Studies of effects of aluminum oxide nanoparticles after intragastric administration

AbstractGrowing Wistar rats received intragastrically nanoparticles (NPs) of aluminum oxide (Al2O3) daily during 28 days at doses of 1 or 100 mg per kg body mass. There were studied body mass of animals, relative mass of internals, rate of protein macromolecules absorption in the gut, oxidative damage of DNA, pool of tissue thiols, activity of hepatic enzymes of xenobiotic detoxication system, biochemical and hematological blood indices, stability of lysosome membranes, condition of antioxidant defense system, apoptosis of hepatocytes. Conducted experiments didn’t reveal any marked toxic action of Al2O3 NPs on rats after 28 days of administration both in high and low dose. Among effects probably related to NPs influence on animals there were lowering of relative liver and lung masses, decrease of hepatic thiol pool, activity of CYP1A1 isoform in liver and glutathione reductase in erythrocytes, increase of diene conjugates of fatty acids in blood plasma. Said shifts were small in magnitude, didn’t come out of margins of physiological norm and didn’t show any distinct relation to NPs dose. However considering great importance of this nanomaterial as probable environmental contaminant the studies of it’s toxicity must be continued in conditions of low doses (less than 1 mg per kg body mass) for long period of time.

Keywords:aluminum oxide, nanoparticles, rats, toxicity

Вопр. питания. - 2012. - № 6. - С. 54-60.

Наночастицы (НЧ) оксида алюминия (Al2O3: корунт, бемит) широко используются в современной ременной обрабатывающей промышленности в качестве абразивной добавки, а также выступают в роли катализатора в ряде процессов органического синтеза в чистом виде и в форме, модифицированной ионами переходных металлов (Pt, Pd и др.). Как признается Организацией экономического сотрудничества и развития (OECD), вследствие больших объемов производства данного наноматериала и незамкнутого характера многих технологических циклов, в котором он используется, наноструктурированный Al2O3 может быть значимым загрязнителем окружающей среды [11]. Поскольку эти НЧ нерастворимы в воде и практически не способны к биологической деградации, они могут накапливаться в составе компонентов природных экосистем [18], в сельскохозяйственной продукции, в том числе в пищевых продуктах.

НЧ Al2O3 легко поглощаются различными клеточными культурами [7, 16], оказывая при этом цитотоксическое действие [7, 9, 16] и обладая способностью к каталитической генерации свободных радикалов [8, 20]. Кроме того, установлено вредное действие водных дисперсий НЧ Al2O3 на дафний [12], пресноводных улиток [14], почвенных нематод [6], насекомых [17] и рыб [13]. В то же время имеющиеся данные о возможном токсическом действии НЧ Al2O3 на организм теплокровных животных [10, 15] распространяются только на ингаляционный путь их поступления, что не позволяет комплексно оценить риск воздействия этих наноматериалов на здоровье человека. Целью настоящей работы явилась оценка воздействия НЧ Al2O3 на организм крыс в условиях многократного введения в желудочно-кишечный тракт (ЖКТ), что является моделью поступления данного наноматериала с пищевыми продуктами.

Материал и методы

В работе был использован стандартизованный препарат НЧ оксида алюминия производства фирмы Sigma-Aldrich (Германия). Средний размер частиц, имеющих форму эллипсоидов, согласно исследованиям, проведенным с помощью трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ), составлял 6,3±3,3 (M±sd) и 5,0±2,6 нм (соответственно большая и малая оси), а по данным атомносиловой микроскопии диаметр частиц равнялся 16,4±10,0 нм, причем при исследовании методом ТЭМ НЧ были частично агрегированы в рыхлые кластеры. В качестве макродисперсного аналога наноматериала использовали окись алюминия "Нейтральную для хроматографии", производства фирмы Lachema о.р. Вrno (Чехия).

