Characterization of fullerene С60 peroral toxicity to rats in the 92-day experiment

AbstractToxicity of fullerene C60 in male Wistar rats under conditions of a daily intragastric administration at doses of 0,1; 1 and 10 mg/kg body weight for 92 days was studied. Integral, biochemical, physiological, hematological, immunological indicators were determined that characterized the body condition of animals together with fullerene C60 biodistribution in organs and tissues of rats. Majority of the results didn’t show any influence of fullerene C60 on animals treated with it in the whole range of doses studied. On the other hand, some of the data not related to the action of the components used in carrier solution, demonstrated dose-dependent variation: found increased activity on 21–35% in the CYP2B1 at doses of 1 mg/kg and 10 mg/kg body weight, and reduced concentration of uric acid and increasing concentrations of urea at 10 mg/kg body weight. Nevertheless, these changes were within the physiologicalrange of variability. However, it is worth noting an important significant (p=0,02) increase of the absorption for antigenic proteins in the digestive tract in animals treated with fullerene C60 at a dose of 10 mg/kg, suggesting a marked effect on the intestinal wall.

Keywords:fullerene, nanoparticles, rats, toxicity

Вопр. питания. - 2012. - № 5. - С. 20-27.

Фуллерен С60 - новая аллотропная форма углерода - имеет большие перспективы в технике, медицине и пищевой промышленности. Он способен подавлять свободнорадикальные процессы в темноте, что объясняется наличием антиоксидантной [1, 8, 11, 16], гено- [1], радио- [1] и гепатопротекторной (при алкогольной интоксикации) активности [16]. Сообщается [9], что продолжительность жизни крыс, получавших многократно в течение 7 мес фуллерен С60 в оливковом масле (в дозе 1,7 мг/кг массы тела), увеличилась на 90% по сравнению с таковой у животных контрольной группы. Однако использование фуллеренсодержащей продукции сдерживается в связи с недостатком сведений о его токсикологической характеристике (в частности о максимально допустимых безопасных дозах при длительном приеме).

Согласно результатам ряда исследований, фуллерен С60 характеризуется, по-видимому, низкой токсичностью для млекопитающих (лабораторные крысы и мыши) при эпикутанном [12, 13], интратрахеальном [10, 16] и внутрибрюшинном [11] путях применения. Пероральное введение крысам водных дисперсий фуллерена (стабилизированных поверхностно-активными веществами) в дозе 1-10 мг/кг на протяжении 28 дней не приводило к ухудшению состояния здоровья животных и вызывало относительно незначительные изменения в показателях массы печени, содержания цитохрома Р450 и активности глутатионредуктазы [7]. Однако имеющиеся в настоящее время данные не позволяют сделать обоснованное заключение о безопасности перорального приема фуллерена С60 более длительное время.

Задачей настоящего исследования была характеристика токсичности фуллерена С60 для лабораторных крыс в условиях 3-месячного перорального поступления в диапазоне доз от 0,1 до 10 мг/кг. С учетом низкой растворимости фуллерена С60 в воде в качестве формы его введения была выбрана коллоидная дисперсия, стабилизированная крахмалом и пищевой добавкой Твин-80 (Е433).

Материал и методы

Дизайн эксперимента разработан в соответствии с МУ 1.2.2520-09 [3]. Исследование проведено на 75 крысах - самцах Вистар с исходной массой тела 100±5 г (M±m), полученных из питомника РАМН "Столбовая". Крыс содержали группами по 3 животных в прозрачных пластмассовых клетках из поликарбоната, в кондиционированном помещении (23-25 °С) со световым циклом 12 ч. На протяжении всего эксперимента крысы получали сбалансированный полусинтетический казеиновый рацион [3]. Доступ животных к корму и питьевой воде не ограничивали.

Животные были разделены на 5 групп по 15 крыс в каждой. Животным 1-й группы (контроль) на протяжении всего эксперимента (92 дня) ежедневно вводили внутрижелудочно дистиллированную воду. Животные 2-й группы (сравнения) в течение такого же времени ежедневно внутрижелудочно получали 1 мл раствора носителя (на 100 г массы тела) который состоял из деионизованной воды, 2% пищевого крахмала и 0,5% Твина-80 (производство "Sigma-Aldrich", США). Расчетная энергетическая ценность носителя с учетом возможности частичной ферментации его углеводного компонента в толстой кишке не превышала 0,2% от энергетической ценности дневного рациона животных.

