Method of quantitative content soya protein determination in cooked meats using indirect immune-enzyme analysis

AbstractWith the help of immune-enzyme analysis the amount of soy protein was determined in cooked meats. The results obtained are subjected to mathematical processing, also shows the metrological performance of the method.

Keywords:soy protein isolate, indirect immune-enzyme analysis

Одной из важнейших задач контроля безопасности и качества мясной продукции является количественное определение растительных компонентов, вводимых производителем в пищевые продукты. Наиболее широко применяемым растительным компонентом, используемым при производстве мясной продукции, является соевый белок [1-4]. Это обусловлено прежде всего тем, что по биологической ценности соевые белки близки к белкам животного происхождения [1, 5]; при этом немаловажную роль играет влагосвязывающая и жироэмульгирующая способность соевого белка [6]. В настоящее время установить присутствие соевого белка в мясной продукции можно лишь с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) [2, 3]. Более сложной задачей является количественное определение растительных белков, вводимых производителем в мясные продукты. Метод непрямого (конкурентного) иммуноферментного анализа (ИФА), разработанный нами, является одним из возможных подходов для решения указанной задачи [7, 8].

Предлагаемый метод относится к твердофазному непрямому (конкурентному) иммуноферментному определению белкового антигена. Он, как известно [7], основан на конкуренции предварительно иммобилизованных на твердой поверхности (лунке полистирольного планшета) антигенов (соевых белков) и находящихся в растворе антигенов образца исследуемого пищевого продукта за центры связывания специфичных к этим антигенам антител, которые вносят в тот же раствор. В результате конкуренции количество антител, фиксируемых на твердой поверхности, оказывается в обратной зависимости по отношению к содержанию антигенов образца исследуемого пищевого продукта в растворе. После удаления раствора антител, связанных с антигенами образца исследуемого пищевого продукта, добавляют вторичные антивидовые антитела, конъюгированные с ферментом, в частности с пероксидазой. Вторичные антитела, оставшиеся в растворе (т.е. не прореагировавшие с антителами к антигену - соевому белку), удаляют. Затем в систему добавляют раствор хромогенного субстрата. Пероксидаза, конъюгированная со вторичными антителами, расщепляет хромогенный субстрат с образованием окрашенного продукта. При этом количество определяемого антигена, содержащегося в исследуемом образце пищевого продукта, обратно пропорционально концентрации вещества, образовавшегося в результате ферментативной реакции, и может регистрироваться по оптической плотности раствора при длине волны, соответствующей максимуму поглощения вещества.

Нашей целью была разработка непрямого твердофазного иммуноферментного метода количественного определения изолята соевого белка (ИСБ) в составе колбасных изделий. Материал и методы

Разработанный метод апробирован на контрольных образцах колбасных изделий, содержащих заранее известное количество изолята соевого белка, которые были любезно предоставлены ГНУ ВНИИМП им. В.М. Горбатова Россельхозакадемии. С помощью разработанной методики проанализированы образцы колбасных изделий отечественных производителей.

Анализируемый образец измельчали с использованием лабораторного гомогенизатора. Далее 12,0±0,1 г гомогенизированной пробы помещали в стакан диспергатора, вносили 48 мл фосфатносолевого буфера (ФСБ) и размельчали образец исследуемого мясопродукта до однородной массы при 24 000 об/мин. Каждую пробу анализировали 3 раза, т.е. готовили 3 экстракта анализируемого образца. Для этого брали 3 аликвоты по 0,25 мл диспергата, переносили их в 3 конические колбы и взвешивали на аналитических весах. Массу каждой аликвоты 0,25 мл учитывали в дальнейших расчетах. В каждую колбу вносили по 2,5 мл экстрагента "RIDA Extraction Solution" (ЭБ-1). Колбы закрывали крышками и нагревали при 60 °С в течение 90 мин (периодически встряхивая вручную). Затем в колбы вносили по 7,5 мл раствора экстрагирующего буфера "RIDASCREEN Allergen extraction buffer" (ЭБ-2), предварительно нагретого до 60 °С, и проводили инкубацию в течение 90 мин на нагревательной плите при 60 °С (периодически встряхивая вручную). Затем полученные экстракты охлаждали до комнатной температуры. Смешивали в отдельном флаконе 0,8 мл 0,5% раствора нормальной лошадиной сыворотки (НЛС) в ФСБ и 0,2 мл экстракта анализируемого образца колбасного изделия, получая исходные разведения исследуемых образцов.