Эксперимент был проведен на 75 крысах - самцах линии Вистар с исходной массой 125±5 г, полученных из питомника филиала Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (г. Пущино, Московской области). Животные были разделены на 5 групп: контрольную (1-я группа) и 4 опытные (2-5-я группы) по 15 крыс в каждой. Животных содержали по 3-4 особи в пластмассовых клетках и кормили на протяжении всего эксперимента сбалансированным полусинтетическим рационом согласно МУ 1.2.2520-09 [4]. Доступ к корму и питьевой воде для животных не ограничивали. Крысам ежедневно на протяжении 28 дней внутрижелудочно (через зонд) вводили НЧ Al2O3 в дозе 1 мг/кг массы тела (2-я опытная группа) или 100 мг/кг (3-я опытная группа) или окись алюминия "Нейтральную для хроматографии" в тех же дозах - 1 и 100 мг/кг (соответственно 4-я и 5-я группы) (табл. 1). Непосредственно перед введением водные суспензии используемых препаратов оксида алюминия для устранения агрегации обрабатывали ультразвуком (в течение 5 мин при 44 кГц и 40 Вт). Контрольные животные получали ежедневно внутрижелудочно деионизованную воду в количестве 10 мл на 1 кг массы тела.

Таблица 1. Тестируемые материалы и дозы

На протяжении всего эксперимента у животных всех групп изучали интегральные показатели (внешний вид, поведение, двигательную активность, состояние шерстяного покрова, поедаемость корма, еженедельную прибавку массы тела); абсолютный и относительный прирост массы тела определяли, взвешивая крыс на электронных весах с точностью ±0,5 г. На 24-й день по 5 животных из каждой группы помещали в обменные клетки, где в течение суток собирали мочу; при этом животные не получали рацион, но имели неограниченный доступ к воде. В отобранной моче определяли содержание продукта окислительной деструкции ДНК: 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина (8-oxo-dG) [3].

В конце эксперимента, на 29-е сутки опыта, животные всех групп были разделены на 2 подгруппы. В 1-ю подгруппу входили 45 крыс (по 9 животных из каждой группы), во 2-ю подгруппу - 30 крыс (по 6 животных из каждой группы). У животных 1-й подгруппы изучали величину всасывания антигенного белка овальбумина (ОВА) в ЖКТ. Для этого на 29-й день эксперимента (за 3 ч до умерщвления животных путем обескровливания из нижней полой вены под эфирным наркозом) крысам 1-й подгруппы вводили внутрижелудочно через зонд лиофилизованный белок куриного яйца в дозе 2 г/кг в виде 10% раствора в 0,15 М NaCl. На секции отбирали кровь, а также брали внутренние органы (печень, почки, сердце, легкие, селезенку, слепую кишку, надпочечники, семенники, тимус, головной мозг) в последовательности, указанной в МУ 1.2.2745-10 [5]. Затем на электронных весах с точностью ±0,01 г определяли абсолютную массу внутренних органов и рассчитывали их относительную массу (ОМ), в % от массы тела. В сыворотке собранной крови с помощью методов, используемых в работах [1-3], изучали гематологические показатели (концентрацию в крови гемоглобина, общее количество эритроцитов, объем эритроцита, гематокрит, среднюю концентрацию гемоглобина в одном эритроците, среднее содержание гемоглобина в эритроцитах; число лейкоцитов, относительное содержание лимфоцитов, моноцитов, базофилов, эозинофилов, нейтрофилов, незрелых гранулоцитов, тромбоцитов, средний объем тромбоцитов, тромбокрит), содержание цитокинов - интерлейкинов (ИЛ-10 и ИЛ-6), а также фактора некроза опухоли α (ФНО-α) в сыворотке крови; интенсивность процесса апоптоза гепатоцитов оценивали методом проточной цитофлюориметрии с красителями аннексин-5-FITC и 7-аминоактиномицин D. Концентрацию антигенного ОВА в сыворотке крови крыс определяли с помощью твердофазного двухвалентного иммуноферментного метода [19].

Животных 2-й подгруппы также умерщвляли на 29-й день эксперимента тем же способом, что и животных 1-й подгруппы. Отбирали кровь и на вскрытии - печень. На электронных весах определяли ее массу (с точностью ±0,1 г), а затем с помощью методов, указанных в работах [1-3], изучали биохимические показатели. В печени определяли содержание микросомальных цитохрома Р450, цитохрома b5, активность монооксигеназ, включая этоксирезоруфиндеалкилазу (CYP1A1), метоксирезоруфин-О-деметилазу (CYP1A2) и пентоксирезоруфин-О-деалкилазу (CYP1В2), глутатион-S-трансферазы, UDP-глюкуронозилтрансферазы, общих и неседиментируемых лизосомальных гидролаз (арилсульфатаз А и В, β-галактозидазы, β-глюкуронидазы), концентрацию небелковых тиолов, представленных в основном восстановленным глутатионом. В плазме крови изучали содержание общего белка, альбумина, глюкозы, креатинина, мочевой кислоты, мочевины, активность аланин- (АЛТ) и аспарагинаминотрансферазы (АСТ), щелочной фосфатазы; показатели перекисного окисления липидов (ПОЛ) - содержание диеновых конъюгатов полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК), малонового диальдегида (МДА). В эритроцитах определяли активностьглютатионредуктазы, супероксиддисмутазы, каталазы.

