Comparative evaluation of the influence of homogenate and enzymatic hydrolyzate of mussels’ meat in the growth rats and their protein assimilation

AbstractThe experiment in vivo by a comparative assessment of the biological value of peptide fractions in structure of enzymatic hydrolyzates of mussels’ meat and protein in structure of homogenate of mussels’ meat (raw material) was carried out. The experiment was made in growing male rats of Wistar line, who got semi-synthetic diet with a source of protein presented by homogenate of mussels meat and enzymatic hydrolyzate of mussels meat. Throughout the study were defined the individual parameters of palatability of feed and increase of body weight of each animal; during the so-called exchange period, besides the listed parameters, were taken into account the quantity of nitrogen removed with excrement. Biological value of protein in structure of homogenate of mussels meat and peptide fractions in structure of enzymatic hydrolyzate of mussels meat was evaluated by determining the coefficient of efficiency of the protein and true digestibility of the protein. The findings show a high biological value of new source of protein – enzymatic hydrolyzate of mussels meat, the prospectivity of the further researches by evaluating a possible antistress properties of enzymatic hydrolyzate of mussels meat, as well as the opportunity of its use as a component of preventive food product of a broad spectrum of action.

Keywords:biological value, coefficient of efficiency of the protein, true digestibility, enzymatic hydrolyzate, meat of mussels

Вопр. питания. - 2013. - № 2. - С. 17-22.

Высокая пищевая и биологическая ценность мяса мидий, как и других гидробионтов, в первую очередь определяется высоким содержанием в них белка [4, 5]. В нашей стране наибольшее распространение для использования в диетическом и профилактическом питании детей и взрослых получили кислотные мидийные гидролизаты [6, 7, 10]. Повышенная биологическая активность гидролизатов мидий (по сравнению с исходным сырьем) обусловливается главным образом образованием меланоидинов в процессе гидролитического расщепления макронутриентов, входящих в состав мидий [2, 9].

В многочисленных экспериментальных и клинических исследованиях, проводимых в нашей стране более 50 лет, установлена эффективность использования в лечебном и профилактическом питании мидийных кислотных гидролизатов. Тем не менее недостаточно удовлетворительные органолептические показатели, а также резкое снижение пищевой и биологической ценности гидролизата вследствие полного или частичного разрушения некоторых незаменимых аминокислот (в первую очередь триптофана) в процессе жесткого кислотного гидролиза, проводимого при высокой температуре, определили актуальность разработки новых подходов получения гидролизатов мяса мидий.

Перспективным представляется метод ферментативного гидролиза мяса мидий, позволяющий получать пептидный продукт со значительно более высокой пищевой биологической ценностью и удовлетворительными органолептическими свойствами, чем у кислотных мидийных гидролизатов [3, 8]. Для характеристики мидийного ферментолизата существенный интерес представляет сравнительная оценка его биологической ценности и исходного сырья - гомогената мяса мидий.

Целью нашего исследования явилось проведение эксперимента на растущих крысах по сравнительному определению коэффициента эффективности белка (КЭБ) и истинной усвояемости гомогената мяса мидий (ГММ) и ферментолизата мяса мидий (ФММ).

Материал и методы

В качестве исходного сырья использовали вареномороженое мясо мидий (Mytilus galloprovincialis). Для получения гомогената мясо мидий размораживали, гомогенизировали на измельчителе тканей (Waring commercial blender 800S при 22 000 об/мин) в течение 15 мин и лиофильно высушивали. Для получения ФММ в полупромышленных условиях мясо мидий подвергали гидролизу ферментным препаратом "Протозим" (ЕНЗИМ, Украина, протеолитическая активность препарата 490 ЕД/г) в количестве 5% от массы сырья. Протеолиз вели в условиях, оптимальных для действия данного фермента (Т=50 °С, pH=6,5) в течение 12 ч в соотношении мясо мидий:вода - 1:5 без подведения pH реакционной смеси с последующей микрофильтрацией и распылительной сушкой.

