Phytoecdysteroids influence on the hormonal status and apoptosis in growing rats

Abstract

The impact of the 15-day consumption of Serratula coronata extract containig phytoecdysteroids on some indicators of hormonal status and activity of apoptosis in various organs of growing male Wistar rats (initial body weight 127,8±2,5 г) has been studied. The extract from the leaves of Serratula сoronata was added to the water of animals of experimental groups 2 and 3 (n=8 in each group) daily at the dose of 5 and 15 mg phytoecdysteroids per kg of body weight respectively.

Animals of the control group 1 (n=8) received water alone throughout the experiment. Daily volume of drunk fluid was recorded. Аt the 15 th day of the experiment animals were taken out using the decapitation under the light ether anesthesia.

The content of corticosterone, prostaglandin E 2 and beta-endorphin in rat blood plasma were determined by ELISA test. Plasma level of noradrenaline was determined by HPLC. DNA damage and percentage of apoptotic cells (apoptotic index)were measured in isolated cells of the thymus, heart and brain by singlecell gel electrophoresis (the comet assay). Significantly lower concentration of norepinephrine was detected in plasma of experimental animals from groups 2 and 3 (10,3±1,1 and 7,2±0,8 ng/ml, respectively ) compared to the same index in the control group (20,4±3,4 ng/ml). Significant differences of other biochemical parameters for all groups of animals have not been identified. Statistical significant difference in the ratio of corticosterone/norepinephrine compared with control animals was detected for a group of rats consumed the highest dose of phytoecdysteroids. There was no statistically significant difference in DNA fragmentation and apoptosis index in animals consumed phytoecdysteroids in compare with the control group of animals. The absence of the activity of apoptosis in cells of the heart, brain and thymus of rats treated with phytoecdysteroid extract may indicate the safety of its use in the diet of the animals.

Keywords:adaptogen, phytoecdysteroids, norepinephrine, apoptosis index, DNA fragmentation

Вопр. питания. - 2014. - № 2. - С. 16-21.

Согласно современным представлениям фитоэкдистероиды - полигидроксилированные стерины, являющиеся структурными аналогами гормонов линьки и метаморфоз членистоногих. Они обнаружены не только в лекарственных, но и в пищевых растениях, то есть могут рассматриваться как минорные компоненты пищи.

20-гидроксиэкдизон (20Е), обладающий адаптогенным действием, был выделен из таких растений, как левзея сафлоровидная, серпуха венценосная, а также шпинат [2, 11]. Фитоэкдистероиды могут рассматриваться как адаптогены, то есть биологически активные соединения, способные повышать неспецифическую сопротивляемость организма к неблагоприятным воздействиям различной природы [6, 11].

Cоответственно, представляют интерес экспериментальные исследования влияния фитоэкдистероидов на биомаркеры общего адаптационного синдрома Селье как при отсутствии стрессорного воздействия, так и при его последующем проявлении. Множественность фармакологических эффектов в сочетании с низкой токсичностью одного из наиболее изученных фитоэкдистероидов 20Е позволяет использовать его в составе лекарственных препаратов [5] и биологически активных добавок (БАД) к пище, особенно в питании спортсменов [1, 3, 10]. Перспективным природным источником фитоэкдистероидов являются растения рода Serratula L (сем. Asteraceae), в частности серпуха венценосная (Serratula coronata), в наземной части которой содержание 20Е составляет около 2% в пересчете на сухую массу [11]. В водном экстракте наземных частей Serratula coronata, помимо 20-гидроксиэкдизона, присутствует другой мажорный экдистероид - 25S-инокостерон [2].

В данном сообщении представлены результаты экспериментального исследования влияния 15-дневного потребления фитоэкдистероидсодержащего экстракта Serratula coronata на некоторые показатели гормонального статуса и активность апоптоза в различных органах крыс-самцов линии Вистар.

Материал и методы

При проведении исследования использовали половозрелых крыс-самцов линии Вистар, полученных из питомника "Столбовая". Исследования на животных выполнены в соответствии с приказом Министерства здравоохранения и социального развития РФ от 23.08.2010 N 708н "Об утверждении Правил лабораторной практики" и требованиями, изложенными в Национальном стандарте РФ ГОСТ Р 53434-2009 "Принципы надлежащей лабораторной практики".

Половозрелые крысы-самцы Вистар, полученные из питомника "Столбовая", после 7-дневного карантина были помещены в отдельные клетки по одной особи в каждой, они получали стандартный общевиварный рацион [7], сбалансированный по содержанию основных макрои микронутриентов. Эксперимент проведен с использованием 24 животных, разделенных на 3 группы по 8 особей в каждой. Средние значения массы тела животных контрольной группы (1-й) и опытных групп (2-й и 3-й) перед началом эксперимента составили соответственно 127,6±2,5, 127,9±2,6 и 127,9±2,4 г.