В качестве стандарта использовали предоставленный компанией ООО "Стайлаб" аттестованный образец ИСБ с содержанием белка 83,4±0,3% (производство "Sypro Hamburg", Германия). Навеску ИСБ (50,0±0,1 мг) растворяли в 2,5 мл ЭБ-1 при 60 °С в течение 90 мин. Затем вносили 7,5 мл ЭБ-2 и проводили инкубацию в течение 90 мин при 60 °С. Полученный раствор охлаждали до комнатной температуры и доводили объем до 100 мл 0,5% водным раствором нормальной лошадиной сыворотки. Полученный стандарт разливали по 2,0 мл в стеклянные флаконы (вместимостью 20 мл) и подвергали лиофильному высушиванию. Стандартный раствор ИСБ готовили, количественно перенося лиофилизованный стандарт ИСБ в мерный цилиндр и добавляя 0,5% раствор НЛС в ФСБ (НЛС-ФСБ) до конечного объема 20 мл.

Сенсибилизацию планшета проводили следующим образом. К 1,0 г ИСБ добавляли 10,0 мл ФСБ; полученную смесь помещали на 3 ч на лабораторный встряхиватель при комнатной температуре. Затем взвесь центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин и отбирали супернатант. Разводили супернатант в соотношении 1/100 в 0,1 М бикарбонатном буфере рН 9,7-9,8, содержащем азид натрия, и использовали его как сенсибилизирующий раствор. В лунки планшета вносили по 0,1 мл сенсибилизирующего раствора, планшет закрывали крышкой и помещали на 16 ч в холодильник при температуре 4 °С.

Перед проведением анализа двукратно отмывали лунки планшета раствором фосфатно-солевого буфера с 0,1% Твина-20. Затем добавляли в каждую лунку по 0,2 мл 1% раствора желатина и инкубировали 30 мин при комнатной температуре. Лунки планшета 3-кратно отмывали раствором фосфатно-солевого буфера с 0,1% Твина-20, после чего в них добавляли растворы (см. схему):

- в лунки A1-В1 планшета - по 0,1 мл стандартного раствора ИСБ;

- в лунки С1-D1 - 0,1 мл исходного разведения 1-го экстракта из анализируемого образца (П1);

- в лунки Е1-F1 - 0,1 мл исходного разведения 2-го экстракта из анализируемого образца (П2);

- в лунки G1-Н1 - 0,1 мл исходного разведения 3-го экстракта из анализируемого образца (П3);

- в лунки А12-Н12 - 0,1 мл НЛС-PBS;

- в лунки А2-Н11 - 0,1 мл кроличьей антисыворотки против соевого белка в разведении 1:4000 в НЛС-ФСБ.

Тотчас после описанной процедуры добавляли в лунки А1-Н1 по 0,1 мл антисыворотки в разведении 1:2000 в НЛС-ФСБ и титровали ряды 1-10 в серии двоичных разведений с помощью 8-канальной пипетки с установленным объемом 0,1 мл. Планшет инкубировали на встряхивателе в течение 2 ч при комнатной температуре, после чего лунки планшета 4-кратно отмывали раствором фосфатно-солевого буфера с 0,1% Твина-20.

Затем в каждую лунку добавляли по 0,1 мл раствора конъюгата и оставляли на инкубацию в течение 90 мин при комнатной температуре. После инкубации 5-кратно отмывали лунки планшета раствором фосфатного моющего буфера и вносили в каждую лунку по 0,1 мл раствора субстрата, потом вновь инкубировали 20 мин при 37 °С в воздушном термостате.

Разметка планшета при определении изолятов соевых белков в колбасных изделиях

На последней стадии анализа в каждую лунку добавляли по 0,1 мл стоп-реагента и не более чем через 60 мин после его добавления измеряли оптическую плотность в каждой лунке при длине волны 492 нм на планшетном фотометре.

