Colon lactoflora of rats with alimentary polyhypovitaminosis and modified fat component of diet

Abstract

The examination was carried out on male Wistar rats with an initial weight 97–121 g. Influence of vitamin provision and composition of fat component in semisynthetic diet on the condition of lactoflora population of intestine were studied. The deficiency of vitamins was caused by fivefold decrease of amount of vitamin mixture added to the feed and by elimination of vitamin E from this mixture. The modification of fat component was made by substitution of sunflower oil for linseed oil in equal amount (the ratio of vegetable oil and animal fat (lard) was 1:1). Duration of the first phase of the experiment was 28 days. Vitamin deficiency in rats, receiving feed with sunflower oil, was accompanied by significant decrease of vitamins A, E, B1 and B2 in the liver, but did not affect the quantity of lactobacilli in caecum content of rats. Enrichment of the diet deficient in vitamins with polyunsaturated omega 3 fatty acids was associated with a statistically significant increase in number of lactobacilli in the intestine compared with the control group (9,78±0,08 opposite 8,82±0,33 lg CFU/g, р=0,018) and group of rats with vitamin deficiency (9,03±0,18 lg CFU/гg р=0,006). On the second stage, replenishment of vitamin deficiency was carried out in the next 14 days by increasing the amount of vitamin mixture to 70 and 200% of vitamin content from a diet in control group. The replenishment has not affected the number of caecum lactobacilli irrespectively of the dose of vitamins and fatty component.

Keywords:alimentary polyhypovitaminosis, polyunsaturated omega-3 fatty acids, linseed oil, caecum, lactobacilli, rats

Вопр. питания. - 2013. - № 2. - С. 66-69.

Микрофлора кишечника, как известно, является мощным фактором, влияющим на естественную неспецифическую резистентность организма и состояние метаболических процессов в нем. Большую роль в этом играют облигатные резидентные популяции нормальной микрофлоры пищеварительного тракта - бифидо- и лактобактерии. Однако механизм влияния лактофлоры желудочнокишечного тракта (ЖКТ) на модуляцию иммунитета, толерантность к пищевым и микробным антигенам, метаболизм макро- и микронутриентов до конца не изучены [1, 2, 8, 10], поэтому при коррекции пищевых рационов важно знать реакцию резидентной лактофлоры кишечника на поступающие в организм с пищей нутриенты и биологически активные вещества. Целью настоящей работы было исследование влияния витаминной обеспеченности и состава жирового компонента рациона крыс на состояние популяций лактофлоры толстой кишки.

Материал и методы

Указанные эксперименты проводили на крысах-самцах массой тела 97-121 г, полученных из питомника НЦБМТ РАМН "Столбовая".

Животные после 5-дневного нахождения на рационе вивария были разделены на контрольную и 2 опытные группы. Животные контрольной группы (12 крыс) получали в течение всего эксперимента (в течение 42 дней) полноценный полусинтетический рацион. Рацион содержал 20% казеина по ГОСТ 536672009 (содержание белка 82-84%), 64% кукурузного крахмала, 9% жира (смесь подсолнечного масла и лярда 1:1), 3,5% солевой смеси, 1% смеси витаминов, 0,3% L-цистеина, 0,25% холина битартрата, 2% микрокристаллической целлюлозы.

Животные 1-й и 2-й опытных групп (по 18 крыс в каждой группе) получали в течение 28 дней рацион, дефицитный по содержанию всех витаминов. Дефицит витаминов в рационе вызывали уменьшением количества добавляемой в корм витаминной смеси в 5 раз. Это достигали тем, что в корм животных указанных опытных групп добавляли смесь витаминов лишь в количестве 20% от их содержания в полноценном рационе крыс контрольной группы. Одновременно из корма животных указанных опытных групп исключали D,L-α-токоферола ацетат [2, 3]. Рацион крыс 2-й опытной группы был не только дефицитным по содержанию витаминов, но и модифицированным по жировому составу. Модификация жирового компонента рациона заключалась в замене подсолнечного масла на льняное в равном количестве на сухой вес рациона при сохранении его пропорции 1:1 с жиром животного происхождения (лярд).

По истечении 28 дней эксперимента крысы обеих опытных групп были разделены на 2 подгруппы (по 9 животных в каждой) и составили соответственно 3, 4, 5 и 6-ю опытные группы. Животные этих групп в течение 14 дней получали рацион с восполненным уровнем витаминов в пределах от 20 до 70% (3-я и 5-я группы) и 200% (4-я и 6-я группы) от содержания в витаминной смеси рациона животных контрольной группы.