Статистическую обработку результатов проводили согласно критерию ANOVA и непараметрическому ранговому критерию Манна-Уитни. Различия признавали достоверными при уровне значимости р<0,05.

Таблица 2. Относительная масса внутренних органов у животных контрольной и опытных групп (М±m, %)

Результаты и обсуждение

На протяжении всего эксперимента все животные контрольной и опытных групп росли равномерно, сохраняли нормальный внешний вид; случаев заболевания и летальных исходов не было. При этом у крыс опытных групп, получавших НЧ и их макродисперсный аналог в низкой дозе, относительная прибавка массы тела за 28 дней опыта была даже несколько больше (примерно на 15%, р<0,05), чем у крыс контрольной группы. На 29-й день эксперимента у животных всех опытных групп ОМ почек, селезенки, сердца, семенников тимуса была такой же, как в контрольной группе. Однако, как следует из данных табл. 2, ОМ печени и легких крыс, получавших низкую дозу НЧ (2-я опытная группа), была незначительно по абсолютной величине, но статистически достоверно ниже, чем в контрольной группе. Для высокой дозы НЧ и их макродисперсного аналога (3-я и 5-я группы) подобные эффекты не отмечены.

Всасывание в кровь макромолекул ОВА через 3 ч после его внутрижелудочного введения у крыс всех опытных групп было несколько ниже, чем в контроле, однако различия оказались статистически недостоверными. Степень окислительного повреждения ДНК, оцениваемого по экскреции 8-oxo-dG, была несколько повышена у крыс, получавших низкую дозу НЧ Al2O3 (2-я группа), но различия оказались также статистически недостоверными. У животных, получавших низкую дозу НЧ, содержание небелковых тиолов в печени было достоверно понижено по сравнению с таковым в контрольной группе. У крыс остальных опытных групп данный показатель хотя и несколько отличался от уровня в контроле, но отличие было явно недостоверным (рис. 1).

В табл. 3 приведены результаты определения у крыс стандартных биохимических показателей сыворотки крови, которые оставались в пределах физиологической нормы. Уровень глюкозы незначительно по абсолютной величине и статистически недостоверно (р=0,065) снижался только в группе животных, получавших НЧ Al2O3 в низкой дозе (по сравнению с контрольной группой). Введение указанных выше НЧ в большей дозе (3-я группа) не привело к росту активности АЛТ и АСТ. Более того, у животных этой опытной группы отмечено достоверное снижение активности АСТ по сравнению с показателем в контроле. Показатели азотистого обмена (общий белок, альбумин, креатинин, мочевая кислота) в группах крыс, получавших НЧ Al2O3, достоверно не отличались от значений в контроле. При этом уровень мочевой кислоты у животных, получавших НЧ Al2O3 в высокой дозе, был достоверно ниже, чем у получавших макродисперсный аналог. Некоторое общее снижение активности щелочной фосфатазы у крыс всех опытных групп по сравнению с контролем связано, по-видимому, с воздействием Al2O3 независимо от степени его дисперсности (р<0,05, ANOVA). Таким образом, биохимические показатели крови не выявили токсического действия НЧ Al2O3 на организм животных в диапазоне изучаемых доз.

Введение крысам 2-й и 3-й групп НЧ Al2O3 не изменяло у них общее содержание цитохромов P-450 и b-5 и активность ферментов 1-й и 2-й фазы детоксикации ксенобиотиков в микросомах печени по сравнению с показателями в контрольной группе (табл. 4). При сравнении данных, полученных у животных 2-й группы, с данными, выявленными у крыс 4-й группы, отмечено, что активность изоформ CYP1A1 и CYP2B1 у животных, получавших НЧ в низкой дозе, оказывается достоверно выше, чем у получавших макродисперсный аналог. В целом введение НЧ является фактором, значимо влияющим на активность CYP1A1 (р<0,05, ANOVA), однако наблюдаемые изменения не выходят за пределы физиологической нормы. Таким образом, введение НЧ Al2O3 не вызывает каких-либо существенных нарушений в функционировании микросомальной системы детоксикации ксенобиотиков в печени.