Крысы 3, 4 и 5-й опытных групп получали ежедневно внутрижелудочно фуллерен С60 в виде раствора (дисперсии), приготовленного на указанном выше носителе: крысы 3-й группы получали фуллерен С60 в дозе 0,1 мг/кг; 4-й группы - в дозе 1,0 мг/кг массы тела; 5-й группы - в дозе 10 мг/кг. Объем вводимого раствора фуллерена С60 для животных 3, 4, 5-й групп равнялся 1 мл раствора на каждые 100 г массы тела животного.

В эксперименте был использован препарат фуллерена С60 производства ЗАО "Фуллерен-Центр" (Нижний Новгород, Россия). Качественный и количественный анализ, проведенный, согласно [2], методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), показал, что чистота используемого нами образца фуллерена С60 составляет не менее 99,8%. Фуллерен С60, используемый в наших экспериментах, предварительно тщательно растирали в ступке, добавляли дисперсионную среду, перемешивали на вортексе при 3000 об./мин 10 мин и обрабатывали в течение 3 мин на погружном ультразвуковом процессоре, при мощности импульса 80 Вт и частоте 20 кГц.

В ходе введения препарат постоянно перемешивали с помощью магнитной мешалки.

За 3 ч до окончания эксперимента 9 животным из каждой группы внутрижелудочно через зонд вводили по 2 г/кг массы лиофилизированный белок куриного яйца в виде 10% раствора в 0,15 М NaCl. Затем этих крыс умерщвляли путем глубокого обескровливания под эфирной анестезией. Остальных животных после окончания эксперимента (через 3 мес опыта) умерщвляли путем декапитации под легким эфирным наркозом и подвергали патологоанатомическому вскрытию. На секции отбирали (МУ 1.2.2745-10 [4]) кровь и внутренние органы (печень, почки, сердце, легкие, селезенку, надпочечники, семенники, тимус, головной мозг, внутрибрюшинную жировую клетчатку). С помощью методов, указанных в работах [6, 7], исследовали интегральные (состояние шерстяного покрова крыс, массу их тела, относительную массу внутренних органов), биохимические: в печени - содержание микросомальных цитохрома Р450, b5, активность ферментов Р450 метоксирезоруфин-О-деметилазы - CYP 1A2 и пентоксирезоруфин-О-деалкилазы - CYP 1В2, глутатионтрансферазы, UDP-глюкуронозилтрансферазы, глутатион-S-трансферазы, арилсульфатаз А и В, β-галактозидазы, β-глюкуронидазы, лизосомальных гидролаз - арилсульфатаз А и В, β-галактозидазы, β-глюкуронидазы, небелковых тиолов, главным образом восстановленного глутатиона. В моче определяли интенсивность окислительного повреждения ДНК по величине экскреции 8-оксо-2-дезоксигуанозина; в плазме крови - содержание общего белка, альбумина, глюкозы, креатинина, мочевой кислоты, мочевины, активность ферментов аланинаминотрасферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АС), щелочной фосфатазы, показателей интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ), - содержание диеновых конъюгатов полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК), малонового альдегида, активность глютатионредуктазы, супероксиддисмутазы, каталазы в эритроцитах, гематологических (число лейкоцитов, нейтрофилов, лимфоцитов, концентрация в крови гемоглобина, объем эритроцита, содержание гемоглобина в 1 эритроците), иммунологические (в крови содержание цитокинов-интерлейкинов (ИЛ) -6, -10, фактора некроза опухоли-α (ФНО-α), лимфоцитов CD45RA+, CD161a+, процент лимфоцитов CD3+CD4+ и CD3+CD8+ в общем числе Т-лимфоцитов, соотношение CD4 и CD8, интенсивность процесса апоптоза гепатоцитов с определением общего числа клеток, находящихся в состоянии апоптоза, в том числе раннего и позднего). У животных, которые получали куриный белок, кроме вышеперечисленных показателей, с помощью твердофазного двухвалентного иммуноферментного метода [15] определяли в сыворотке крови антигенный овальбумин.

Кроме отмеченных исследований, в органах и тканях крыс с помощью ВЭЖХ системы "Agilent 1200" с колонкой "ZORBAX C18" (размером 4,6Ч150 мм, заполнена С18 фазой с размером гранул 5 мкм) проводили количественное определение фуллерена С60. Методика пробоподготовки и анализа была подробно изложена ранее [7].