Корм (средневзвешенное количество 15 г/сут) и воду животные всех групп получали ad libitum. Еженедельно у всех животных как контрольной, так и опытных групп путем взвешивания определяли массу тела.

За 20 ч до окончания эксперимента (на 28-й день при витаминном дефиците и на 42-й день при восполнении витаминов в рационе) животных лишали корма. Затем крыс умерщвляли путем декапитации под легким эфирным наркозом. Сразу после вскрытия у животных отбирали печень, определяли ее абсолютную и относительную массу, и с помощью общепринятых флюоресцирующих методов проводили определение содержания в органе витаминов А, Е, В1 и В2 [1-4].

Одновременно у 6 животных из каждой группы лигировали слепую кишку и на секции отбирали ее для проведения в дальнейшем микробиологических исследований. Для этого содержание толстой кишки (ceacum) асептически извлекали, количественно разводили регенерированным фосфатнотиогликолевым буфером (калия дигидрофосфат - 4,5 г, натрия гидрофосфат - 6,0 г, агар-агар - 1,0 г, тиогликолевая кислота - 0,4 см3 на 1000 см3 воды дистиллированной) и засевали на плотную среду МРС (агар для лактобактерий по де Мену, Рогозе и Шарпу) для выделения и подсчета лактобактерий. Посевы инкубировали в течение 3 сут в термостате в атмосфере СО2 при 37 °С. По окончании культивирования проводили учет и микроскопию препаратов из всех типов выросших колоний. Изоляты, состоящие из бесспоровых грамположительных палочек, проверяли на отсутствие каталазы и по этим первичным признакам относили к роду Lactobacillus. Количество микроорганизмов выражали в десятичном логарифме (lg) колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1 г сырой массы содержимого кишки. Полученные данные обрабатывали с помощью пакета Статистика (версия 6.0). Для выявления статистической значимости различий непрерывных величин использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни для независимых переменных. Различия между анализируемыми показателями считали достоверными при р≤0,05.

Результаты и обсуждение

Как было показано в проведенных ранее исследованиях [1-4], масса тела, масса печени, а также средняя скорость прироста массы тела животных всех опытных групп достоверно не отличались от показателей у животных контрольной группы, тогда как содержание витаминов А, Е, В1 и В2 в печени было достоверно сниженно, что свидетельствовало о развитии у животных опытных групп сочетанного дефицита витаминов.

Данные подсчета количества лактобактерий в кишечнике у крыс, получавших дефицитные по содержанию витаминов корма с различным составом жирового компонента в течение 4 нед, представлены в табл. 1, из которой видно, что дефицит витаминов не отразился на количестве лактобактерий в содержимом слепой кишки крыс. К концу 4 недели у животных 2-й опытной группы, потреблявших корм с льняным маслом в качестве основного источника полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) на фоне дефицита в рационе всех витаминов, обнаружено статистически достоверное превышение количества лактобактерий в кишечнике по сравнению с показателем у крыс контрольной группы, потреблявших полноценный базовый рацион, и у крыс 1-й опытной группы, получавших стандартный жировой компонент на основе подсолнечного масла. Их количество возросло до оптимальных значений физиологической нормы [6].

Таким образом, использование льняного масла оказало положительное влияние на состояние одной из ведущих резидентных популяций микробиоты кишечника у экспериментальных животных. Важно отметить, что у контрольных крыс, получавших в качестве базового жирового компонента диеты подсолнечное масло, количество лактобактерий приближалось к такой величине только к концу эксперимента на 42-й день наблюдения (табл. 2). Данные табл. 2 характеризуют численность лактофлоры у крыс, получавших в течение 28 дней рацион с глубоким дефицитом всех витаминов, а затем находящихся в течение 2 нед на рационах с восполнением витаминов до уровней 70 и 200% от содержания в стандартном рационе для крыс. Как видно из данных табл. 2, статистически достоверных различий изучаемых показателей между крысами контрольной и 3-6-й опытными группами не выявлено, несмотря на то что жировой компонент рациона у одних подопытных животных был обычным, у других - модифицированным.