Анализ неседиментируемой активности лизосомальных гидролаз в печени животных позволил установить, что данный показатель не изменяется под воздействием НЧ у крыс 2-й и 3-й групп по сравнению с контролем. При этом отмечена меньшая неседиментируемая активность j3-глюкуронидазы в 3-й группе, чем в 5-й (соответственно 6,41±0,31 и 7,70±0,28%; р<0,05). Таким образом, внутрижелудочное введение НЧ Al2O3 не приводит к снижению стабильности мембран лизосом печени.

Показатели, характеризующие состояние ПОЛ и системы антиоксидантной защиты, у животных опытных групп изменяются неоднозначно (табл. 5). Так, уровень диеновых конъюгатов достоверно повышен у крыс, получающих НЧ Al2O3, по сравнению с животными остальных групп (р<0,05, ANOVA). С другой стороны, содержание МДА несколько понижено у крыс 3-й группы по сравнению с 5-й (крысы, получавшие макродисперсный аналог наноматериала). Из ферментов антиоксидантной защиты следует выделить глутатионредуктазу, активность которой понижена у животных 3-й группы, получавших НЧ Al2O3 в высокой дозе.

Уровень цитокина ИЛ-10 в сыворотке крови животных 2-й и 3-й групп (соответственно 38,4±10,6 и 56,4±12,7 пг/мл) достоверно не отличался от уровня в контрольной группе (50,5±17,4 пг/мл) и в 4-й и 5-й группах (крысы, получавшие макроскопический аналог наноматериала в тех же дозах). Цитокин ИЛ-6 в пределах чувствительности метода выявлен у 1 из 10 животных 2-й группы, у 1 из 9 3-й группы, у 3 из 9 4-й группы, у 4 из 10 5-й группы и ни разу в контрольной группе. Все различия между группами по критерию Манна-Уитни оказались недостоверными. ФНО-a не был выявлен ни разу, что указывает на отсутствие у всех животных выраженных воспалительных процессов. Таким образом, какого-либо влияния НЧ Al2O3 на синтез изученных цитокинов не обнаружено.

Рис. 1. Содержание небелковых тиолов в печени крыс

В пересчете на восстановленный глутатион, мкмоль/печень (M±m). Численность групп - по 6 животных.

* - р<0,05, по сравнению с 1-й группой.

Таблица 3. Биохимические показатели сыворотки крови у животных контрольной и опытных групп (M±m)

Концентрация гемоглобина, общее количество эритроцитов и величина гематокрита у животных всех опытных групп не отличались от соответствующих показателей в контрольной группе (табл. 6). В то же время средний объем эритроцитов и содержание гемоглобина в эритроците были достоверно ниже у животных 2-й группы, чем 4-й, причем различия с животными контрольной группы были недостоверными. Средняя концентрация гемоглобина в эритроците у животных всех опытных групп была ниже, чем в контрольной. Факторный анализ указывал на то, что Al2O3 независимо от степени его дисперсности оказывает влияние на этот показатель. Таким образом, выраженных нарушений в состоянии эритроцитов у крыс, получавших НЧ Al2O3, не обнаружено; отклонения отдельных показателей были невелики по абсолютной величине и не зависели от дозы вводимого наноматериала.

Изучение лейкоцитарной формулы крови (общее содержание лейкоцитов, лимфоциты, моноциты, базофилы, эозинофилы, нейтрофилы, незрелые гранулоциты) не выявило каких-либо влияний на эти показатели со стороны НЧ Al2O3. Количество тромбоцитов в крови животных всех опытных групп соответствовало показателю в контроле, хотя и отмечалось достоверное снижение количества тромбоцитов у животных 3-й и 5-й групп (соответственно 619±23 и 622±21 млрд/л) по сравнению с контролем (718±31млрд/л). Рассматриваемый эффект, таким образом, не может быть отнесен к действию НЧ, а, по-видимому, обусловлен введением оксида алюминия независимо от степени его дисперсности.

