Hematologic indices in different age Wistar rats, receiving a balanced semi-synthetic vivary diet

AbstractThis paper presents the results of research of hematologic parameters of male Wistar rats 1, 2, 3, 4 and 6 months age, which received a balanced semisynthetic diet. Studies were carried out at the Hematology analyzer Coulter AC TTM 5 diff OV (Beckman Coulter, USA) with the program, specially developed for the study of rats’ blood. According to the results of research, was found a statistically significant increased of the number of red blood cells; the concentration of hemoglobin and hematocrit in animals 2-6 months compared with rats, 1 month age. With age, there is a decrease of the mean corpuscular volume and the mean corpuscular hemoglobin. The number of white blood cells in rats of 2–4 months age are significantly higher than in rats of 1 and 6 months age. The number of neutrophils and eosinophils in rats of to the 2 month are of is lover than once in rats of 1 month age, and increases values in animals of 6 months age. The number of lymphocytes has the highest value in the rat of 2–3 months age and the minimum value is that in animals of 6 months age. With increasing of the age of the animals the reduction of contents of monocytes was noted. The content of platelets and the platelet crit in the blood of rats 6 months age is statistically greater than those in 1-month age animals. The average volume of platelet is the stable index, with age does not change.

Keywords:hematological parameters, physiological norms, balanced complete semi-synthetic diet, hematology analyzer

Вопр. питания. - 2013. - № 2. - С. 10-16.

Отправной точкой любых экспериментальных исследований по изучению воздействия на организм различных внешних и внутренних факторов (начиная от стресса, влияния химических веществ и кончая наличием в рационе дефицита или избытка макро- и микронутриентов) [5-7, 12] является правильный подбор соответствующих контрольных и опытных животных (чаще всего крыс), идентичных по возрасту и линии происхождения. При этом в большинстве исследований контрольных животных обследуют с помощью различных методов - физиологических, биохимических, цитологических, гематологических и др., однако часто даже не указывается рацион, на котором они содержатся, и далеко в не полном объеме приводятся методы исследования. Особенно это относится к гематологическим методам, которые, будучи важными для диагностики, в известной мере отражают физиологическое состояние организма. Следует добавить, что во многих работах не указывается возраст контрольных и подопытных животных (чаще приводятся только сроки исследования), вследствие чего отсутствует информация по возрастной ранжированности гематологических и других изучаемых показателей [2, 4, 15, 21], а это может сказаться на интерпретации полученных результатов. Поэтому при проведении экспериментов in vivo необходимо сравнивать не только показатели обследования контрольных и подопытных животных, но и знать, не выходят ли эти показатели, особенно гематологического плана, за рамки возрастных норм для животных, взятых в опыт [12, 17].

Нормальные величины отдельных гематологических показателей (клинический анализ крови), характерные для лабораторных животных, в том числе для белых крыс, приводятся в работах многих отечественных и зарубежных исследователей [3, 11, 13, 17, 18, 20, 22-24] (табл. 1). Однако данные о нормах по всему спектру гематологических показателей для крыс Вистар, которые наиболее широко используются в экспериментальных работах, практически отсутствуют. Нет в литературе и данных о величине гематологических показателей с учетом возраста крыс указанной линии. Вместе с тем при постановке экспериментов по выявлению влияния на организм различных факторов необходимо учитывать возраст животного (возрастную эволюцию), качественное своеобразие каждой стадии онтогенеза, а также сезонную изменчивость состава крови [8, 11].