Статистический анализ данных выполняли с использованием компьютерной программы SPSS 17.0, согласно критерию ANOVA (в целях оценки однородности распределения показателей в группах и факторного анализа), тесту Стьюдента и непараметрическому тесту Манна-Уитни. Различия между группами животных признавали достоверными при p0,05.

Результаты и обсуждение

На протяжении всего 3-месячного эксперимента у животных всех опытных групп был нормальный внешний вид, без каких-либо изменений в состоянии шерстяного покрова и поведения; летальность среди животных отсутствовала. Как следует из рис. 1, крысы контрольной и всех опытных групп прибавляли в массе тела одинаково. В конце эксперимента средняя масса животных в 1-5-й группах составила соответственно 510±10; 535±18; 522±17; 523±25 и 535±11 г (распределение однородно, согласно ANOVA p>0,05; все различия были недостоверны - p>0,05). Относительная масса внутренних органов крыс всех опытных групп находилась в пределах интервала нормальных значений и достоверно не отличалась от контроля (табл. 1). Таким образом, 3-месячное внутрижелудочное введение фуллерена С60 во всех применявшихся дозах не выявило признаков токсического действия по изученным показателям.

Анализ содержания С60 во внутренних органах животных 3-5-й групп, получавших этот наноматериал в различных дозах, показал, что при ежедневном его поступлении в организм животных он не был обнаружен в большинстве исследованных органов (печени, почках, головном мозге, селезенке и жировой ткани).

Введение фуллерена С60 животным не оказывало влияния на уровень содержания в печени цитохромов Р450 и b5, а также на активность UDP-глюкуронозилтрансферазы (табл. 2). В то же время активность глутатион-S-трансферазы была повышена на 26-28% у животных 4-й группы по сравнению с животными 1-й и 2-й групп. При более высокой дозе фуллерена С60 (5-я группа) данный эффект не выявлялся. Активность изоформы Р450 CYP 1A2 была также одинаковойу животных опытных и контрольной групп. Можно предположить нестойкое воздействие фуллерена С60 на этот фермент, что было показано нами ранее [7] при 28-дневном введении фуллерена С60. Однако активность изоформы Р450 CYP 2B1 была достоверно повышена у животных 4-й и 5-й групп (по сравнению с животными 1-й и 2-й). При этом повышение составляло только 21-35% по абсолютной величине и свидетельствовало о физиологической активации системы детоксикации в условиях длительного поступления фуллерена С60 в организм, что, по-видимому, нельзя рассматривать как признак токсического действия.

Анализ неседиментируемой активности лизосомальных гидролаз печени крыс (арилсульфатаз А и В, β-галактозидазы, β-глюкуронидазы) не выявил различий между группами животных, получавших фуллерен С60, и контрольными. Таким образом, длительное пероральное введение фуллерена C60, по-видимому, не влияет на стабильность лизосомальных мембран печени.

Таблица 1. Относительная масса внутренних органов крыс (в %) 1-5-й групп на 92-й день эксперимента (M±m)

Таблица 2. Показатели активности ферментов 1-й и 2-й фазы детоксикации ксенобиотиков у крыс групп 1-5-й на 92-й день эксперимента (M±m)

Показатели перекисного окисления липидов (ПОЛ) и состояния системы антиоксидантной защиты, определенные в эритроцитах и плазме крови животных (табл. 3), свидетельствуют об отсутствии каких-либо неблагоприятных эффектов при введении животным фуллерена C60.

Содержание диеновых конъюгатов ПНЖК достоверно не различается у животных разных групп, а уровень МДА у животных, получавших высокие дозы фуллерена С60 (4-я и 5-я группы), даже имеет тенденцию к снижению по сравнению с контролем. Однако данный эффект, по-видимому, неспецифичен для фуллерена С60, так как он проявляется и у животных 2-й группы, получавших носитель (факторный анализ по наличию носителя дает значение p<0,05 в тесте ANOVA). Это же, скорее всего, происходит и при повышении активности глутатионредуктазы у крыс, получавших фуллерен С60 и носитель (2-я группа животных). Следует отметить, что возрастание активности этого фермента под действием фуллерена С60 было выявлено нами ранее [7] у животных, получавших препарат в течение 28 дней. Что же касается других ферментов антиоксидантной защиты (глутатионпероксидазы, супероксиддисмутазы, каталазы), то их активность в условиях введения фуллерена С60 не претерпевает каких-либо изменений.