Водный экстракт из листьев растения серпухи венценосной (Seratulla coronata L.) получали согласно [9]. Количественный анализ содержания фитоэкдистероидов в полученном водном сухом экстракте серпухи венценосной проводили методом ВЭЖХ на приборе "Agilent 1100 Series" (Agilent Technology, США) с дегазатором и насосом [18].

Пробу наносили на колонку Atlantis C18 4,6×250 мм, 5 мкм, скорость элюирования 0,9 мл/мин, подвижная фаза: вода (А) - ацетонитрил (В), аналитическая длина волны 247 нм, объем вводимой пробы - 10 мкл. Суммарное содержание фитоэкдистероидов в сухом экстракте составило 61,5 мг/г, концентрации 20Е и 25S-инокостерона - соответственно 40,6 и 14,2 мг/г.

Крысы 2-й и 3-й опытных групп вместо воды получали водный раствор этого экстракта из расчета 5 и 15 мг фитоэкдистероидов (суммарно) на килограмм массы тела. Животные контрольной группы получали в течение всего эксперимента воду. Крыс ежедневно осматривали, фиксировали объем выпитой жидкости и регулярно через сутки взвешивали. Продолжительность эксперимента составила 15 сут, по его окончании животных выводили из эксперимента декапитацией под легким эфирным наркозом и подвергали патологоанатомическому вскрытию для извлечения внутренних органов: тимуса, мозга и сердца; тимус взвешивали.

Кровь собирали в пробирки с предварительно добавленным раствором Трилона Б (1,25%, 400 мкл) и отделяли плазму крови центрифугированием при t=4 °С, 3000 об/мин в течение 25 мин на центрифуге "J-6B" ("Beckman", Австрия).

В плазме крови с использованием коммерческих наборов определяли содержание кортикостерона (набор "Corticosterone EIA kit", "Immunodiagnostic System", Великобритания), простагландина Е2 (набор "Rat Prostaglandin E2 (PGE2) ELISA Kit", "CUSABIO", Китай) и β-эндорфина (набор "Peptide Enzyme immunoassay (EIA) kit", "Bahem", США) иммуноферментным методом.

Содержание в плазме крови норадреналина определяли методом ВЭЖХ [8] c модификациями. Пробоподготовку тестируемых образцов проводили следующим образом: плазму крови (1-2 мл) фильтровали через шприцевой фильтр с размерами пор 0,2 мкм, добавляли 1/10 от объема плазмы 1,0 М Трис-HCl буфер (рН 8,6) и проверяли значение рН по универсальному индикатору.

Затем добавляли 30 мкл раствора внутреннего стандарта - 3,4-дигидробензиламина гидробромида ("ALDRICH", США) и количественно наносили на стеклянную микроколонку (0,5×1,0 см) с окисью алюминия (нейтральная, по Брокману II, "ХромРесурс", РФ), уравновешенную 0,1 М Трис-HCl буфером, рН 8,5-8,6. Промывали колонку 3,0 мл дистиллированной воды при центрифугировании со скоростью 1500 об/мин (центрифуга "ОПН-3", РФ) и затем элюировали катехоламины и 3,4-дигидробензиламина гидробромид 300 мкл 1,0 М уксусной кислоты при тех же режимах центрифугирования. Полученный смыв наносили на хроматографическую колонку (Nucleodur C18, 5 мкм, 250×5 мм), предварительно откалиброванную по стандартам определяемых катехоламинов (норадреналина, адреналина, "ALDRICH", США) и внутреннему стандарту. Состав подвижной фазы: 0,1 М фосфатно-цитратный буфер, рН 4,0, содержащий 50 мг/л ион-парного реагента (1-октансульфоновой кислоты натриевая соль для ВЭЖХ, "Dudley Chemical", США) и 2,5% ацетонитрила (квалификации "для ВЭЖХ"). Объем вводимого образца составлял 100 мкл. Скорость элюирования - 1,0 мл/мин.

В качестве детектора использовали амперометрический детектор (НПО "Химавтоматика, Россия, программное обеспечение "Мультихром 3", Россия) со стеклоуглеродным электродом и рабочим напряжением +1,0 В.

В изолированных клетках тимуса, сердца и головного мозга методом щелочного гель-электрофореза (метод ДНК-комет) определяли уровень ДНК-повреждений, а также процент апоптотических клеток (индекс апоптоза) [4]. Метод основан на регистрации различной подвижности ДНК и фрагментов ДНК лизированных клеток, заключенных в агарозный гель, в постоянном электрическом поле. При этом ДНК мигрирует к аноду, формируя электрофоретический след, напоминающий хвост кометы, параметры которого зависят от степени поврежденности исследуемой ДНК.

