Influence of dioxide titanium nanoparticles on immune system indicators in rats

AbstractWe investigated the possible influence of titanium dioxide TiO2 nanoparticles (NPs) (rutile form) on immunological parameters in rats. The experiment was carried out on 40 male Wistar rats, separated on 4 groups. Rats of 1 and 2 groups received intragastrically deionized water, 3 and 4 groups – aqueous dispersion of NPs in dose of 100 mg/kg body weight every day. Rats of 2 and 4 groups were immunized intraperitoneally with 100 mkg egg ovalbumin (OVA) on the 1st, 3rd and 5th days of the experiment. On day 21 was administered an additional 10 mkg OVA. In this study were assessed the concentration of specific IgG antibodies (humoral immune response), levels of IL-6, IL-10 and TNF-α, expression of lymphocyte antigens CD45RA, CD3, CD4, CD8, CD161a, phagocytic activity of neutrophils, lymphocyte apoptosis, hematology characteristics of blood. The studies showed that intra-gastric administration of rats with NPs in rutile form generates significant increase of humoral immune response against food antigen (p<0,05 according to the Student t-test). In the analysis of leukogram it was found a significant decrease of immature cells in immunized animals when exposed to NPs. Administration of NPs resulted in a significant decrease of the relative numbers of B-lymphocytes in immunized animals, and generated a significant increase in the phagocytic activity of peripheral blood neutrophils. Stimulation index of phagocytosis significantly increased at reception of NP by non-sensitized animal s. Effect s of N P r utile on le vel s of c ytok ine production ( I L- 6 , I L-10, T N F- α), on hematological characteristics of blood were insignificant both in intact and immunized animals. Thus, it is shown the intragastric administration of NP rutile has some influence on the specific and nonspecific unit of immune system in immunized and intact rats.

Keywords:nanoparticles, titanium dioxide, toxicity, immune response

Вопр. питания. - 2012. - № 6. - С. 47-53.

Искусственные наночастицы (НЧ) и наноматериалы, объемы производства и использования которых быстро возрастают, должны рассматриваться как принципиально новый фактор окружающей среды с потенциально возможным неблагоприятным воздействием на здоровье человека [7, 8, 12, 27]. В составе пищевых продуктов могут присутствовать наноматериалы, в частности НЧ диоксида титана (TiO2) в результате случайной контаминации ими продовольственного сырья, воды и воздуха производственных помещений или вследствие миграции НЧ из упаковочных материалов, а также преднамеренного добавления в продукты, например, в качестве пищевых добавок [3, 6, 12, 15, 18, 31]. Учет рисков, связанных с экспонированием человека НЧ через пищевые продукты, требует выявления и характеристики всех возможных отдаленных неблагоприятных воздействий наноматериалов на организм при поступлении их через желудочно-кишечный тракт. Одной из возможных мишеней воздействия НЧ при этом может быть иммунная система, поскольку в лимфоидной ткани кишки сосредоточена значительная часть иммунокомпетентных клеток организма [29]. В случае проникновения НЧ из просвета кишечника в кровь [20] нельзя исключать и системного иммунотоксического действия этих частиц [24].

Влияние НЧ TiO2 на систему иммунитета исследовалось в различных модельных системах, а также в условиях in vivo. Так, выявлены [17, 19, 26, 33] признаки наступления апоптоза, увеличение продукции интерлейкинов (ИЛ) при воздействии указанных НЧ на различные линии клеток. В ряде статей [16, 21, 22, 25, 28, 30] сообщается об изменении продукции различных цитокинов, иммуноглобулинов, нарушениях в Т- и В-клеточном звеньях иммунитета при введении НЧ животным парентеральным или ингаляционным путем.

В частности, показано [23], что при введении этого наноматериала крысам интратрахеально происходят повреждения мембраны и ультраструктуры макрофагов, а также увеличение или снижение фагоцитарной активности при воздействии соответственно низких или больших доз НЧ TiO2. В альвеолярных лейкоцитах авторы наблюдали дозозависимое возрастание синтеза оксида азота и продукции фактора некроза опухолей α (ФНО-α). Однако в литературе практически отсутствуют данные о возможном иммунотоксическом действии НЧ TiO2 при пероральном их поступлении. В связи с этим целью настоящей работы явилась оценка воздействия НЧ TiO2 на систему иммунитета при многократном внутрижелудочном их введении интактным и иммунизированным пищевым антигеном крысам.

Материал и методы

В исследовании применяли препарат НЧ TiO2 (рутильная форма) производства фирмы SigmaAldrich (США - Германия) (далее - рутил). По данным трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ), препарат был представлен частично агрегированными палочковидными частицами размером в среднем 5Ч40 нм .