Содержания в печени крыс небелковых тиолов, представленных в основном восстановленным глутатионом, составило у животных 1-5-й групп соответственно 70,7±6,9; 61,9±4,1; 69,6±6,7; 53,4±4,5 и 64,4±7,8 мкмоль. Единственная тенденция, состоящая в некотором снижении этого показателя у животных в 4-й группе, оказалась недостоверной (p>0,05) при сравнении с 1-й и 2-й группами. Таким образом, фуллерен С60, по-видимому, при длительном приеме не влияет на этот важный показатель тканевого окислительно-восстановительного гомеостаза. С этим согласуется отсутствие существенных изменений интенсивности окислительного повреждения ДНК, оцениваемого по экскреции с 8-оксо-2-дезоксигуанозина у крыс 3-5-й групп по сравнению как с контролем (1-я группа), так и со 2-й группой.

Таблица 3. Показатели перекисного окисления липидов (ПОЛ) и состояния системы антиоксидантной защиты у крыс 1-5-й групп на 92-й день эксперимента (M±m)

Таблица 4. Биохимические показатели сыворотки крови у крыс 1-5-й групп (M±m)

Анализ биохимических показателей сыворотки крови животных, приведенных в табл. 4, свидетельствует об отсутствии дозозависимых изменений у крыс, длительно получавших фуллерен С60. Активность АЛТ и АСТ у животных 3-й и 4-й групп остается в пределах колебаний, характерных для контрольных животных (1-я группа), а у крыс 5-й группы оказывается даже несколько ниже, чем в контроле. Это указывает на отсутствие токсического действия фуллерена С60 на организм. Небольшое и не являющееся дозозависимым повышение концентрации глюкозы в крови у животных 3-5-й групп по сравнению с таковым у животных 2-й группы, получавших носитель, находится тем не менее в пределах вариабельности нормы (1-я группа) и не свидетельствует об ухудшении толерантности к глюкозе под действием фуллерена С60. При наиболее высокой дозе (5-я группа животных) отмечены незначительные сдвиги в показателях азотистого обмена (рост уровня мочевины и снижение содержания мочевой кислоты) по сравнению с контролем, однако эти изменения невелики по абсолютной величине (около 20%) и не демонстрируют четкой зависимости от дозы вводимого фуллерена С60. Остальные приведенные в таблице показатели азотистого обмена и активность щелочной фосфатазы на фоне приема фуллерена С60 не претерпевают каких-либо изменений.

Гематологические показатели, характеризующие систему кроветворения (количество нейтрофилов, лимфоцитов, эритроцитов, средний объем эритроцита, концентрация гемоглобина в крови и в отдельных эритроцитах) не отличались у животных 3-5-й групп, получавших различные дозы фуллерена, от показателей в контроле у животных, получавших носитель. Показатель гематокрита был достоверно (p<0,05), но незначительно по абсолютной величине (на 4%) повышен у животных 5-й группы по сравнению с контролем, но не с животными, получавшими носитель. Анализ лейкоцитарной формулы крови животных выявил достоверные изменения в уровне общих лейкоцитов (рост на 30% у животных 4-й группы по сравнению с животными 1-й; p<0,05), лимфоцитов (рост на 10-11% у животных 3-й группы по сравнению с 1-й и 2-й группами; p<0,05) и нейтрофилов (снижение на 11-16% у животных 3-5-й групп по сравнению с 1-й, p<0,05). Все эти изменения, однако, не демонстрировали зависимости от дозы фуллерена С60 и не были достоверными по сравнению с таковыми у животных 2-й группы, получавшими носитель, т.е., возможно, имели неспецифический характер.

Рис. 1. Динамика прироста массы тела крыс 1-5-й групп на протяжении 92 дней эксперимента

Рис. 2. Всасывание антигенного ОВА в кровь животных 1-5-й групп, p=0,02 (t-тест Стьюдента)

Таким образом, какого-либо токсического действия фуллерена С60 на кровь животных опытных групп фактически не выявлено. С этим согласуется отсутствие изменений в количестве субпопуляций лимфоцитов (CD45RA+ и CD161a+, доли CD3+CD4+ и CD3+CD8+ в общем числе Т-лимфоцитов, соотношение CD4/CD8). Единственным выявленным эффектом было снижение доли Т-лимфоцитов (CD3+) с 49,55±3,03% у животных 1-й группы до 40,13±2,90% в 5-й (p<0,05). Однако эти изменения были, возможно, неспецифическими, так как не выявлялись при сравнении 5-й и 2-й групп (p>0,05). Уровни цитокинов ИЛ-6, ИЛ-10 и ФНО-а в сыворотке крови животных 3-5-й групп достоверно не отличались от таковых у контрольных животных. Эти данные в совокупности показывают, что длительный прием фуллерена С60 не сопровождается выраженным неблагоприятным воздействием на иммунный статус животных.

