Effects of taurine supplementation on apoptosis, lipid peroxidation and proteomic pools of subcellular fractions of rats hepatic cells during ontogenesis

AbstractDuring research specific proteomic pools of subcellular fractions of rats hepatic cells typical for different states of ontogenesis were identified. Taurine supplementation during early ontogenesis leads to a production of a catalase in rats’ microsomes, that may be an evidence of activation of antioxidant defense system. Majority of proteomic markers (С-type lectin, SH2B1, protein phosphatase-1), which was investigated during taurine supplement, are rather identify features of energy homeostasis, than common assessment of apoptosis or expression certain set of proteins. This fact confirms the requirement of using proteomic diagnostic during nutriproteomic studies that allows defining efficiency and probable risks of using biological active substances in nutrition.

Keywords:taurine, proteomic, ontogenesis, apoptosis, lipid peroxidation

Вопр. питания. - 2012. - № 5. - С. 45-50.

Таурин (2- аминоэтансульфоновая кислота) в небольших количествах присутствует в тканях и желчи животных, а также человека. Таурин образуется в организме при ферментативном окислении сульфгидрильной группы SH-цистеина с участием цистеиндеоксигеназы до цистеинсульфиновой кислоты с последующим ее декарбоксилированием в гипотаурин и окислением последнего в таурин. Таурин функционирует в качестве химического проводника в конъюгации урсодеоксихолевой кислоты, снижает стресс, приходящийся на эндоплазматическую сеть при воздействии на организм различных эндогенных и внешних факторов, а также служит регулятором митохондриального синтеза белка, увеличивая деятельность цепи переноса электронов и защищая митохондрии от чрезмерного формирования супероксидов [16]. Таурин действует как антиокислитель, предотвращая выход свободных радикалов, сформированных в реактивной митохондриальной среде клеток, и способствует обмену витаминов [1, 12, 13].

Таурин в качестве биологически активного ингредиента используется в составе специализированных пищевых продуктов, предназначенных для питания спортсменов. В частности, он входит в состав тонизирующих (энергетических) напитков и биологически активных добавок к пище (БАД), используемых в питании спортсменов. При этом уровень потребления таурина не должен превышать 3-4 г/сут; максимальная его доза, используемая в клинике и не вызывающая токсических проявлений, - 15 г/сут [6, 18].

Целью настоящей работы явилось экспериментальное исследование отдельных биохимических закономерностей регуляции и адаптации организма при длительном включении в рацион таурина. С учетом целей исследования были изучены протеомные особенности микросомальной и цитозольной фракций печени, интенсивность апоптоза гепатоцитов, состав жирных кислот, интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) в процессе онтогенеза.

Материал и методы

В работе использованы 64 белые беспородные крысы, выведенные в питомнике РАМН (самцыотъемыши с исходной массой тела 90-110 г). Животные были разделены на 2 равные группы: контрольную и опытную. Всех животных содержали на стандартном полусинтетическом рационе. Животные опытной группы (в отличие от контрольных) на фоне этого рациона получали 1% водный раствор таурина, что соответствует физиологическим дозам для крыс [14, 20, 24].

Кормление крыс осуществляли без ограничений со свободным доступом к воде. Животных ежедневно осматривали и 1 раз в месяц определяли массу тела. Через 1, 3, 6 и 12 мес от начала эксперимента по 8 животных из каждой группы умерщвляли путем декапитации под легким эфирным наркозом в соответствии с требованиями Европейской конвенции по защите экспериментальных животных (86/609 ЕЕС) и подвергали патологоанатомическому вскрытию. На секции отбирали печень и кровь. В печени методом [2, 15] с помощью хроматографа "Carloerba strumentazione" HRGC 5300 с использованием фазы DB23 ("Agilent Technologies", США) и программноаппаратного комплекса для сбора и обработки хроматографических данных "МультиХром for Windows" версия 1.5х (ЗАО "Амперсенд") определяли содержание полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) семейств ω-3 и ω-6. В сыворотке крови хроматографически определяли таурин, для чего использовали HPLC Agilent 1100 c FLDдетектором при следующих параметрах разделения: колонка Agilent ZORBAX Eclipse AAA (5 мкм; 4,6 Ч 250 мм); подвижная фаза: А - 0,02М КН2РО4 рН 7,8, В-метанол-225/ацетонитрил-225/вода - 5 мл; дериватизирующий агент - 9-флуоренилметилхлорформиат 98%.

Интенсивность процессов ПОЛ оценивали по содержанию диеновых конъюгатов (ДК) и малонового диальдегида (МДА) в сыворотке крови и печени животных [21]. Активность фермент-независимых процессов ПОЛ (определение F2-простанов в сыворотке), а также антиапоптозный фактор IGF-I (инсулиноподобного фактора роста-1) определяли с использованием наборов для лабораторных крыс ImmunoDiagnosticSystems Ltd. (Великобритания).