Микроскопический анализ проводили на микроскопе "Zeiss Axio Imager Z1" ("Zeiss", Германия) при увеличении 400×. Полученные изображения ДНК-комет (краситель SYBR Green I) анализировали с использованием программного обеспечения "Comet Imager system" ("Metasystems GmbH", Германия). В качестве показателя поврежденности ДНК использовали процентное содержание ДНК в хвосте ДНК-комет (% ДНК в хвосте). Апоптотическими считали клетки с содержанием ДНК в хвосте ДНК-кометы ≥75%. С каждого микропрепарата анализировали не менее 100 клеток [13, 14].

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета программ SPSS Statistics 20, используя непараметрический ранговый критерий Манна-Уитни и критерий Стьюдента. Критический уровень значимости нулевой статистической гипотезы (p) принимали равным 0,05.

Результаты и обсуждение

Общее состояние всех животных при ежедневном осмотре на протяжении всего эксперимента было удовлетворительным: по внешнему виду, качеству шерстного покрова, потреблению корма и воды, поведению и скорости роста не выявлено отличий у животных, потреблявших фитоэкдистероидсодержащий экстракт, по сравнению с животными контрольной группы. Прирост массы тела крыс всех групп соответствовал уровню прироста, характерному для животных данного вида и возраста. Относительное увеличение массы тела животных за весь эксперимент для контрольной группы 1 и опытных групп 2 и 3 составило соответственно 58,3±2,2, 59,9±2,3 и 59,3±2,3% и достоверно между группами не различалось.

Визуальная оценка и взвешивание тимуса не выявили каких-либо неблагоприятных изменений этого органа у животных всех групп.

В табл. 1 представлены результаты определения средних значений содержания кортикостерона, норадреналина, β-эндорфина и простагландина Е2 в плазме крови крыс всех групп по окончании эксперимента.

Статистически достоверно более низкие значения концентраций норадреналина обнаружены в плазме крови животных обеих опытных групп по сравнению с аналогичным показателем у животных контрольной группы. При этом самое низкое содержание этого катехоламина отмечено у крыс, потреблявших фитоэкдистероиды из расчета 15 мг/кг массы тела. Достоверных различий других определяемых биохимических показателей для всех трех групп животных не выявлено.

Cтатистически достоверное различие соотношения кортикостерон/норадренолин по сравнению с контрольной группой животных установлено также для крыс 3-й группы, потреблявших максимальную дозу фитоэкдистероидов, достоверных различий с опытной 2-й группой не выявлено (рисунок).



Как следует из данных, представленных в табл. 2, не выявлено достоверных различий в степени фрагментации ДНК и индексе апоптоза у животных, получавших фитоэкдистероидсодержащие экстракты, по сравнению с животными контрольной группы.

При обсуждении выявленного в работе достоверного снижения (по сравнению с животными контрольной группы) содержания норадреналина в крови крыс, потреблявших фитоэкдистероидсодержащий экстракт, приведем гипотетические предположения, выдвинутые авторами некоторых научных публикаций. Так, в работах [15-17] обсуждается возможная связь проявляемого биологически активными соединениями адаптогенного эффекта с их структурной схожестью с наиболее важными эндогенными стресс-медиаторами симпато-адреналовой и гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой систем: катехоламинами - активаторами стресссистемы - и кортикостероидами - ингибиторами стресс-системы, защищающими организм от чрезмерной реакции по отношению к стрессорному воздействию. Предполагается, что в отсутствие воздействия на организм экзогенного стрессора адаптоген сам способен играть роль мягкого прострессора, изменяющего соотношение наиболее важных активаторов и ингибиторов стресса. Такое сбалансированное адекватное изменение уровня наиболее важных стресс-медиаторов может снижать их "избыточное" возрастание при последующем стрессорном воздействии [12]. 20-гидроксиэдизон и 25S-инокостерон - это полигидроксилированные стерины, химическая структура которых близка структуре кортикостерона - основного и наиболее активного глюкокортикостероида у крысы.

Как было показано в условиях данного эксперимента, потребление лабораторными животными фитоэкдистероидсодержащего экстракта привело к дозозависимому снижению содержания норадреналина в крови и достоверному повышению соотношения кортикостерон/норадреналин, выявляемому при наибольшей дозе потребляемых фитоэкдистероидов. Выяснение вопроса о том, может ли такое изменение благоприятно повлиять на адаптацию животного к дисстрессу, должно стать предметом наших дальнейших исследований. Как было установлено, ежедневное потребление крысами в течение 15 дней экстракта серпухи венценосной из расчета 5 и 15 мг фитоэкдистероидов на 1 кг массы тела не влияло на активность апоптоза. Отсутствие повышения активности апоптоза в клетках сердца, мозга и тимуса у крыс, потреблявших тестируемый экстракт, может свидетельствовать в пользу безопасности его использования в питании этих животных.