Расчеты проводили с использованием пакета программ Microsoft Excel. Среднее значение оптических плотностей растворов в лунках ряда А12-Н12 (НССср) вычитали из значений всех оптических плотностей растворов в остальных лунках, используя функцию автоматического вычета фона прибора "Эфос9305".

Для построения калибровочной кривой стандартного раствора ИСБ рассчитывали процент связывания конъюгата для каждого разведения стандартного раствора ИСБ по формуле:

J(n) (%) = 100 Ч (Б0(n) - Бn)/Б0(n), (1)

где J(n) (%) - процент связывания конъюгата; Б0(n) - среднее значение (из двух параллельных измерений) оптической плотности для нулевого связывания; Бn - среднее значение (из двух параллельных измерений) оптической плотности для каждого разведения стандартного раствора ИСБ.

Строили калибровочную кривую стандартного раствора ИСБ в следующих координатах: ось абсцисс - процент связывания конъюгата (J, %), ось ординат - десятичный логарифм концентрации стандартного раствора ИСБ (мкг/мл) (lg C(мкг/мл)) (рис. 1). По калибровочной кривой стандартного раствора ИСБ методом линейной интерполяции рассчитывали логарифм концентрации стандартного раствора ИСБ, соответствующей 50% связыванию конъюгата:

lg (ИБС, 50%)= lg С1ст + (50 - J1ст) Ч

(lg С2ст - lg С1ст)/ (J2ст - J1ст), (2)

где lg (ИБС, 50%) - десятичный логарифм концентрации стандартного раствора ИСБ, соответствующей 50% связыванию конъюгата; lg С1ст - десятичный логарифм концентрации стандартного раствора ИСБ, соответствующей ближайшему разведению, при котором связывается более 50% конъюгата; lg С2ст - десятичный логарифм концентрации стандартного раствора ИСБ, соответствующей ближайшему разведению, при котором связывается менее 50% конъюгата; J1ст - % связывания конъюгата, соответствующий lg С1ст; J2ст - % связывания конъюгата, соответствующий lg С2ст.

Рассчитывали концентрацию стандартного раствора ИСБ, соответствующую 50% связыванию конъюгата, по формуле: С ИСБ 50% = 10 lg (ИСБ, 50%), (3)

где СИСБ 50% (мкг/мл) - концентрация стандартного раствора ИСБ, соответствующая 50% связыванию конъюгата; lg (ИСБ, 50%) - логарифм концентрации стандартного раствора ИСБ, соответствующей 50% связыванию конъюгата.

Рассчитывали концентрацию раствора исследуемого образца, соответствующую первому разведению (ряд 1 полистирольной планшеты) по формуле:

С (мкг/мл) = 1000 Ч m/250, (4)

где С (мкг/мл) - концентрация раствора исследуемого образца мясопродукта в 1-м разведении; m - масса 0,25 мл диспергата, мг (см. выше).

Рассчитывали процент связывания конъюгата для каждого разведения раствора анализируемого образца мясопродукта по формуле:

J(n) (%) = 100 Ч (Б0(n) - Бn)/Б0(n), (5)

где J(n) (%) - процент связывания конъюгата; Б0(n) - среднее значение (из двух параллельных измерений) оптической плотности для нулевого связывания; Б(n) - среднее значение (из двух параллельных измерений) оптической плотности для каждого разведения раствора анализируемого образца.

Рис. 1. Калибровочная кривая стандартного раствора изолята соевого белка

Рис. 2. Кривая раститровки двоичных разведений раствора исследуемого образца

Далее строили кривую раститровки двоичных разведений раствора исследуемого образца мясопродукта в следующих координатах: ось абсцисс - процент связывания конъюгата (J (%)), ось ординат - десятичный логарифм концентрации раствора исследуемого образца (lg C(мкг/мл)) (рис. 2).