Обычно у крыс выделяют 2 критических возрастных периода - период новорожденности и период между 9-17-и сутками, когда происходит переход красного костного мозга на новый уровень функционирования с падением количества ретикулоцитов и увеличением числа эритроцитов. К 4-й неделе жизни, когда крысы переходят на самостоятельное питание, они полностью готовы к полноценному иммунному ответу [12]. Согласно опубликованным данным [3, 12], у новорожденных крысят содержание эритроцитов (в 1 мл крови) в среднем составляет 2,5-2,5 млн, лейкоцитов - 3200 в 1 мл крови; с возрастом эти показатели увеличиваются. Лейкоцитарная формула у новорожденных крысят представлена преимущественно миелоцитами, метамиелоцитами, гранулоцитами (нейтрофилами, базофилами, эозинофилами), а также лимфоцитами (в среднем 25%). Некоторые авторы [1, 10-12] отмечают, что белая кровь у лабораторных животных, в том числе у белых крыс, очень лабильна. Причем у 2 здоровых крыс одного и того же возраста и даже у одного и того же животного количество отдельных видов лейкоцитов может значительно колебаться.

Как известно, полноценная работа системы кровообращения во многом зависит от функционального состояния и общего содержания в крови лейкоцитов [1, 10-12]. В раннем онтогенезе и до наступления половой зрелости животных количество лейкоцитов неуклонно растет, а затем изменяется мало [12]. У молодых крыс лабильность лейкоцитарной формулы сопровождается выраженным лимфоцитарным профилем [11, 12]. С возрастом количество лимфоцитов понижается [11, 19], а нейтрофилов возрастает. У старых животных (по-видимому, в связи с ослаблением функциональной активности тимуса) происходят изменения клеточного состава крови с уменьшением до минимума содержания лимфоцитов и, наоборот, увеличением до максимальных значений количества нейтрофилов [11, 19]. Развитие у старых животных эозинофилии, очевидно, связано с возрастным нарушением гормонального статуса [1, 10, 14, 15].

Увеличение возраста животных не влияет на уровень гемоглобина (Hb) в плазме крови. Однако средняя концентрация Hb по сравнению с таковой у молодых животных уменьшается [14, 15], а количество эритроцитов, напротив, возрастает, что в позднем онтогенезе является следствием компенсаторного усиления эритропоэза (объем эритроцитов уменьшается, а их количество увеличивается). При этом у старых животных повышается степень гемолиза эритроцитов, что, вероятно, связано с усилением влияния механизмов свободнорадикального окисления [14]. К сказанному следует добавить, что в последнее время совершенствуются технологии лабораторного анализа, в том числе с использованием автоматического анализатора крови, что позволяет не только расширить круг изучаемых количественных гематологических показателей, но и избежать индивидуальной интерпретации полученных данных.

Исходя из вышесказанного целями нашего исследования были изучение с помощью автоматического анализа гематологического профиля крыс Вистар различного возраста (1, 3, 4, 6, 7 мес), находящихся на сбалансированном полусинтетическом рационе, и определение границ физиологической нормы показателей этого профиля с учетом возраста животных. Отметим, что в соответствии с цитируемой литературой, аналогичные исследования ранее не осуществлялись.

Таблица 1. Гематологические показатели у экспериментальных животных (крыс) по данным литературы

Материал и методы

Эксперименты проводили в несколько этапов на крысах-самцах Вистар (по 3-7 животных в клетке, в зависимости от возраста). Возраст животных на момент окончания эксперимента составлял 1 мес (40 крыс), 2 мес (63 крысы), 3 мес (41 крыса), 4 мес (34 крысы) и 6-7 мес (62 крысы). Животные в течение всего эксперимента получали сбалансированный полусинтетический рацион, содержащий (в физиологических нормах для крыс) казеин, кукурузный крахмал, а также растительное масло и лярд в соотношении 1:1, витаминную, солевую смеси, пищевые волокна [9, 16, 18]. Применяли принцип кормления животных вволю при свободном доступе к воде. Ежедневно контролировали состояние животных, поедаемость корма, прирост массы тела. После завершения экспериментов животных в указанные выше сроки умерщвляли путем декапитации под легким эфирным наркозом, отбирали для исследования кровь в пробирки с ЭДТА-КЗ, проводили патологоанатомическое вскрытие.

Гематологические показатели крови определяли на гематологическом автоматическом анализаторе Coulter АC TTM 5 diff OV с использованием реактивов производства Beckman Coulter (США). Определяли общее количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, содержание Hb, гематокрит, среднее содержание в эритроците Hb, подсчитывали лейкоцитарную формулу, средний объем эритроцита, тромбоцита, тромбокрита.