Таблица 1. Количество лактобактерий в содержимом слепой кишки крыс, получавших в течение 28 сут дефицитные по витаминам корма с различным составом жирового компонента

Таблица 2. Количество лактобактерий в содержимом слепой кишки крыс, получавших в течение 14 дней рационы с восполненными уровнями витаминов на фоне различных по составу жировых компонентов корма

Оценивая влияние рационов с различной степенью обеспеченности витаминами на состояние лактофлоры, следует отметить, что, несмотря на небольшое количество животных в опытных группах, у крыс, получавших рацион с льняным маслом, содержание указанных микробов было близко к оптимальному при обеих дозах восполнения (на 70% и 200%) количества витаминов в рационе (после искусственно создаваемого их дефицита). При содержании крыс 5-й и 6-й опытных групп на рационе с льняным маслом (см. табл. 2) количество лактобактерий в кишечном содержимом сохранялось практически на таком же высоком уровне, который был зафиксирован перед началом восполнения витаминов в рационе (медиана 9,4-9,3 lg KOE/г).

Как известно, жиры не принадлежат к эссенциально необходимым для роста микробов субстанциям, высшие жирные кислоты также не атакуются микроорганизмами [7, 11]. В то же время льняное масло относится к пищевым продуктам, обладающим выраженным желчегонным эффектом. В этом масле содержится в 1,5 раза больше стеринов, чем в подсолнечном. Для их всасывания организму требуется больше желчных кислот. Усиление их выработки и, соответственно, обратного всасывания способствует росту процессов энтерогепатической циркуляции, в которых активное участие принимает кишечная микрофлора. Доказано, что состав и профиль биотрансформации желчных кислот в кишечнике определяются ферментативными воздействиями обитающих там лактобактерий [5]. Поэтому повышение численности лактобактерий в содержимом кишечника, в частности в толстой кишке, крыс, находящихся на рационе с льняным маслом, логично объяснить тем, что при этом рационе наблюдается больший, чем на рационе с обычным жировым составом, выброс желчи, а следовательно, и повышение концентрации желчных кислот в химусе. Все это влечет активизацию в кишечнике микрофлоры, участвующей в энтерогепатической циркуляции.

К этому следует добавить, что эффект воздействия на кишечную микрофлору ω-3 ПНЖК, наличие которых отличает льняное масло от подсолнечного, малоизучен. Предполагается, что жирные кислоты этого семейства могут обусловливать позитивные сдвиги в анаэробной микрофлоре за счет способности влиять на липидный обмен в качестве регулятора окислительно-восстановительного потенциала в просвете кишечника [9]. Имеются данные о влиянии в опытах in vitro эйкозапентаеновой кислоты в микрограммовых количествах в среде на скорость роста и накопление количества бифидобактерий. Через 24 ч количество бифидобактерий возрастало на порядок по сравнению с контролем. Однако конкретных данных о влиянии ПНЖК на рост лактобактерий в литературе не найдено. Все это требует проведения целенаправленных исследований, подтверждающих такой же механизм действия.

Литература

1. Бекетова Н.А., Вржесинская О.А., Коденцова В.М. и др. // Вопр. питания. - 2012. - Т. 81, № 3. - С. 51-60.

2. Вржесинская О.А., Коденцова В.М., Бекетова Н.А. // Вопр. питания. - 2012. - Т. 81, № 2. - С. 51-56.

3. Вржесинская О.А., Бекетова Н.А., Коденцова В.М. // Вопр. питания. - 2012. - Т. 81, № 6. - С. 41-46.

4. Коденцова В.М., Бекетова Н.А., Вржесинская О.А. // Вопр. питания. - 2012. - Т. 81, № 4. - С. 72-77.

5. Луценко Л.П. Гепатоэнтеральная рециркуляция холестерина // Бюл. СО РАМН. - 2006. - Т. 32. - С. 12-18.

6. Mаннапова Р.Т., Файзулиннин И.М. Влияние прополиса в составе культур бифидобактерий и лактобацил на организм лабораторных животных // http://www.vetportal. ru/post180. html.

7. Рапопорт С.М. Медицинская биохимия. - М.: Медицина, 1966. - 892 с.

8. Шевелева С.А., Батищева С.Ю., Кузнецова Г.Г. и др. // Вопр. питания. - 2911. - № 2. - С. 51-56.

9. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. - М.: Грант, 2001. - 288 с.

10. Leber S., Vanderleyden J., De Keersmaecker S. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. - 2008. - Vol. 72, N. 4. - P. 728-764.

11. Starka J. Die Ernahrung der Mikrojuganismen - Ref. Verlag . in confer. "Physiologie und Biochemie der Mikroorganismen". - Stuttgart, 1968. - S. 291-322.