Эксперименты проведены на 40 крысах - самцах Вистар с исходной массой тела 100-120 г. Животные были разделены на 4 равные по численности группы и на протяжении всего эксперимента (28 дней) получали сбалансированный полусинтетический рацион в соответствии с методическими указаниями [4]. Крыс размещали в клетках по 3 особи; рацион и воду животные получали в режиме свободного неограниченного доступа. Водную дисперсию НЧ, после предварительной обработки ультразвуком (5 мин, 22 Вт, 44 кГц) вводили крысам 3-й и 4-й групп ежедневно внутрижелудочно через зонд в дозе 100 мг на 1 кг массы тела. Крысы 1-й и 2-й групп получали в тех же условиях носитель наноматериала - деионизованную воду. На 1-й, 3-й и 5-й дни опыта крыс 2-й и 4-й групп внутрибрюшинно иммунизировали по схеме [32]: 100 мкг 5-кратно перекристаллизованным овальбумином куриного яйца (ОВА), адсорбированным на 10 мг свежеосажденного гидроксида алюминия. На 21-й день вводили дополнительно еще 10 мкг ОВА в тех же условиях для индукции вторичного иммунного ответа. На 29-й день эксперимента крыс умерщвляли путем полного обескровливания, проводимого под эфирным наркозом. Из нижней полой вены брали кровь для исследования и готовили сыворотку.

Интенсивность гуморального иммунного ответа оценивали по концентрации циркулирующих специфических IgG-антител с помощью непрямого твердофазного иммуноферментного теста (ИФА) на полистироле [1]. Ответ антител анализировали на основе уровня антител в сыворотке крови (мг/см3), десятичного логарифма концентрации и величины оптической плотности в реакции ИФА за вычетом фона (неспецифической сорбции) контрольного образца.

Экспрессию антигенов CD45RA, CD3, CD4, CD8, CD161a на лимфоцитах периферической крови определяли методом прямого иммунофлюоресцентного окрашивания клеток цельной крови с использованием панели моноклональных антител, конъюгированных с флюоресцентными красителями: FITC, PC7, APC (IO Test, производства фирмы Beckman Coulter, США). В работе использовали следующие антитела: CD45RA (клон ОХ-33) - экспрессируется на В-лимфоцитах, моноцитах, наивных Т-клетках; CD3 (клон 1F4) - экспрессируется на Т-лимфоцитах; CD4 (клон ОХ-38) - экспрессируется на Т-лимфоцитах -хелперах; CD8 (клон ОХ-38) экспрессируется на цитотоксических Т-лимфоцитах, CD161а (клон 10/78) - экспрессируется на NK-клетках. Измерения проводили на проточном цитофлюориметре FC-500 производства фирмы Beckman Coulter, США.

При оценке фагоцитарной активности нейтрофильных лейкоцитов периферической крови крыс использовали лейкоциты, выделенные по стандартной методике [5] из цельной периферической крови. Тестирование выполняли с помощью набора реагентов "Phagocytosis Assay Kit" (IgG FITC) производства фирмы Cayman Chemical Company (США) в соответствии с прилагаемой инструкцией. Объектом фагоцитоза служат частицы латекса, опсонизированные IgG FITC. Анализ проб проводили на цитофлюориметре по программе "Cytomics CXP Software". При этом популяцию нейтрофильных лейкоцитов выделяли с помощью гейтирования по параметрам малоуглового (FS) и бокового (SS) светорассеяния. Результаты (процент клеток, инкорпорировавших частицы латекса) регистрировали на канале флюоресценции Fl1.

Апоптоз лимфоцитов периферической крови изучали методом цитофлюориметрии с использованием флюоресцентных зондов аннексина V-FITC и 7-аминоактиномицина D (7-AAD). Принцип анализа и методика подробно изложены в нашей предыдущей работе [11].

На гематологическом анализаторе "Coulter AC TTM 5 diff OV" (Beckman Coulter, США) с использованием стандартного набора реагентов (Beckman Coulter, Франция) в образце цельной крови определяли следующие параметры: количество эритроцитов, лейкоцитов, содержание гемоглобина, гематокрит, средний объем эритроцита, среднюю концентрацию гемоглобина в эритроците, лейкоцитарную формулу, количество тромбоцитов, средний объем тромбоцита, относительный объем тромбоцитов, наличие (в %) незрелых клеток.