Результаты исследований представлены в виде средних величин и стандартной ошибки (М±m), а также минимальных и максимальных значений (табл. 2). Статистическая обработка выполнена с использованием программ IBM SPSS Statistics Version 20, критериев Стьюдента и Манна-Уитни. Уровень значимости считали достоверным при p≤0,05.

Таблица 2. Гематологические показатели у крыс в возрастных категориях 1-6 мес

Результаты и обсуждение

Результаты гематологических исследований, проведенных у крыс Вистар разного возраста, представлены в табл. 2, из которой видно, что с увеличением возраста животных изменяется большинство гематологических показателей. Так, в процессе онтогенеза выявлено статистически значимое повышение в крови содержания эритроцитов, концентрации Hb и гематокрита: у 2-, 3-, 4- и 6-месячных крыс эти показатели выше, чем у животных в возрасте 1 мес. При этом отмечено статистически достоверное снижение среднего объема эритроцита и среднего содержания Hb в эритроците. Наиболее высокое число эритроцитов при уменьшении их объема отмечено у 6-месячных животных, что, возможно, связано с активизацией компенсаторных механизмов эритропоэза в ответ на усиление процессов свободнорадикального окисления [14]. Средняя концентрация Hb возрастает ко 2-му месяцу жизни животных и в дальнейшем практически не меняется. Необходимо отметить, что разброс по перечисленным показателям был незначительным (рис. 1).

Общее содержание лейкоцитов в крови 2- и 3-месячных крыс достоверно выше, чем у 1-месячных животных. У 6-месячных крыс коли-чество лейкоцитов хотя и меньше, чем у крыс 2, 3 и 4 мес жизни, но статистически достоверно выше, чем у 1-месячных.

У крыс Вистар разного возраста, находящихся на полноценном сбалансированном полусинтетическом рационе, выявлены следующие изменения лейкоцитарной формулы: общее количество нейтрофилов и эозинофилов ко 2-му месяцу жизни животных снижается, а в дальнейшем увеличивается, достигая максимальных значений к 6-месячному возрасту. С возрастом количество лимфоцитов у животных вначале увеличивается, достигая максимального значения к 2-3 мес жизни, а затем (к 6-месячному возрасту) снижается, оставаясь все же больше, чем у крыс 1-месячного возраста. Количество моноцитов с увеличением возраста животных значимо уменьшается (см. табл. 2). Количество базофильных лейкоцитов с возрастом животных также снижается: у 1-месячных крыс оно значительно выше, чем в остальных возрастных группах. С возрастом у животных обнаружена тенденция к увеличению тромбоцитарных показателей: у 6-месячных крыс содержание в крови тромбоцитов и их относительный объем достоверно выше, чем в возрасте 1 мес (см. табл. 2). Однако средний объем тромбоцитов с возрастом животных не изменяется, оставаясь стабильным во все сроки исследования.

Таким образом, на основании проведенных исследований нами создана база данных и определены границы физиологической нормы большинства показателей гематологического профиля у наиболее часто используемых в экспериментах крыс-самцов Вистар разного возраста (1-6 мес), получавших полноценный сбалансированный полусинтетический рацион.

Рис. 1. Динамика возрастных изменений показателей, характеризующих состояние эритроцитов крыс: а - содержание эритроцитов; б - средний объем эритроцитов; в - концентрация Hb в крови; г - среднее содержание Hb в эритроците

Рис. 2. Динамика лейкоцитарной формулы крыс по возрастным категориям

Литература

1. Агаджанян Н.А., Федорова М.Л. // Экология человека. - 2001. - № 4. - С. 66-68.

2. Ариджанова И .Э. // Вестн. ОГУ. - 2009. - № 1. - С. 73-76.

3. Гамбарян П.П., Дукельская Н.М. Крыса. - М.: Советская наука, 1955. - 256 с.