Таблица 1. Химический состав гомогената и ферментолизата мяса мидий

Молекулярно-массовое распределение пептидных фракций в полученном ферментолизате оценивали методом эксклюзионной хроматографии среднего давления на колонке TSK GEL G 2000 SWLX c проточным ультрафиолетовым детектором (длина волны - 280 нм) [10]. Содержание пептидных фракций в анализируемых ферментолизатах определяли путем интегрирования весовым методом полученных хроматограмм. Содержание белка в ГММ и ФММ выявляли по Кьельдалю, используя коэффициент пересчета с общего азота на белок, равный 6,25, на автонализаторе Kjeltec Foss-2300 [14]. Массовую долю золы и влаги определяли по ГОСТу 7636-85, массовую долю липидов - с помощью экстракционного аппарата Сокслета в автоматическом экстракторе фирмы VELP SER 148/6 с использованием диэтилового эфира. Химический состав ГММ и ФММ представлен в табл. 1.

Биологический эксперимент проводили на растущих крысах-самцах Вистар, полученных из питомника "Столбовая". Животные были разделены на 2 равные группы (n=9): 1-я - ГММ, 2-я - ФММ; исходная масса тела крыс в группах достоверно не различалась и составляла соответственно 101,8±1,7 и 99,8±1,8 г. Животные 1-й группы получали изокалорийный (400 ккал/100 г сухого корма) полноценный рацион с содержанием (по калорийности) белка, полностью представленного ГММ, - 10%, жира - 11,5%, углеводов - 53%, солевой смеси - 4% и витаминов - 1,1% [15]. Животные 2-й группы получали такой же полусинтетический полноценный рацион, но в нем ГММ был полностью замещен ФММ. Диету рассчитывали с учетом химического состава ГММ и ФММ; содержание белка в рационах определяли по Кьельдалю [14], используя коэффициент пересчета с общего азота на белок, равный 6,25. Составы полусинтетических рационов обеих групп, а также минеральной и витаминной смесей представлены в табл. 2. Воду и корм животные получали без ограничений.

На протяжении всего исследования, которое длилось 24 сут, через день определяли индивидуальную поедаемость корма и массу тела каждого животного. С 21-х по 24-е сутки (в так называемый обменный период), помимо перечисленных показателей, определяли количество выведенного с калом азота и, используя коэффициент пересчета [14], рассчитывали количество выведенного с калом белка. По окончании экспериментов (25-е сутки) у животных отбирали кровь и выводили их из эксперимента.

Для оценки влияния потребления ГММ и ФММ на ростовые показатели определяли относительный прирост массы тела животных в процессе эксперимента и характеризовали эффективность утилизации белка, рассчитывая для этого коэффициент эффективности белка (КЭБ) и истинную усвояемость белка (Dист.) в составе ГММ или ФММ [11-13].

Таблица 2. Состав полусинтетических рационов 1-й (ГММ) и 2-й (ФММ) групп

КЭБ определяли по приросту массы тела крыс в граммах на 1 г потребленного ими белкав составе ГММ или ФММ, используя для расчета формулу:

КЭБ = (Wt - W0)/ Ip, (1)

где Wt - масса тела крысы (г) в последний день экспериментального периода, W0 - масса тела крысы (г) в 1-й день экспериментального периода; Ip - количество белка, потребленного крысой (г), за экспериментальный период.

Истинную усвояемость белка ГММ или ФММ рассчитывали по формуле

Dист = I (F - Fk)/ I, (2)

где Dист. - истинная усвояемость (в %), I - общее количество азота (г), потребленного крысой с пищей в течение балансового периода; F - количество азота (г), экскретированного с калом в течение балансового периода; Fk - количество азота (г), экскретированного с калом крысой, находившейся на безбелковой диете в течение такого же балансового периода. Значение показателя Fk принято равным 0,020, согласно [1]. КЭБ и Dист. определяли индивидуально для каждого животного, а затем рассчитывали среднее значение этого показателя по группе.

Достоверность различий средних значений определяемых величин для обеих групп животных определяли с использованием двустороннего t-теста Стьюдента. Во всех случаях различия признавали достоверными (нуль-гипотеза отвергалась) на уровне значимости p<0,05. При расчетах использовали пакеты программ Excel XP.