Определение ИЛ-6 и -10, а также ФНО-α в сыворотке крови крыс проводили методом двухвалентного твердофазного биотинстрептовидинового иммуноферментного теста ("сэндвич"ИФА) с использованием коммерческих наборов "Bioscience" (Bender MedSystems GmbH, Австрия) [5]. Оптическую плотность измеряли при длине волны 450 нм на автоматическом планшетном фотометре "ЭФОС 9305" (производства фирмы ОАО "МЗ Сапфир", Россия).

Достоверность (р) различий средних показателей в группах определяли с использованием двустороннего t-теста Стьюдента. О различии распределений показателей судили по величине непараметрического рангового критерия Манна-Уитни. Различия считали достоверными при р<0,05. Однородность распределения величины определяемого показателя для всех групп животных проверяли с помощью теста на остаточную дисперсию (критерий ANOVA) и факторного анализа на наличие иммунизации и НЧ рутила.

Результаты и обсуждение

В табл. 1 представлены результаты определения специфических IgG-антител крыс к ОВА. Как следует из полученных данных, у неиммунизированных животных (1-я и 3-я группы) антитела в сыворотке крови практически отсутствуют, тогда как у иммунизированных (2-я и 4-я группы) отмечается высокий гуморальный иммунный ответ (р<0,001; ANOVA). У животных 2-й группы (иммунизированные на фоне получения деионизованной воды) средний уровень антител в сыворотке крови был в 1,71 раза ниже, чем у животных 4-й группы, иммунизированных ОВА на фоне внутрижелудочного введения НЧ рутила (р<0,05; t-тест). Таким образом, внутрижелудочное введение НЧ рутила животным приводит к достоверному усилению у них гуморального иммунного ответа на модельный пищевой антиген, что может рассматриваться как признак усиления системной сенсибилизации организма этим белком, являющимся в условиях используемой экспериментальной модели аллергеном [32].

Как показали результаты определения ИЛ (цитокинов) в сыворотке крови, ИЛ-6 был выявлен только у 1 животного из 1-й группы и у 1 из 3-й группы. ФНО-α в пределах чувствительности метода не выявлен ни в одном случае. Таким образом, синтез этих цитокинов, свидетельствующих об интенсивности воспалительных процессов, в условиях данной экспериментальной модели практически не наблюдается. Средний уровень ИЛ-10 у животных 1-4-й групп составил соответственно (M±m) 63,87±8,44; 50,07±4,86; 57,13±7,42 и 54,23±3,70 пг/см3 (распределение однородное; р>0,05; ANOVA). Сравнение 1-й группы со 2-й и с 3-й группами, а также 2-й с 4-й показало, что уровень ИЛ-10 существенно не изменяется под влиянием как иммунизации, так и введения НЧ (р>0,05). Факторный анализ подтвердил отсутствие влияния на данный индикатор как иммунизации, так и введения НЧ (р>0,05, ANOVA). Таким образом, влияния НЧ рутила на содержание в сыворотке крови перечисленных цитокинов не выявлено ни у иммунизированных, ни у неиммунизированных животных.

Изучение гематологических показателей позволило установить, что как иммунизация ОВА, так и внутрижелудочное введение рутила не приводят к существенному изменению состояния эритроцитов. Данный результат применительно к неиммунизированным животным 1-й и 3-й групп, в принципе, совпадает с данными, полученными ранее на аналогичной модели [10].

Результаты анализа лейкоцитарной формулы (табл. 2) показывают, что основной клеточной популяцией при сенсибилизации крыс модельным пищевым антигеном являются базофилы, что типично для данного вида животных [32]. Введение НЧ рутила сказывается только на незначительном по абсолютной величине, но достоверном снижении численности незрелых клеток (бластов) на фоне иммунизации. Остальные показатели существенно не реагируют на иммунизацию животных белковым антигеном и введение им НЧ.

Результаты оценки апоптоза лимфоцитов периферической крови животных 1-4-й групп с использованием метода проточной цитофлюориметрии в системе AnV-FITC/7-AAD показали, что ни иммунизация ОВА, ни введение НЧ рутила существенным образом не влияют на рассматриваемые показатели.

