Determination of chondroitin sulfate in food supplements by capillary zone electrophoresis

AbstractChondroitin sulfate is widely used as an ingredient in food supplements. A method of capillary zone electrophoresis for qualitative and quantitative analysis of chondroitin sulfate in food supplements has been developed. The system of capillary electrophoresis Agilent 3D CE (USA) with diode array detector (spectral range 190–400 nm, 192 nm was used to quantity), quartz capillary Agilent with effective length 56 cm (USA) (internal diameter 50 μm, temperature 25 °C, 30 kV, negative polarity) and 50 mM phosphate buffer (рН 3,5) has been used. Quantity limit of this method was 0,5 g/kg. It was used for determination of content of chondroitin sulfate in 14 food supplements. The chondroitin sulfate was detected in all test samples with deviation from the declared content (25–600 mg per capsule or tablet) at the level of 1 to 9%. The applicability of the elaborated method for assessing of food supplements quality has been shown.

Keywords:chondroitin sulfate, capillary electrophoresis

Вопр. питания. - 2013. - № 3. - С. 67-71.

Хондроитин сульфат (ХС) широко представлен в качестве одного из активных ингридиентов в составе биологически активных добавок (БАД) к пище. На данный момент в России зарегистрировано более 140 БАД к пище, содержащих ХС (по данным Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека). БАД к пище, содержащие ХС, как правило, используются для профилактики ряда нарушения опорно-двигательного аппарата. ХС в составе БАД к пище характеризуется достаточно хорошей биодоступностью - в системный кровоток поступает около 12-15% ХС, причем, как было показано в эксперименте, большая часть абсорбированного ХС, меченного изотопами, обнаруживается в синовиальной ткани и суставном хряще [4].

Основным источником ХС являются хрящевая ткань крупного рогатого скота, свиней, а также птицы (куры) и акул [1, 6]. В последние годы для его производства стали также использовать ткани гидробионтов. Современные методы получения ХС представляют собой многостадийные процессы экстракции, а выход конечного продукта и его чистота не всегда высоки [5]. В связи с этим актуальным является вопрос стандартизации БАД к пище, содержащих ХС.

По химической структуре ХС представляет собой сульфатированный глюкозаминогликан, состоящий из длинных неразветвленных полисахаридных цепей с повторяющимися остатками N-ацетилгалактозамина и глюкуроновой кислоты (общей сложностью до 100 углеводных остатков). Большинство N-ацетилгалактозаминовых остатков сульфатированы в 4-м и 6-м положениях. Полисахаридные цепи, образуя ковалентные связи с белками, формируют протеогликаны, которые совместно с макромолекулами коллагена (главным образом II типа) обеспечивают уникальные свойства экстрацеллюлярного матрикса: растяжимость ткани и ее устойчивость к компрессии. Молекула ХС обладает полианионными свойствами, благодаря чему участвует в транспорте воды, аминокислот и липидов в аваскулярных участках хряща, что обеспечивает вязкоэластичные и механические свойства ткани [1, 6, 5].

Для качественной и количественной оценки ХС используют высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) и капиллярный электрофорез (КЭ). Описаны различные методики определения ХС методом ВЭЖХ. Чаще всего используется градиентный тип элюирования, а для детектирования применяют спектрофотометрический детектор на диодной матрице, а также масс-спектрометрическое или флуорометрическое (после дериватизации) детектирование [7, 8, 10, 15, 17, 18]. Оптимальным представляется использование КЭ в связи с ионогенными свойствами исследуемого вещества. Метод основан на принципе разной скорости миграции заряженных частиц и молекул в постоянном электрическом поле [2, 3]. При помощи КЭ исследуют различные группы биологически активных соединений, в том числе и глюкозаминогликаны. Существуют различные варианты методик КЭ для исследования ХС в составе различных объектов (табл. 1). Недостатком описанных методик является невозможность их применения для анализа содержания ХС в пищевых продуктах, в том числе в БАД к пище, без адаптации предложенных условий.