Результаты и обсуждение

В табл. 3 приведены результаты оценки молекулярно-массового распределения пептидных фракций ФММ. Видно, что основная доля пептидно-аминокислотного материала находится в диапазоне молекулярных масс менее 10,4 кД. Препарат хорошо растворим в воде без образования осадка.

Содержание белка в рационах, определяемого по Кьельдалю [14], составляло 11,0% (в 1-й группе с ГММ) и 10,6% (во 2-й группе с ФММ). Средние показатели массы тела каждого животного в обеих группах представлены на рисунке, из которого видно, что животные 2-й группы, получавшие ФММ, на протяжении первых 12 сут, значительно отставали в прибавке массы тела от животных 1-й группы.

В табл. 4 представлены показатели поедаемости корма (в среднем) за сутки животными обеих групп. Видно, что на 12-й день опыта, когда различия в массе тела крыс были максимальными, поедаемость корма в 1-й группе оказалась в 1,4 раза выше, чем во 2-й. На протяжении последующих 9 сут этот показатель в 1-й группе попрежнему оставался выше. Однако в этот период, как видно из кривых на рисунке, а также данных, касающихся относительного прироста массы тела животных (см. табл. 4), крысы 2-й группы стали расти быстрее, чем 1-й. К началу обменного 3-суточного периода средние значения массы тела животных обеих групп практически не различались. Поедаемость ими корма возросла, о чем прежде всего можно судить по увеличениюмассы тела животных. Эффективность утилизации белка, характеризуемая показателем КЭБ, для первых 12 сут опыта также была выше у животных 1-й группы, а в последующие 9 сут она снизилась. Эффективность утилизации белка у животных 2-й группы изменялась противоположным образом и к началу обменного опыта значение КЭБ у них было достоверно выше, чем в 1-й группе.

Помещение животных в индивидуальные обменные клетки стало для них определенным стрессом, ответная реакция на который существенно различалась у крыс, получавших ГММ и ФММ. Если в 1-й группе масса тела крыс не только не повысилась, но даже снизилась, то во 2-й группе животные продолжали расти и в среднем масса тела у них достоверно превысила таковую в 1-й группе. Этот результат, на наш взгляд, может указывать на некоторые адаптагенные свойства мидийного ферментолизата, связанные, по-видимому, с наличием в его составе биологически активных соединений пептидной природы. Высказанное предположение, разумеется, носит чисто спекулятивный характер: для его проверки необходимы дополнительные исследования.

Таблица 2. Состав полусинтетических рационов 1-й (ГММ) и 2-й (ФММ) групп

Таблица 3. Молекулярно-массовое распределение пептидных фракций (Δ MW, кД) ферментолизата мяса мидий

Таблица 4. Изменения коэффициента эффективности белка в составе гомогената мяса мидий и пептидов в составе ферментолизата мяса мидий в процессе кормления животных (средние значения по группам, г)

Динамика роста массы тела животных обеих групп

Результаты определения истинной усвояемости белка рациона животными обеих групп свидетельствуют о том, что среднее значение количества белка, потребляемого с кормом за 1 сут обменного периода, было практически одинаковым для животных обеих групп. Однако масса фекалий, выделяемых крысами 2-й группы, потреблявшими ФММ, более чем в 1,5 раза превышала таковую в 1-й группе. Тем не менее значение истинной усвояемости белка, находящегося в составе ГММ, хотя и достоверно, но лишь незначительно превышало истинную усвояемость белка (пептидных фракций), содержащегося в составе ФММ.