Длительный прием фуллерена С60 не оказывал также какого-либо влияния на апоптоз гепатоцитов, по данным исследования методом проточной цитофлюориметрии с применением красителей аннексин5-FITC и 7-аминоактиномицин D [6]. Токсического действия фуллерена С60 на печень также не установлено ни при одной из его изученных доз.

Что касается величины всасывания в желудочно-кишечном тракте антигенного овальбумина куриного яйца (ОВА), которую определяли по его концентрации в сыворотке крови, то она была достоверно выше в 5-й группе, чем во 2-й (рис. 2). Остальные различия оказались недостоверны. Таким образом, фуллерен С60 способен, по-видимому, оказывать определенное влияние на степень всасываемости в кишечнике макромолекул белка только при наибольшей из изученных нами доз (10 мг/кг). В ранее проведенном исследовании [7] введение фуллерена С60 в такой дозе на протяжении 4 нед не оказывало влияния на данный показатель.

Таким образом, в результате 92-дневного ежедневного внутрижелудочного введения фуллерена С60 выявлены следующие эффекты, которые являются дозозависимыми и не могут быть связаны с неспецифическим действием применяемого носителя: 1) повышение проницаемости кишечной стенки для макромолекул белка при дозе 10 мг/кг; 2) повышение активности CYP 2B1 при дозах 1 и 10 мг/кг массы тела; 3) снижение концентрации мочевой кислоты и повышение уровня мочевины при дозе 10 мг/кг. При этом только первый из перечисленных эффектов может быть однозначно интерпретирован как неблагоприятный, а не обусловленный физиологической адаптацией организма.

Литература

1. Пиотровский Л.Б., Киселев О.И. Фуллерены в биологии (на пути к наномедицине). - СПб.: Росток, 2006. - 336 с.

2. Методические рекомендации МР 1.2. 2641-10. Определение приоритетных видов наноматериалов в объектах окружающей среды, живых организмах и пищевых продуктах. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010. - 103 с.

3. Методические указания МУ 1.2.2520-09. Токсикологогигиеническая оценка безопасности наноматериалов. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009. - 36 с.

4. Методические указания МУ 1.2.2745-10. Порядок отбора проб для характеристики действия наноматериалов на лабораторных животных. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010. - 41 с.

5. Распопов Р.В., Верников В.М., Шумакова А.А. и др. // Вопр. питания. - 2010. - Т. 79, № 4. - С. 21-30.

6. Распопов Р.В., Трушина Э.Н., Гмошинский И.В. и др. // Вопр. питания. - 2011. - Т. 80, № 3. - С. 25-30.

7. Шипелин В.А., Арианова Е.А., Трушина Э.Н. // Гиг. и сан. - 2012. - № 2. - С. 90-94.

8. Andrievsky G.V., Bruskov V.I., Tykhomyrov A.A. et al. // Free Radic. Biol. Med. - 2009. - Vol. 47, N 6. - P. 786-793.

9. Baati T., Bourasset F., Gharbi N. et al. // Biomaterials. - 2012. - Vol. 33, N 19. - P. 4936-4946.

10. Baker G.L., Gupta A., Clark M.L. et al. // Toxicol. Sci. - 2008. - Vol. 101, N 1. - P. 122-131.

11. Gharbi N., Pressac M., Hadchouel M. et al. // Nano Lett. - 2005. - Vol. 5. - P. 2578-2585.

12. Moriguchi Т., Yano K., Hokari S. et al. // Full. Sci. Technol. - 1999. - Vol. 7. - P. 195-202.

13. Nelson M.A., Domann F.E., Bowden G.T. et al. // Toxicol. Ind. Health. - 1993. - Vol. 9, N 4. - P. 623-630.

14. Sayes C.M., Reed K.L., Warheit D.B. // Toxicol. Sci. - 2007. - Vol. 97, N 1. - P. 163-180.

15. Stuart C.A., Twistelton R., Nicholas M.K. et al. // Clin. Allergy. - 1984. - Vol. 14, N 6. - P. 533-535.

16. Tykhomyrov A.A., Nedzvetsky V.S, Klochkov V.K. et al. // Toxicology. - 2008. - Vol. 246, N 2-3. - P. 158-165.