели и явлений интоксикации. Изменений в интегральных показателях общего состояния экспериментальных животных не наблюдается. В гистологических препаратах ободочной и тощей кишки какие-либо морфологические изменения не выявлены. Таким образом, по критерию LD 50 (больше 10 000 мг/кг) изученный наноструктурный диоксид кремния с размером первичных частиц 20-60 нм в виде водной суспензии относится к IV классу опасности (малоопасные вещества) при пероральном пути введения в соответствии с ГОСТ 12.1.007-76. Низкая острая токсичность НЧ диоксида кремния при их введении через желудочно-кишечный тракт может быть связана с весьма низкой биодоступностью (всасываемостью) НЧ диоксида кремния при однократном внутрижелудочном введении, как это можно предположить по аналогии с другими видами оксидных наночастиц (оксиды титана, лантана), не проникающих или очень слабо проникающих через слизистую оболочку кишки, по данным электронной микроскопии [4, 8]. Косвенно об этом свидетельствует и выявленное в настоящей работе отсутствие видимых морфологических изменений в слизистой оболочке тощей и ободочной кишки животных, однократно получавших НЧ SiO2 в высокой дозе.

Вместе с тем в условиях длительного (подострого и хронического) введения НЧ SiO2 в желудочно-кишечный тракт нельзя исключить проникновения их небольших количеств во внутреннюю среду организма по механизмам персорбции [22], накопления во внутренних органах и возможного токсического действия. Нельзя также исключить и наличия у этого наноматериала и косвенного механизма воздействия на организм, через влияние на состав кишечного микробиоценоза.

Поэтому следующим этапом токсикологической оценки НЧ диоксида кремния будет изучение их воздействий на организм лабораторных животных в длительном эксперименте.

Авторы благодарят А.А. Лошкарева, ведущего эксперта Метрологического центра РОСНАНО (г. Долгопрудный) за проведение спектроакустического исследования.

Литература

1. Верников В.М., Арианова Е.А., Гмошинский И.В. и др. Нанотехнологии в пищевых производствах: перспективы и проблемы // Вопр. питания. - 2009. - Т. 78, № 2. - С. 4-17.

2. Верников В.М., Распопов Р.В., Арианова Е.А. и др. Токсиколого-гигиеническая оценка препаратов наноструктурированного диоксида кремния в эксперименте на лабораторных животных // Материалы междунар. науч. конф. "АСТИНТЕХ-2010". - Астрахань: ИД "Астраханский университет", 2010. - Т. 3. - С. 4-7.

3. Зайцева Н.В., Землянова М.А., Звездин В.Н. и др. Токсикологогигиеническая оценка безопасности водной суспензии нанодисперсного диоксида кремния, синтезированного методом жидкокристаллического темплатирования // Анализ риска здоровью. - 2013. - № 1. - С. 65-72.

4. Морозов И.А., Хвыля С.И., Лысиков Ю.А. Электронномикроскопическое изучение проницаемости энтероцитов тонкой кишки для коллоидного лантана в опытах in vitro и in vivo // Физиол. журн. им. И.М. Сеченова. - 1982. - Т. 68, № 9. - С. 1261-1268.

5. О надзоре за продукцией, полученной с использованием нанотехнологий и содержащей наноматериалы: Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации № 54 от 23.07.2007.

6. О надзоре за производством и оборотом продукции, содержащей наноматериалы: Информационное письмо Роспотребнадзора № 0100/4502-07-02 от 02.05.2007 г.

7. Обоснование гигиенических нормативов химических веществ в воде водных объектов хозяйственно-питьевого и культурно-бытового водопользования: Методические указания. МУ 2.1.5.720-98.

8. Онищенко Г.Е., Ерохина М.В., Абрамчук С.С. и др. Влияние наночастиц диоксида титана на состояние слизистой оболочки тонкой кишки крыс // Бюл. экспер. биол. - 2012. - Т. 154, № 8. - С. 231-237.

9. Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов: Метод. указания. МУ 1.2.2520-09.

10. Ebbesen M., Jensen T.G. Nanomedicine: techniques, potentials, and ethical implications // J. Biomed. Biotechnol. - 2006. - N l. - Article ID51516. - P. 1-11.

11. Eom H.-J., Choi J. Oxidative stress of silica nanoparticles in human bronchial epithelial cell, Beas-2B // Toxicol. In Vitro. - 2009. - Vol. 23, N 7. - P. 1326-1332.

12. Eom H.-J., Choi J. Nanoparticles induced cytotoxicity by oxidative stress in human bronchial epithelial cell, Beas-2B // Environ. Health Toxicol. - 2011. - Vol. 26. - P. e2011013.

13. Fisichella M., Dabboue H., Bhattacharyya S. et al. Mesoporous silica nanoparticles enhance MTT formazan exocytosis in HeLa cells and astrocytes 2009 // Toxicol. In Vitro. - 2009. - Vol. 23, N 4. - P. 697-703.

14. Guide for the care and use of laboratory animals. 8 th ed. / Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals; Institute for Laboratory Animal Research (ILAR); Division on Earth and Life Studies (DELS); National Research Council of the national academies. - Washington: The National Academies Press, 2011. - 248 p.

15. Holsapple M.P., Farland W.H., Landry T.D. et al. Research strategies for safety evaluation of Nanomaterials. Part II. Toxicological and safety evaluation of nanomaterials, current challenges and data needs // Toxicol. Sci. - 2005. - Vol. 88, N 1. - P. 12-17.

16. Meynen P., Cool E., Vansant F. Verified syntheses of mesoporous materials // Microporous and Mesoporous Materials. - 2009. - Vol. 125, N 3. - P. 170-223.

17. Nabeshi H., Yoshikawa T., Matsuyama K. et al. Amorphous nanosilica induce endocytosis-dependent ROS generation and DNA damage in human keratinocytes // Part. Fibre Toxicol. - 2011. - Vol. 8, N 1. - P. 1-10.

18. Napierska D., Thomassen L.C., Rabolli V. et al. Size-dependent cytotoxicity of monodisperse silica nanoparticles in hu-man endothelial cells // Small.- 2009.- Vol. 5, N 7.- P. 846-853.

19. Park M.V., Annema W., Salvati A. et al. In vitro developmental toxicity test detects inhibition of stem cell differentiation by silica nanoparticles // Toxicol. Appl. Pharmacol. - 2009. - Vol. 240, N 1.- P. 108-116.

20. Reeves P.G., Nielsen F.H., Fahey G.C. AIN-93 purified diets for laboratory rodents: final report of the American Institute of Nutrition ad hoc writing committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet // J. Nutr. - 1993. - Vol. 123, N 11. - P. 1939-1951.

21. Thomassen L.C., Aerts A., Rabolli V. et al. Synthesis and characterization of stable mono-disperse silica nanoparticle sols for in vitro cytotoxicity testing // Langmuir.- 2010.- Vol. 26, N 1.- P. 328-335.

22. Volkheimer G. Persorption of particles: physiology and pharmacology // Adv. Pharmacol. Chemother. - 1977. - Vol. 14. - P. 163-187.

23. Yang H., Wu Q., Tang M. et al. In vitro study of silica nanoparticle-induced cytotoxicity based on real-time cell electronic sensing system // J. Nanosci. Nanotechnol.- 2010.- Vol. 10, N 1.- P. 561-568.

24. Yang X., Liu J., He H. SiO2 nanoparticles induce cytotoxicity and protein expression alteration in HaCaT cells // Part Fibre Toxicol. - 2010. - Vol. 7, N 1. - P. 1-10.

25. Ye Y., Liu J., Xu J. et al. Nano-SiO2 induces apoptosis via activation of p53 and Bax mediated by oxidative stress in human hepatic cell line // Toxicol. In Vitro. - 2010. - Vol. 24, N 3. - P. 751-758.