Исследования выполнены при частичной финансовой поддержке программы президиума РАН "Фундаментальные науки - медицине" (проект № 12-П-4-1023: "Научные основы создания адаптогеннных и геропротекторных средств растительного происхождения").

Литература

1. Бойко Е.Р., Володин В.В., Мартынов Н.А. и др. Сочетанное влияние витаминно-минерального комплекса Витабаланс-мультивит и БАД "Серпистен" на физическую работоспособность лыжников-гонщиков высокой квалификации // Сб. материалов IV Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участ. "Спорт и медицина. Сочи-2013". 19-22 июня 2013 г. - Сочи, 2013. - С. 34-36.

2. Володин В.В., Матаев С.И. Экдистероидсодержащие растения - источники новых адаптогенов // Вестн. биотехнологии. - 2011. - Т. 7, № 2. - С. 52-59.

3. Володин В.В., Сидорова Ю.С., Мазо В.К. 20-гидроксиэкдизон - растительный адаптоген: анаболическое действие, возможное использование в спортивном питании // Вопр. питания. - 2013. - Т. 82, № 6. - С. 24-31.

4. Дурнев А.Д., Жанатаев А.К., Анисина Е.А. и др. Применение метода щелочного гель-электрофореза изолированных клеток для оценки генотоксических свойств природных и синтетических соединений: Методические рекомендации. - М., 2006. - 27 с.

5. Куракина И.О., Булаев В.М. Экдистен - тонизирующее средство в таблетках по 0,005 г // Новые лекарственные препараты. - М., 1990. - Вып. 6. - С. 16-18.

6. Лазарев, Н.В., Люблина Е.И., Розин М.А. Состояние неспецифически повышенной сопротивляемости // Пат. физиол. - 1959. - Т. 3, № 2. - С. 16-21.

7. Приказ МЗ СССР № 1179 от 10.10.1983 "Об утверждении нормативов затрат кормов для лабораторных животных в учреждениях здравоохранения".

8. Сидорова А.А., Карцова Л.А. Хроматографическое и электрофоретическое определение катехоламинов, метанефринов и 3,4-дигидроксифенилаланина в моче и плазме крови // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2009. - Т. 9, вып. 6. - С. 774-782.

9. Сидорова Ю.С., Зорин С.Н., Василевская Л.С. и др. Влияние внутрижелудочного введения фитоэкдистероидов на некоторые показатели гормонального статуса крыс линии Вистар // Вопр. питания. - 2013. - Т. 82, № 4. - С. 22-26.

10. Сыров Н.В. Фармокологическая оценка фитоэкдистероидов и созданных на их основе препаратов как потенциальных стимуляторов психической и физиологической активности в нормальных и осложненных условиях // 5-я междунар. конф. "Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам". - М., 2010. - С. 84-85.

11. Фитоэкдистероиды / Под ред. В.В. Володина. - СПб.: Наука, 2003. - 293 с.

12. Яременко К.В. Оптимальное состояние организма и адаптогены. - СПб.: ЭЛБИ-СПб, 2008. - С. 129.

13. Chandna S. Single-cell gel electrophoresis assay monitors precise kinetics of DNA fragmentation induced during programmed cell death // Cytometry A. - 2004. - Vol. 61, N 2. - P. 127-133.

14. Smith C.C., Adkins D.J., Martin E.A. et al. Recommendations for design of the rat comet assay // Mutagenesis. - 2008. - Vol. 23, N 3. - P. 233-240.

15. Panossian A., Wikman G., Wagner H. Plant adaptogens III. Earlier and more recent aspects and concepts on their mode of action // Phytomedicine. - 1999. - Vol. 6, N 4. - P. 287-300.

16. Panossian A., Wikman G. Effect of adaptogens on the central nervous system // Arq. Bras. Fitomed. Cientifica. - 2005. - Vol. 3, N 1. - P. 29-51.

17. Panossian A.G. Adaptogens: A historical overview and perspective // Nat. Pharmacy. - 2003. - Vol. 7 (4), N 1. - P. 19-20.

18. Zimmer Aline R., Bruxel Fernanda. HPLC method for the determination of ecdysterone in extractive solution from Pfaffia glomerata // J. Pharm. Biomed. Anal. - 2006. - Vol. 40. - P. 450-453.