Выделение микросомальной и цитозольной фракции гепатоцитов крыс осуществляли по стандартной методике дифференциального центрифугирования [19]. Разделение белков в сыворотке крови, а также в микросомальной и цитозольной фракцииях гепатоцитов проводили методом двумерного электрофореза; окрашивание азотнокислым серебром - как описано ранее [4], гидролиз белка трипсином и регистрацию масс-спектров - по методике [5]. Исследования методом массспектрометрии были выполнены в Центре коллективного пользования "Протеом человека" ИБМХ РАМН (Москва).

Апоптоз гепатоцитов крыс изучали методом проточной цитометрии [3] с подсчетом общего числа апоптотических клеток, а также числа клеток, находящихся в раннем и позднем апоптозе. Суспензию гепатоцитов получали с помощью автоматической системы для механической гомогенизации ткани "BD Medimachine" производства "Becton Dickenson and Company" (США). Полученные данные подвергали компьютерному статистическому анализу по программе SPSS Statistics Base 17,0. Сравнение между группами проводили по критерию Стьюдента. Различия между группами считали достоверными при р<0,05.

Результаты и обсуждение

Содержание таурина в сыворотке крыс опытной группы уже через 1 мес эксперимента было в 3,9 раза выше, чем в контроле (соответственно 0,031 и 0,118 мкг/мл). Через 3 мес эксперимента содержание таурина в сыворотке крови у животных опытной группы стало максимальным (0,204 мкг/мл), т.е. увеличилось в 6,6 раза по сравнению с уровнем в те же сроки в контроле. В дальнейшем концентрация таурина в сыворотке крови животных опытной группы существенно понижалась (р≤0,01), однако превышала уровень в контроле: через 6 мес эксперимента в 2,6 раза и через 12 мес - в 3,8 раза.

Показатели липидного обмена через 1 мес эксперимента не изменились, однако через 6 мес опыта у животных обеих групп умеренно понизилось содержание ПНЖК семейства ω-6 и увеличилось - ПНЖК семейства ω-3; как следствие этого произошло уменьшение соотношения ПНЖК ω-6 и ω-3. Именно в эти сроки эксперимента отмечено снижение содержания МДА в печени животных контрольной и опытной групп (табл. 1). Анализ результатов, характеризующих интенсивность фермент-зависимых и фермент-независимых процессов свободнорадикального окисления, не выявил сколько-нибудь значимых различий, позволяющих судить об антиоксидантном действии таурина. Следует отметить, что на протяжении всего эксперимента увеличение содержания МДА в сыворотке крови и печени было малозначимым, тогда как количество F2-изопростанов в обеих группах возрастало к 12-му месяцу эксперимента в 3,3-3,8 раза (р≤0,01), что свидетельствует о превалирующей роли фермент-независимых процессов свободнорадикального окисления в процессе старения организма [10].

При оценке интенсивности процесса апоптоза гепатоцитов у животных обеих групп (табл. 2) выявлено, что в более поздние сроки эксперимента (через 6 и 12 мес опыта) в печени усиливается (по сравнению с более ранними сроками эксперимента) интенсивность раннего апоптоза и увеличивается общее число апоптотических клеток (через 6 мес эксперимента - в 2,4 раза у животных контрольной и в 2,7 раза у животных опытной группы; через 12 мес эксперимента - соответственно в 3,1 и 3,3 раза), что, как известно, весьма характерно для процесса онтогенеза в целом. Сравнительное исследование интенсивности процесса апоптоза в различные сроки эксперимента позволило отметить 2 существенных момента: у животных опытной группы, получавших таурин в течение 12 мес, наблюдалось более выраженное, чем в контрольной группе, снижение (на 64%) интенсивности позднего апоптоза и уменьшение уровня IGF-1. Однако отчетливое снижение уровня IGF-1 (на 44% по сравнению с показателями у контрольных животных) наблюдалось через 1 месяц эксперимента. Через 6 и 12 мес эксперимента уровень IGF-I практически не различался у животных контрольной и опытной группы, что согласуется с его антиапоптозным действием с увеличением возраста животного [11]. Отчетливое протективное действие таурина проявляется через 12 мес опыта, о чем свидетельствует статистически достоверное снижение в эти сроки эксперимента относительного числа гепатоцитов, находящихся в стадии позднего апоптоза.