Таким образом, целью работы являлась разработка методики определения ХС методом капиллярного зонального электрофореза в БАД к пище и специализированных пищевых продуктах.

Материалы и методы

Электрофоретическое разделение проводили на системе КЭ Agilent 3D CE (США) с диодноматричным детектором, на кварцевом капилляре Agilent Lэ/Lо=56/64 см (США), внутренний диаметр капилляра 50 мкм; температура термостата 25 °С; эффективное напряжение 30 кВ; полярность отрицательная. Общее время анализа 20 минут. Детектирование проводили при длине волны 192 нм. Ввод пробы осуществляли гидродинамически (300 мбар/10 с) автосемплером.

Перед началом работы капилляр последовательно промывали 0,1 М раствором натрия гидроксида, деионизированной водой и рабочим буфером (50 мМ фосфатный буфер, рН=3,5). Этот же буфер использовали для анализа ХС.

Центрифугирование образцов проводили на центрифуге Eppendorf 5418 (Германия), встряхивание - на шейкере Biosan OS-10 (Латвия), озвучивание - на УЗ-ванне CTBRAND (Китай).

Для приготовления буфера использовали деионизированную воду (Milli-Q, США), а также однозамещенный фосфат натрия, моногидрат марки "ч.д.а.", фосфорную кислоту марки "ч.д.а.". Для пробоподготовки применяли дистиллированную воду.

Таблица 1. Условия определения хондроитин сульфата методом капиллярного электрофореза

Стандартные вещества и приготовление стандартных растворов

В качестве стандартного вещества использовали субстанцию натриевой соли ХС, полученную из коровьего хряща (Chondroitin sulfate sodium salt from bovine cartilage 100%, Sigma-Aldrich). Готовили рабочие стандартные растворы с концентрацией 0,1; 0,2; 0,4; 1,0 и 2,0 мг/см3, при необходимости озвучивая на УЗ-ванне до полного растворения вещества, и центрифугировали их 10 мин при 20 000g. Стандартные рабочие растворы хранили при температуре 2-8 °С в течение одной недели.

Объекты исследования. В качестве объектов исследования были выбраны содержащие ХС БАД к пище и специализированные пищевые продукты (14 образцов), приобретенные в аптеках Москвы.

Подготовка проб. Около 0,5-2,0 г (точная навеска) тщательно измельченного образца помещали в мерную колбу вместимостью 100 см3, экстрагировали 50 см3 воды очищенной, встряхивали на шейкере в течение 10 мин, озвучивали на УЗ-ванне в течение 2 мин. Далее доводили объем раствора образца до метки деионизированной водой и перемешивали. Полученный раствор центрифугировали в течение 10 мин при 20 000 g и анализировали надосадочную жидкость.

Условия электрофоретического разделения

Рабочий буфер. Для анализа ХС использовали 50 мМ фосфатный буферный раствор, рН 3,5, который предварительно фильтровали через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм.

Перед работой новый капилляр последовательно промывали 5 мин 1 М раствором натрия гидроксида, 5 мин деионизированной водой и 5 мин рабочим буфером. Между анализами для промывки капилляра использовали следующую схему: 3 мин 0,1 М раствором натрия гидроксида, 3 мин деионизированной водой и 3 мин рабочим буфером.

Детектирование. Детектирование ХС проводили на спектрофотометрическом детекторе на диодной матрице при длине волны 192 нм (диапазон 190-400 нм). Выбор длины волны объясняется стремлением достичь наибольшей чувствительности методики. ХС на электрофореграмме идентифицировали путем сравнения со стандартом по времени миграции и спектру в УФ-области спектра. В качестве примера идентификации ХС в предложенных условиях на рис. 1 и 2 приведены электрофореграммы стандартного раствора и БАД к пище. Количественное содержание ХС оценивали методом абсолютной градуировки по внешнему стандарту.