Таблица 1. Показатели интенсивности гуморального иммунного ответа (уровень специфических IgG-антител к овальбумину) у животных 1-4-й групп (M±m)

Таблица 2. Показатели лейкоцитов у крыс 1-4-й групп, иммунизированных овальбумином и получающих наночастицы диоксида титана (M±m)

В табл. 3 количественно охарактеризованы основные субпопуляции лимфоцитов периферической крови крыс исследуемых групп. Как следует из представленных данных, иммунизация ОВА оказывает стимулирующее воздействие на уровень Т-хелперов (CD3+CD4+) при соответствующем снижении относительного содержания цитотоксических Т-лимфоцитов (CD3+CD8+), что приводит к повышению иммунорегуляторного индекса (р<0,05; ANOVA). Внутрижелудочное введение НЧ у иммунизированных и неиммунизированных животных существенно не влияет на указанные субпопуляции лимфоцитов (р>0,05; ANOVA). Из результатов сравнения показателей у животных 2-й и 4-й групп видно, что прием НЧ приводит к достоверному снижению относительного числа В-лимфоцитов у иммунизированных животных. Это, по-видимому, обусловлено более активной дифференцировкой В-лимфоцитов в плазматические клетки, являющиеся, как известно, продуцентами IgG-антител к ОВА.

Как следует из данных табл. 4, показатель фагоцитарной активности нейтрофильных лейкоцитов периферической крови достоверно не связан с факторами иммунизации пищевым антигеном и введения НЧ рутила при раздельном их использовании (р>0,05; ANOVA). Однако при сравнении животных 2-й и 4-й групп установлено, что введение животным НЧ рутила на фоне иммунизации приводит к достоверному увеличению данного показателя. Индекс стимуляции (ИС) фагоцитоза достоверно выше у иммунизированных животных, получавших НЧ рутила, чем у неиммунизированных, получавших воду. Факторный анализ показывает, что ИС является чувствительным индикатором воздействия на крыс как при иммунизации, так и при введении НЧ (р<0,05; ANOVA). Таким образом, фагоцитарная активность нейтрофильных лейкоцитов также может рассматриваться как одна из мишеней воздействия НЧ рутила как у иммунизированных, так и у неиммунизированных животных.

Полученные данные свидетельствуют о том, что внутрижелудочное введение НЧ рутила стимулирующе влияет как на показатели специфического звена иммунитета (продукция IgG-антител к ОВА), так и на неспецифическую резистентность организма (фагоцитоз). Как было показано в недавних исследованиях [2], выполненных с использованием метода радиоактивных индикаторов, НЧ рутила при однократном внутрижелудочном введении крысам в высокой дозе незначительно всасываются в кровь из кишечника и выявляются во внутренних органах (печени) только в следовых количествах. По данным ТЭМ, при внутрикишечном введении крысам НЧ рутила только единичные его частицы проникают в энтероциты слизистой оболочки стенки кишки [9]. В то же время при многократном внутрижелудочном введении НЧ рутила крысам (что соответствует модели, примененной в настоящей работе) можно выявить очень небольшое накопление диоксида титана в печени [9]. В совокупности эти данные не позволяют исключить возможность воздействия НЧ рутила на некоторые популяции иммунных клеток, что может проявляться, в частности, в адъювантном эффекте (усиление гуморального иммунного ответа на пищевой аллерген). Следствием этого может быть, в частности, усиление аллергической сенсибилизации. Другой возможный механизм воздействия НЧ рутила на функцию иммунной системы организма может состоять в опосредованном влиянии этих частиц на состав микроорганизмов кишечного содержимого, обладающих, как известно, чрезвычайно высоким иммунорегуляторным потенциалом [14]. На возможность реализации такого механизма указывают выявленные ранее эффекты подавления функциональной активности нормальной кишечной бифидофлоры НЧ рутила, вводимых внутрижелудочно [13]. Чтобы установить, какой из возможных механизмов иммунотропного действия НЧ диоксида титана реализуется в действительности, необходимы дополнительные исследования.

Работа выполнена за счет средств Федерального бюджета, по государственному контракту с Министерством образования и науки РФ в рамках Федеральной целевой программы "Развитие инфраструктуры наноиндустрии в Российской Федерации на 2008-2011 годы".

Таблица 3. Показатели клеточного звена иммунитета (субпопуляции лимфоцитов, %) у крыс 1-4-й групп, иммунизированных овальбумином и получающих наночастицы диоксида титана (M±m)

Таблица 4. Фагоцитарная активность нейтрофильных лейкоцитов у животных 1-4-й групп (M±m)

Литература

1. Боровик Т.Э., Гмошинский И.В., Рославцева Е.А. и др. // Педиатрия. - 1998. - № 5. - С. 50-56.

2. Бузулуков Ю.П., Гмошинский И.В., Распопов Р.В. и др. // Мед. радиол. и радиационная безопасность. - 2012. - Т. 57, № 3. - С. 5-12.

3. Верников В.М., Арианова Е.А., Гмошинский И.В. и др. // Вопр. питания. - 2009. - Т. 78, № 2. - С. 4-17.

4. МУ 1.2.2520-09. Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009. - 36 с.