В ходе эксперимента получены протеомные карты сыворотки крови крыс обеих групп; было выявлено 300±61 белковых пятен. Сравнительный анализ электрофореграмм сыворотки крови крыс показал, что в начале эксперимента у крыс контрольной группы обнаруживалось 12 белковых пятен, а опытной - 9. В дальнейшем, начиная с 3 мес эксперимента эти белковые пятна исчезали, а вместо них на электрофорегаммах обнаруживались 5 новых пятен, характеризующихся иными значениями изоэлектрической точки (pJ). При этом с помощью масс-спектрометрического метода исследования сыворотки крови удалось идентифицировать только 4 белка: rCG25855, протеин фосфатаза-1 (PP1), SH2-домен белка 1B, rCG48501 (табл. 3). Так, у крыс опытной группы через 6 и 12 мес были идентифицированы не исследованный ранее белок rCG25855 и PP1, играющая важную роль в регуляции метаболизма гликогена. SH2-домен белка 1B, который участвует в передаче сигналов через ряд цитокинов и рецепторов фактора роста, включая соматотропин и инсулиноподобный фактор роста, был выявлен у животных опытной группы через 1, 3 и 6 мес эксперимента, а у животных контрольной группы - только через 1 мес опыта. Полученные результаты свидетельствуют о том, что таурин оказывает модулирующее действие на энергетический потенциал клетки. Это стало основанием для протеомного исследования микросомальной и цитозольной фракций гепатоцитов крыс, характеризующихся, как известно, повышенной лабильностью белкового состава и высокой динамикой посттрансляционных событий.

Таблица 1. Содержание F2-изопростанов в сыворотке крови, а также продуктов ПОЛ в сыворотке и печени крыс в различные сроки эксперимента (М±m)

Таблица 2. Апоптоз гепатоцитов крыс и содержание IGF-I в сыворотке крыс в различные сроки эксперимента (М±m)

Анализ протеомных карт микросомальной фракции гепатоцитов крыс, получавших в составе рациона таурин, позволил вывить 208±30 белковых пятен, причем у животных опытной и контрольной групп характерные возрастные изменения на протеомном уровне начали проявляться уже с 3 мес эксперимента: из 28 белков, отличающихся возрастными изменениями, 18 были идентифицированы уже с 3 мес, 23 белков - с 6 мес эксперимента. При протеомном исследовании микросомальной фракции гепатоцитов у крыс опытной группы выявлена каталаза через 3, 6 и 12 мес опыта, а у животных контрольной группы данный белок вообще не был идентифицирован (табл. 4).

Таблица 3. Характеристика протеомных особенностей сыворотки крыс в различные сроки эксперимента

Таблица 4. Характеристика протеомных особенностей микросомальной фракции гепатоцитов крыс в различные сроки эксперимента

Таблица 5. Характеристика протеомных особенностей цитозольной фракции гепатоцитов в различные сроки эксперимента

Как известно, каталаза, являясь основным первичным антиоксидантом системы защиты, ускоряет разложение перекиси водорода до воды, разделяя эту функцию с глутатионпероксидазой [22]. На основании полученных данных можно заключить, что длительное включение таурина в состав рациона активизирует защитные функции организма.

Цитохром b5 у животных обеих исследуемых групп был обнаружен на поздних сроках эксперимента - через 6 и 12 мес опыта. Как известно, данный белок играет значительную роль в метаболизме эндо- и экзогенных соединений, осуществляемом локализованными в различных органах и тканях организма ферментами системы цитохрома Р450 [25]. Полученные данные свидетельствуют о том, что цитохром b5 может быть маркером функциональных изменений организма, наступающих в процессе его роста.

Транстиретин - белок острой фазы, относящийся к фракции альбуминов. Основная его функция заключается в транспорте тироксина и трийодтиронина из плазмы крови в ткань головного мозга [23]. При этом следует отметить, что у животных, получавших таурин, последний был выявлен через 6 и 12 мес опыта.

Среднее количество белков, определенных на электрофореграммах цитозольной фракции гепатоцитов крыс, составило 294±33. Основным отличием в протеомном спектре данной фракции от микросомальной стало проявление малого количества белков, на более поздних сроках эксперимента: для ранних сроков опыта характерно наличие 28 белков (экспрессия 21 их них сохранилась до 6 мес), а для более поздних - только 3. Масс-спектрометрический протеомный анализ цитозольной фракции гепатоцитов крыс (табл. 5) выявил ряд характерных особенностей. Так, экспрессия лектина С-типа, участвующего в иммунных реакциях и процессе апоптоза [7] у животных контрольной группы была установлена через 1, 3 и 6 месяцев эксперимента, а у животных опытной группы - через 12 мес опыта. Это также может свидетельствовать об участии таурина в защитных функциях организма.

Экспрессия ras-связанного белка Rab-14 была установлена в ранние сроки эксперимента (через 1 мес) у животных обеих групп, однако сохранялась до 12 мес только у контрольных животных. Белки rab, принадлежащие к группе низкомолекулярных GTP-связывающихся белков, регулируют внутриклеточный транспорт мембранных структур [17].