Результаты и обсуждение

При помощи разработанной методики было определено содержание ХС в составе 14 БАД к пище и специализированных пищевых продуктов (см. табл. 2). Декларированное значение ХС составляло от 25 до 600 мг в 1 капсуле или таблетке (или 44,6-375 мг/г). В одном случае исследовали раствор с содержанием ХС 4 г/100 см3. По результатам проведенных исследований ХС был обнаружен во всех испытуемых образцах с отклонением от заявленного содержания на уровне от 1 до 9% (в растворе отклонение составило 5%).

Рис. 1. Электрофореграмма стандартного раствора хондроитин сульфата

Рис. 2. Электрофореграмма биологически активного вещества к пище, содержащего хондроитин сульфат

Предел повторяемости предложенной методики составил 14%, предел воспроизводимости - 8%, показатель точности - 23%.

Таким образом, разработанная методика может быть использована в целях контроля качества БАД к пище, содержащих ХС. Нижний предел количественного определения составил 0,5 г/кг, что позволяет проводить определение содержания ХС в БАД к пище и специализированных пищевых продуктах.

Таблица 2. Содержание хондроитин сульфата в биологически активных добавках к пище и специализированных пищевых продуктах

Литература

1. Алексеева Л.И., Шарапова Е.П. // РМЖ. - 2009. - № 21. - С. 14-48.

2. Богачук М.Н., Бессонов В.В., Передеряев О.И. // Вопр. питания. - 2011. - № 3. - С. 67-74.

3. Богачук М.Н., Передеряев О.И., Раменская Г.В. // Вопр. биол., мед. и фармацевт. химии. - 2011. - № 9. - С. 14-22.

4. Горячев Д .В. // РМЖ. - 2008. - Т. 16, № 10. - С. 693-698.

5. Порцель М.Н. Разработка технологии получения хондроитин сульфата из гидробионтов Баренцева моря и изучение его физико-химических свойств: Автореф. дис. - канд. техн. наук. - Мурманск, 2011. - С. 3.

6. Шкарина Т .Н. Анализ и стандартизация хондроитин сульфата натрия: Автореф. дис. - канд. фармацевт. наук. - М., 2009. - 24 с.

7. David J.I., Mark R., Joseph Z. et al. // J. AOAC Int. - 2007. - Vol. 3, N 90. - P. 659-669.

8. Deakin G.A., Lyon M. // Glycobiology. - 2008. - Vol. 18, N 6. - P. 4 8 3 - 4 9 1.

9. Elisabetta Z., Antonio Junior L., Antonio C. et al. // Biochem. Res. Int. - 2011. - Vol. 2012. - Article ID 281284.

10. Frazier S.B., Roodhouse K.A., Hourcade D.E. et al. // Open Glycosci. - 2008. - Vol. 1. - P. 31-39.

11. Hitchcock A.M., Bowman M.J., Staples G.O. et al. // Electrophoresis. - 2008. - Vol. 22, N 29. - P. 4538-4548.

12. Malavaki C.J., Athanasia P., Lamari F.N. et al. // Anal. Biochem. - 2008. - Vol. 374. - P. 213-220.

13. Marco G., Zhenqing Z., Zachary S. et. al. // PNAS. - 2009. - Vol. 106, N 40. - P. 16956-16961;

14. Sadatoshi M., Takayoshi M., Janet K. et al. // J. Vet. Med. Sci. - 2001. - Vol. 9, N 63. - P. 1039-1043;

15. Solakyildirim K., Zhang Z., Linhardt R.J. // Anal. Biochem. - 2010. - Vol. 1, N 397. - P. 24-28.

16. Zamfir A., Seidler D.G., Kresse H. et al. // Glycobiology. - 2003. - Vol. 13,- N 11. - P. 733-742.

17. Zhenling L., Zhongping X., Sayaka M. et al. // Anal. Biochem. - 2011. - Vol. 1, N 408. - P. 147-156.

18. Zhou J.Z., Waszkuc T., Mohammed F. // J. AOAC. - 2004. - Vol. 87, N 5. - P. 1083-1092.