5. МУ 1.2. 2635-10. Медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010. - 123 с.

6. Невзорова В.В., Гмошинский И.В., Хотимченко С.А. // Вопр. питания. - 2009. - Т. 78, № 4. - С. 54-60.

7. Онищенко Г.Г., Арчаков А.И., Бессонов В.В. и др. // Гиг. и сан. - 2007. - № 6. - С. 3-10.

8. Онищенко Г.Г., Тутельян В.А. // Вопр. питания. - 2007. - Т. 76, № 6. - С. 4-8.

9. Онищенко Г.Е., Ерохина М.В., Абрамчук С.С. и др. // Бюл. экспер. биол. - 2012. - Т. 154, № 8. - С. 231-237.

10. Распопов Р.В., Верников В.М., Шумакова А.А. и др. // Вопр. питания. - 2010. - Т. 79, № 4. - С. 21-30.

11. Распопов Р.В., Трушина Э.Н., Гмошинский И.В., и др. // Вопр. питания. - 2011. - Т. 80, № 3. - С. 25-30.

12. Хотимченко С.А., Гмошинский И.В., Тутельян В.А. // Гиг. и сан. - 2009. - № 5. - С. 7-11.

13. Шевелева С.А., Кузнецова Г.Г., Батищева С.Ю. и др. // Вопр. питания. - 2010. - Т. 79, № 5. - С. 29-34.

14. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Т. 1: Микрофлора человека и животных и ее функции. - М. : ГРАНТЪ, 1998. - 287 с.

15. Chaudhry Q., Scotter M., Blackburn J. et al. // Food Addit. Contam. - 2008. - Vol. 25, N 3. - P. 241-258.

16. Duan Y., Liu J., Ma L. et al. // Biomaterials. - 2010. - Vol. 31, N 5. - P. 894-899.

17. Gonсalves D.M., Chiasson S., Girard D. // Toxicol. In Vitro. - 2010. - Vol. 24, N 3. - P. 1002-1008.

18. Hassellоv M., Readman J.W., Ranville J.F., Tiede K. // Ecotoxicology. - 2008. - Vol. 17, N 5. - P. 344-361.

19. Hussain S., Thomassen L.C., Ferecatu I. et al. // Part. Fibre Toxicol. - 2010. - Vol. 7, N 10. - P. 1-17.

20. Jani P., Halbert G.W., Langridge J., Florence A.T. // Pharm. Pharmacol. - 1990. - Vol. 42. - P. 821-826.

21. Kim I.S., Baek M., Choi S.J. // J. Nanosci. Nanotechnol. - 2010. - Vol. 10, N 5. - P. 3453-3458.

22. Larsen S.T., Roursgaard M., Jensen K.A., Nielsen G.D. // Basic Clin. Pharmacol. Toxicol. - 2010. - Vol. 106, N 2. - P. 114-117.

23. Liu R., Zhang X., Pu Y. et al. // J. Nanosci. Nanotechnol. - 2010. - Vol. 8, N 10. - P. 5161-5169.

24. Lomer M.C., Thompson R.P., Powell J.J. // Proc. Nutr. Soc. - 2002. - Vol. 61, N 1. - P. 123-130.

25. Moon C., Park H.J., Choi Y.H. et al. // J. Toxicol. Environ. Health A. - 2010. - Vol. 73, N 5. - P. 396-409.

26. Morishige T., Yoshioka Y., Tanabe A. et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2010. - Vol. 392, N 2. - P. 160-165.

27. Oberdцrster G., Maynard A., Donaldson K. et al. // Part. Fibre Toxicol. - 2005. - Vol. 2, N 1. - P. 8-43.

28. Rossi E.M., Pylkkдnen L., Koivisto A.J. et al. // Toxicol. Sci. - 2010. - Vol. 113, N 2. - P. 422-433.

29. Salminen S., Bouley C., Boutron M.C. et al. // Br. J. Nutr. - 1998. - Vol. 80, suppl. S1. - P. S147-S171.

30. Shin J.A., Lee E.J., Seo S.M. et al. // Neuroscience. - 2010. - Vol. 165, N 2. - P. 445-454.

31. Sigubayashi K., Todo H., Kimura E. // J. Toxicol. Sci. - 2008. - Vol. 33, N 3. - P. 293-298.

32. Stokes С.R., Miller В.G., Bourne F.J. Animal models of food sensitivity // Food Allergy and Intolerance. - London: Bailliere Tindall, 1987. - P. 286-300.

33. Wilhelmi V., Fischer U., van Berlo D. et al. // Toxicol. In Vitro. - 2012. - Vol. 2, N 26. - P. 323-334.