Состояние гомеостаза организма, как известно, определяется несколькими факторами, в частности эффективностью протеолиза поврежденных белков, процесс которого катализируется протеасомами [9]. Поскольку повышенная экспрессия 26S частицы протеасомы нами установлена у животных опытной группы начиная с 1 мес эксперимента, предположительно можно говорить об участии таурина в процессе активации протеасомного комплекса. В ходе исследования циклинзависимая киназа 5 (Cdk5) была выявлена через 1 мес эксперимента у животных обеих групп и сохранилась до 3-го месяца опыта только в опытной группе. В связи с тем, что Cdk5 является несвойственным участником широко распространенного семейства циклинзависимых киназ (Cdks) и основное участие проявляет в структурно-функциональном преобразовании клеток [8], полученные данные указывают на влияние таурина в активации процессов дифференцировки клеток.

Поскольку большинство протеомных маркеров, идентифицированных при длительном воздействии модулятора энергообмена - таурина, характеризуют особенности регуляции энергетического гомеостаза клетки, это убедительно свидетельствует о необходимости использования методов протеомной диагностики при биохимических исследованиях алиментарного воздействия.

Литература

1. Бекетова Н.А., Вржесинская О.А., Кошелева О.В. и др. // Вопр. питания. - 2010. - Т. 79, № 5. - С. 61-65.

2. Руководство Р. 1.1672-03. Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище. - М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004. - 24 с.

3. Трушина Э.Н., Мустафина О.К., Гусева Г.Б. и др. // Вопр. питания. - 2011. - Т. 80, № 2. - С. 16-19.

4. Шаранова Н.Э., Батурина, В.А., Васильев А.В. и др. // Бюл. экспер. биол. - 2011. - Т. 151, № 6. - С. 624-627.

5. Шаранова Н.Э., Васильев А.В., Гаппаров М.М.Г. // Бюл. экспер. биол. - 2011. - Т. 152, № 12. - С. 658-661.

6. Ярцев Е.И., Гольдберг Е.Д., Коменников Ю.А. Таурин (фармакологические и противолучевые свойства). - М.: Медицина, 1975. - 158 с.

7. Bates E.E.M., Fournier N., Garcia E. et al. // J. Immunol. - 1999. - Vol. 163. - P. 1973-1983.

8. Ching Y.-P., Qi Z., Wang J.H. // Gene. - 2000. - Vol. 242. - P. 2 8 5 - 2 9 4.

9. Chondrogianni N., Gonos E.S. // IUBMB Life. - 2008. - Vol. 60, N 10. - P. 651-655.

10. Chu X., Ageishi Y., Nishimura K. et al. // J. Pharm. Biomed. Anal. - 2009. - Vol. 50, N 5. - P. 911-916.

11. Hall K., Hilding A., Thorеn M. // J. Endocrinol. Invest. - 1999. - Vol. 22. - P. 48-57.

12. Hansen S.H., Andersen M.L., Birkedal H. et al. // Adv. Exp. Med. Biol. - 2006. - Vol. 583. - P. 129-135.

13. Hansen S.H., Andersen M.L., Cornett C. et al. // J. Biomed. Sci. - 2010. - Vol. 17. - P. 23-25.

14. Hu J., Xu X., Yang J. et al. // Adv. Exp. Med. Biol. - 2009. - Vol. 643. - P. 75-84.

15. IUPAC 2.301, 2.302 Standard methods for the analysis of oils fats and derivates. - USA: Pergamon Press, 1979. - P. 9 6 -10 3 .

16. Jong C.J., Azuma J., Schaffer S. // Amino Acids. - 2011. - Vol. 21. - P. 43-46.

17. Junutula J.R., De Maziere A.M., Peden A.A. // Mol. Biol. Cell. - 2004. - Vol. 15. - P. 2218-2229.

18. Kohashi N., Katori R. // Jpn Heart J. - 1983. - Vol. 24, N 1. - Р. 9 1-10 2 .

19. Lake B.G. Biochemical Toxicology. A Practical Approach. - Oxford, 1987. - 184 p.

20. Li C.Y., Deng Y.L., Sun B.H. // Urol. Res. - 2009. - Vol. 37, N 4. - P. 211-220.

21. Ohkawa H., Onishi W., Yagi K. // Analyt. Biochem. - 1979. - Vol. 95. - P. 351-358.

22. Rhee S.G., Yang K.S., Kang S.W. et al. // Antioxid. Redox. Signal. - 2005. - Vol. 7, N 5-6. - P. 619-626.

23. Schreiber G., Aldred A.R., Jaworowski A. et al. // Am. J. Physiol. - 1990. - Vol. 258. - P. 338-345.

24. Yao H.T., Lin P., Chang Y.W. et al. // Food Chem. Toxicol. - 2009. - Vol. 47, N 7. - P. 1703-1709.

25. Yoo M. // Biochem. Biophys. Res. Com. - 1997. - Vol. - P. 641-642.