По кривой раститровки двоичных разведений раствора исследуемого образца мясопродукта методом линейной интерполяции рассчитывали логарифм концентрации раствора исследуемого образца мясопродукта, соответствующий 50% связыванию конъюгата:

lg (П, 50%) = lg С1П + (50 - J1П) Ч (lg С2П - Lg С1П)/(J2П - J1П), (6)

где lg (П, 50%) - десятичный логарифм концентрации раствора исследуемого образца мясопродукта, соответствующей 50% связыванию конъюгата; lg С2П - десятичный логарифм концентрации раствора исследуемого образца, соответствующей ближайшему разведению, при котором связывается менее 50% конъюгата; lg С1П - десятичный логарифм концентрации раствора исследуемого образца, соответствующей ближайшему разведению, при котором связывается более 50% конъюгата; J2П - % связывания метки, соответствующий lg С2П; J1П - % связывания метки, соответствующий lg С1П.

Концентрацию раствора исследуемого образца мясопродукта, соответствующую 50% связыванию конъюгата, рассчитывали по формуле: С П 50% = 10 lg (П, 50%), (7)

где СП 50% - концентрация раствора исследуемого образца мясопродукта, соответствующая 50% связыванию конъюгата; lg (П, 50%) - десятичный логарифм концентрации раствора исследуемого образца мясопродукта, соответствующей 50% связыванию конъюгата.

Рассчитывали содержание ИСБ в исследуемом образце мясопродукта в граммах на 100 г колбасного изделия по формуле:

ИСБ = 100 Ч С ИСБ 50%/ С П 50%, (8)

где ИСБ - содержание ИСБ в исследуемом образце мясопродукта, г/100 г; СИСБ 50% - концентрация стандартного раствора ИСБ, соответствующая 50% связыванию конъюгата; СП 50% - концентрация раствора исследуемого образца мясопродукта, соответствующая 50% связыванию конъюгата.

Результаты и обсуждение

В ходе проделанной работы рассчитаны метрологические показатели методики количественного определения ИСБ в колбасных изделиях с помощью конкурентного ИФА. Для диапазона концентраций ИСБ 0,2-1,0 г/100 г предел повторяемости (rm) и предел воспроизводимости (Rm) составили соответственно 0,1 и 0,2 г/100 г, а предел точности (Δ) - 0,1 г/100 г, для диапазона концентраций ИСБ 1,0-10,0 г/100 г - соответственно 0,6 и 0,9 г/100 г, предел точности (Δ) - 0,5 г/100 г. Метрологические показатели рассчитывали в соответствии с [9].

С помощью разработанной методики проанализированы 20 образцов колбасных изделий отечественных производителей. Содержание ИСБ в интервале значений 0,9-2,6 г/100 г было определено в 4 колбасных изделиях, 3 из них изготовлены по ТУ и 1 - по ГОСТу. В остальных изделиях содержание ИСБ составило до 0,1%, что соответствует погрешности метода.

Таким образом, разработанный метод определения ИСБ в мясопродуктах позволяет установить содержание соевого белка (при концентрации >0,2% в образце) с погрешностью ±15%, что соответствует обычным значениям для ИФА, проводимого непрямым (конкурентным) методом. Как указано выше, разработанный нами метод определения ИСБ в колбасных изделиях с помощью конкурентного ИФА является одним из основных подходов при количественном определении соевых белков в мясной продукции.

Литература

1. Тутельян В.А., Погожева А.В., Высоцкий В.Г. Клиникогигиенические аспекты применения сои. - М.: Фонд "Новое тысячелетие", 2005. - 257 с.

2. Egbert R. Soy protein in the food processing industry, in: proceedings of world soybean research conference VI. - Сhicago, 1999. - P. 403-408.

3. Махотина И.А., Елисеева Л.Г., Евдокимова О.В. // Товаровед продовольственных товаров. - 2009. - № 7. - C. 5-8.

4. Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б. и др. Теория и практика иммуноферментного анализа. - М.: Высш. шк., 1991. - 288 c.

5. Macedo-Silva A., Shimokomaki M., Vaz A.J. et al. // J. Food Compos. Anal. - 2001. - Vol. 14, N 5. - P. 469-478.

6. РМГ 61-2003. Показатели точности, правильности, прецизионности методик количественного химического анализа. - М., 2003 - 46 с.