4. Егорова М.О., Цветаева Н.В., Сухачева Е.А. Практические рекомендации по лабораторной диагностике наиболее распространенных форм анемий. Метод. пособие. - М.: Ариен, 2012. - 48 с.

5. Клиническая интерпретация лабораторных исследований (ред. А.Б. Белевитина, С.Г. Щербак). - СПб.: ЭЛБИ, 2006. - 398 с.

6. Козинец Г .И. Анализы крови и мочи. Клиническое значение. - М.: Практическая медицина, 2011. - 160 с.

7. Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник (ред. В.В. Меньшикова). - М.: Медицина, 1987. - 368 с.

8. Любин Н.А., Конова Л.Б. Методические рекомендации к определению и выведению гемограммы у сельскохозяйственных и лабораторных животных при патологии. - Ульяновск: ГСХА, 2005. - 52 с.

9. Медико-биологическая оценка безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения. Методические указания - 2.3.2.306-07. - М.: Роспотребнадзор, 2008. - 30 с.

10. Моисеенко Н.А., Репина Е.Н., Кетова М.С. Количество, спектр и адгезия лейкоцитов крови крыс при иммобилизационном стрессе на фоне действия экдистероидсодержащей субстанции Серпистен URL.//http. Rusnauka. Cоm./13 NPT 2008/ Biologia/3 1972. doc.htm.

11. Никитин В.Н. Атлас клеток крови сельскохозяйственных и лабораторных животных. - М.: Гос. издательство Сельскохозяйственной литературы, 1949. - 50 с.

12. Новожилов А.В. Динамика реологических и гематологических показателей крови у незрело- и зрелорождающихся животных в постнатальном патогенезе: Автореф. дис. - канд. мед. наук. - СПб., 2009. - 18 с.

13. Сидорчук А.А., Глушков А.А. Инфекционные болезни лабораторных животных. - М.: Лань, 2009. - 128 с.

14. Теплый Д.Д. Особенности морфофизиологических показателей эритроцитов белых крыс на этапах онтогенеза в норме и при оксидативнос стрессе: Автореф. дис. - канд. биол. наук. - Астрахань, 2011. - 21 с.

15. Теплый Д.Д., Нестеров Ю.В. // Естественные науки. - 2011. - Т. 34, № 14. - С. 138-143.

16. Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов. Методические указания. - 1.2.2520. - М.: Федеральный Центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009. - 35 с.

17. Трахтенберг И.М., Сова Р.Е., Шефтель В.О. и др. Показатели нормы у лабораторных животных в токсикологическом эксперименте (Современные представления и методические подходы, основные параметры и константы). - М.: Медицина, 1978. - 176 с.

18. Тышко Н.В., Жминченко В.М., Пашорина В.А. и др. // Вопр. питания. - 2011. - Т. 80, № 5. - С. 30-38.

19. Узенбаева Л.Б.. Виноградова И.А., Голубева А.Г. и др. // Успехи геронтол. - 2006. - Вып. 19. - С. 79-84.

20. Шатурина Л.П., Еремина И.Ю., Злотникова О.В. Естественная резистентность. Лабораторный практикум. - Красноярск, 2006. http//www.kgau.ru/distance/resources/saturina/

21. Шмидт Ю.Д. Влияние антистрессового препарата "Аминовит" на морфологию надпочечных желез и морфоцитологические показатели крови телят при транспортном стрессе: Автореф. дис. - канд. биол. наук. - Новосибирск, 2003. - 13 с.

22. Krinke G.J., Bullock G.R., Bunton T. The Laboratory Rat (Handbook of Experimental Animals). - San-Diego: Academic Press, 2000. - 756 p.

23. Lewi P.J., Marsboom R.P. Toxicology reference data. - Wistar rat. - Amsterdam: Holland: Elsevier/North-Holland Biochemical Press, 1981. - P. 358.

24. Suckow M.A., Weibroth S.H., Franklin C.L. The Laboratory Rat. - Burlington: Elsevier; Academic Press, 2006. - 912 p.