Таблица 4. Содержание цитохромов Р450 и b5 и активность ферментов 1-й и 2-й фазы детоксикации ксенобиотиков (M±m) у животных контрольной и опытных групп

Таблица 5. Состояние ПОЛ и системы антиоксидантной защиты у животных контрольной и опытной групп (М±m)

Исследование показателей апоптоза гепатоцитов (доля живых клеток; доля клеток, находящихся встадиях раннего и позднего апоптоза; сумма клеток в апоптозе; число мертвых клеток) не выявило различий между животными опытных и контрольной групп.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что использованные нами дозы НЧ оксида алюминия (1 и 100 мкг на 1 кг массы тела животных) при ежедневном внутрижелудочном их введении в течение 28 дней лабораторным крысам не вызывают у них существенных изменений изученных дозозависимых показателей.

Характеристика наночастиц оксида алюминия методом электронной микроскопии проведена на кафедре биоинженерии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова (заместитель заведующего кафедрой доктор физико-математических наук, профессор К.В. Шайтан), в рамках выполнения работ по государственному контракту № 01.648.12.3022 от 11.11.2008 Министерства образования и науки РФ

Таблица 6. Показатели, характеризующие состояние эритроцитов, у животных контрольной и опытных групп (М±m)

Литература

1. Распопов Р.В., Верников В.М., Шумакова А.А. и др. // Вопр. питания. - 2010. - Т. 79, № 4. - С. 21-30.

2. Распопов Р.В., Арианова Е.А., Трушина Э.Н. и др. // Вопр. питания. - 2011. - Т. 80, № 4. - С. 36-41.

3. Распопов Р.В., Трушина Э.Н., Гмошинский И.В., Хотимченко С.А. // Вопр. питания. - 2011. - Т. 80, № 3. - С. 25-30.

4. МУ 1.2.2520-09 "Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов". - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009. - 35 с.

5. МУ 1.2.2745-10 "Порядок отбора проб для характеристики действия наноматериалов на лабораторных животных". - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010. - 41 с..

6. Coleman J.G., Johnson D.R., Stanley J.K. et al. // Environ. Toxicol. Chem. - 2010. - Vol. 29, N 7. - P. 1575-1580.

7. Di Virgilio A.L., Reigosa M., de Mele M.F. // J. Biomed. Mater. Res. A. - 2010. - Vol. 92, N 1. - P. 80-86.

8. Dong E., Wang Y., Yang S.T., Yuan Y. et al. // J. Nanosci. Nanotechnol. - 2011. - Vol. 11, N 9. - P. 7848-7856.

9. Kim I.S., Baek M., Choi S.J. // J. Nanosci. Nanotechnol. - 2010. - Vol. 10, N 5. - P. 3453-3458.

10. Li M., Czymmek K.J., Huang C.P. // J. Hazard. Mater. - 2011. - Vol. 187, N 1-3. - P. 502-508.

11. List of manufactured nanomaterials and list of endpoints for phase one of the OECD testing programme // Series on the safety of manufactured nanomaterials, N 6, OECD, 2008. - 13 p.

12. Lu S., Duffin R., Poland C. et al. // Environ. Health Perspect. - 2009. - Vol. 117, N 2. - P. 241-247.

13. McLeish J.A., Chico T.J., Taylor H.B. et al. // Thromb. Haemost. - 2010. - Vol. 103, N 4. - P. 797-807.

14. Musee N., Oberholster P.J., Sikhwivhilu L. et al. // Chemosphere. - 2010. - Vol. 81, N 10. - P. 1196-1203.

15. Pauluhn J. // Toxicol. Sci. - 2009. - Vol. 109, N 1. - P. 15 2 -16 7.

16. Radziun E., Dudkiewicz-Wilczynska J., Ksiaek I. et al. // Toxicol. In Vitro. - 2011. - Vol. 25, N 8. - P. 1694-1700.

17. Stadler T., Buteler M., Weaver D.K. // Pest. Manag. Sci. - 2010. - Vol. 66, N 6. - P. 577-579.

18. Stanley J.K., Coleman J.G., Weiss C.A.Jr. et al. // Environ. Toxicol. Chem. - 2010. - Vol. 29, N 2. - P. 422-429.

19. Stuart C.A., Twistelton R., Nicholas M.K. et al. // Clin. Allergy. - 1984. - Vol. 14, N 6. - P. 533-535.

20. Zhang Q.L., Li M.Q., Ji J.W. et al. // Int. J. Immunopathol. Pharmacol. - 2011. - Vol. 24, suppl. 1. - P. 23S-29S.