Полученные данные свидетельствуют о том, что животные 1-й группы, получавшие течение 21 сут рацион с ГММ, потребляют белок, содержащийся в ГММ, в значительно большем количестве (в 1,4 раза), чем животные 2-й группы, находившиеся в эти же сроки на рационе с ФММ. При помещении животных в индивидуальные обменные клетки на 3 сут потребление белкового азота в этот обменный период становится практически одинаковым для животных обеих групп. Если в течение первых 12 сут кормления белок ГММ утилизируется эффективнее, чем белок ФММ, то в последующие 9 сут наблюдается значительное повышение эффективности утилизации пептидов в составе ФММ. На 21-е сутки опыта (до начала обменного периода) величина КЭБ у животных 2-й группы, получавших ФММ, в 1,3 раза превышает показатель в 1-й группе (рацион с ГММ). Стресс, возникающий у животных в результате помещения их в индивидуальные обменные клетки, особенно отрицательно сказывается на крысах, получавших рацион с ГММ, и в значительно меньшей степени - при рационе с ФММ. При незначительно более низкой истинной усвояемости ФММ по сравнению с ГММ формально рассчитанное значение КЭБ для ФММ в обменный период практически было таким же, что и в первые 12 сут кормления. Рассчитанный для всей продолжительности опыта (24 сут) КЭБ для ФММ более чем в 1,6 раза превысил КЭБ для ГММ. Таким образом, очевидна перспективность дальнейших исследований по оценке возможных антистрессорных свойств использования ФММ.

Литература

1. Высоцкий В.Г., Мамаева Е.М. и др. // Вопр. питания. - 1979. - № 3. - С. 48-53.

2. Давидянц С.Б., Ведяшкин П.Ф. Основные пути развития структурной химии меланоидинов. - Ставрополь: СПТИ, 1985. - 15 с.

3. Зорин С.Н., Матяш А.И., Нгуан Иен и др. // Вопр. дет. диетологии. - 2008. - Т. 6, № 3. - С. 36-38.

4. Новикова М.В., Абрамова Л.С., Котенев Б.Н. Технология получения и применения биологически активных добавок из беспозвоночных и отходов их разделки. Метод. рекомендации по комплексному использованию морских и пресноводных беспозвоночных для получения пищевых и кормовых биологически активных добавок. - М.: ВНИРО, 2008. - Вып. 3. - 24 с.

5. Новикова М.В., Рехина Н.И. и др. // Medicina altera. - 1998. - C. 26-28. Пищевая биологически активная добавка из мидий. Вопросы питания, № 1, 1998, стр. 10-13.

6. Новикова М.В., Рехина Н.И., Беседина Т.В. и др. Противолучевая эффективность мидийного гидролизата (МИГИК ЛП) // Актуальные проблемы медицинской экологии. Тезисы докладов I Рос. науч.-практ. конф. - 1998. - С. 8-9.

7. Рехина Н.И., Новикова М.В., Беседина Т.В. и др. // Рыб. хозяйство. - 1995. - № 4. - С. 53-56.

8. Сидорова Ю.С., Зорин С.Н., Мазо В.К. и др. // Вопр. питания. - 2011. - Т. 80, № 6. - С. 72-75.

9. Телегина Т.А., Новикова М.В. Меланоидины мидийного гидролизата: содержание и антиокислительная активность // Материалы III Междунар. науч.-тех. конф. "Пища. Экология. Человек". - М.: МГУПБ, 1990. - С. 59.

10. Фармакопейная статья предприятия на лекарственные средство "Ларетен" № 420150039700, регист. Р № 001262/ 01. - 2002.

11. Хефтман Э. Хроматография. Практическое приложение метода. Т. 1. - М.: Мир, 1989. - 111 с.

12. Высоцкий В.Г., Мамаева Е.М. // Вопр. питания. - 1979. - № 3. - С. 48-53.

13. Высоцкий В.Г., Яцышина Т.А., Рымаренко Т.В. и др. // Мед. реферат. журн. - 1976. - № 6. - Разд. VII. - С. 24-35.

14. Высоцкий В.Г. Экспериментальное обоснование потребностей человека в белке: Автореф. дис. - д-ра мед. наук. - М., 1977. - 33 с.

15. Скурихин И.М., Тутельян В.А. Руководство по методам анализа качества и безопасности пищевых продуктов. - М.: Медицина, 1998. - 142 с.

16. Тышко Н.В., Жминченко В.М., Пашорина В.А. и др. // Вопр. питания. - 2011. - Т. 80, № 5. - С. 30-38.