Hygienic and toxicological safety estimation of nano- and microispersed manganese oxide (III, IV)

AbstractThe findings of the experimental study performed within the preliminary hygienic and toxicological assessment of nanodispersed manganese oxide (III, IV), which was endogastrics administered to white nonlinear mice once, showed that, under acute oral exposure to manganese oxide, nanodispersed particles were 2,6-fold more toxic and cumulative (class 3, according to the oral LD50 values) than dispersed solution with micro-sized particles (0,4–592 μm, class 4). Endogactric exposure to nanodispersed solution of manganese oxide (III, IV) in organisme produced such negative health effects as vasodilation and plethora, pathological inclusions and increased cell aggregation, which increased and became more prevalent with higher doses. The prediction of chronic toxicity parameters demonstrated that threshold and NOAEL doses for nanodispersed solution were 1,6 and 0,26 mg/kg, respectively, which are 2,3 times lower than for finely divided solution of manganese oxide (III, IV).

Keywords:manganese oxide (III, IV), nanoparticles, micropartiles, hazard identification, acute toxicity, morphologic changes

Вопр. питания. - 2012. - № 5. - С. 13-19.

В настоящее время в России по данным, представленным в национальной нанотехнологической сети, производится более 200 наименований наноматериалов. Несмотря на неоспоримые инновационные качества, наноматериалы в силу своих особых физико-химических свойств могут представлять определенную угрозу для здоровья и безопасности человека и вызывать в будущем серьезные социальные, экономические и этические проблемы [5]. Присутствие нанодисперсных частиц, в том числе тяжелых металлов, в выбросах промышленных предприятий в атмосферный воздух и сбросах в водоемы может обусловливать загрязнение источников питьевого водоснабжения и сельскохозяйственной продукции.

С учетом прогнозируемого роста контактов человека с наноматериалами, в том числе при поступлении их в организм с продуктами питания, особую актуальность приобретают вопросы их токсикологогигиенической оценки безопасности. Требуются уточнение и систематизация недостаточно изученных физических и токсикологических параметров при пероральном поступлении в организм ряда широко распространенных в объектах среды обитания наночастиц тяжелых металлов, в частности оксида марганца [4].

Цель данного исследования - токсиколого-гигиеническая оценка безопасности нанодисперсного оксида марганца (III, IV).

Материал и методы

Предварительная оценка потенциальной опасности наночастиц оксида марганца (III, IV) со структурой бернессита выполнена по расчету суммарного показателя частных опасностей (D) генеральной определительной таблицы, составленной на основании обобщения данных о физико-химических параметрах, молекулярно-биологических и токсических свойствах в соответствии с методическими указаниями [7].

Синтез и оценка удельной поверхности частиц нанодисперсного раствора оксида марганца (III, IV) проведены в лаборатории многофазных дисперсных систем института технической химии УрО РАН (г. Пермь). Водный монодисперсный наноразмерный оксид марганца (III, IV) получали в микроэмульсионной системе (водный раствор ПАВ - цетилтриметиламмоний бромид) [2]. Размер и форму тестируемого материала оценивали методом динамического светорассеивания на анализаторе частиц "Horiba LB-550" (фирма "HORIBA Jobin Yvon S.A.S.", Франция). Концентрацию частиц в растворе осуществляли методом атомноадсорбционной спектрометрии с ацетилено-воздушным пламенем на анализаторе "Perkin Elmer 3110" (фирма "Perkin Elmer Corporation", США) в лаборатории анализа наноматериалов и физических факторов отдела химико-аналитических методов исследований ФБУН "ФНЦ медикопрофилактических технологий управления рисками здоровью населения" (г. Пермь). Стабильность нанодисперсного состояния частиц в водном растворе обеспечивали ультразвуковой обработкой. Для сравнительного анализа использован водный дисперсный раствор оксида марганца (III, IV), содержащий частицы в микродиапазоне.

Параметры острой токсичности нанодисперсного оксида марганца (III, IV) оценивали на основании результатов развернутых острых опытов в соответствии с методическими указаниями [3, 6] на 70 нелинейных белых мышах - самцах с массой тела 27±2 г (M±m). Животные были разделены на 7 групп по 10 особей в каждой. Мышам опытных групп (1-3-я) вводили внутрижелудочно однократно через зонд нанодисперсный раствор оксида марганца (III, IV) в дозе соответственно 2000, 3500 и 5000 мг/кг в виде водного раствора в объеме, составляющем 1-2% от массы тела животных. Мышам групп сравнения (4-6-я) вводили микродисперсный раствор оксида марганца (III, IV) соответственно в тех же дозах, что и животным 1-3-й групп, с соблюдением аналогичных условий введения. Контрольная, 7-я группа, получала воду однократно внутрижелудочно через зонд из того же расчета.

Срок наблюдения за животными после введения тестируемых веществ составил 14 сут. Мышей содержали по 5 особей в клетке. На протяжении всего эксперимента мыши получали полусинтетический рацион согласно МУ 1.2.2520-09 "Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов" [6]. Доступ к корму и питьевой воде не ограничивали.

Параметры острой токсичности (LD50) рассчитывали с помощью статистической программы Probit Analysis v.4.0, реализующей алгоритм метода максимального правдоподобия [8]. На основании результатов исследования острой токсичности расчетным способом устанавливали индекс кумуляции по отношению результатов гибели животных в течение 1-х суток к показателю гибели в течение всего эксперимента. С целью прогноза степени опасности рассчитывали величины пороговой дозы хронического эффекта и максимально недействующей дозы для нано- и микродисперсных растворов оксида марганца (III, IV) [3].

Критериями токсического действия соединений служили летальный эффект, среднее время гибели животных, изменение поведения, общего состояния, внешнего вида, специфические симптомы развития интоксикации. У животных из 2-й и 5-й групп, погибших во время эксперимента, забирали печень, селезенку, тимус, левое и правое легкие, левую и правую почки, сердце, подвздошную кишку, головной мозг. Органы фиксировали в 10% нейтральном формалине, заливали в парафин, серийные срезы с блоков окрашивали гематоксилином и эозином. Изучали структуру органов с использованием светового микроскопа "Micros" (фирма "Micros", Австрия) при увеличении Ч200-1000. У выживших в эксперименте животных из групп 1-7 на 4-й день эксперимента забирали венозную кровь из хвостовой вены при ампутировании кончика хвоста хирургическим скальпелем, готовили мазки, фиксировали их в метиловом спирте. В дальнейшем мазки окрашивали по методу Паппенгейма, включающему комбинацию двух способов: Май-Грюнвальда и Романовского-Гимзы [1]. Оценку изменений эритроцитов и тромбоцитов в мазках крови выполняли при помощи микроскопа "Micros" (фирма "Micros", Австрия) при увеличении Ч1000. Из эксперимента животных выводили декапитацией.

Результаты и обсуждение

На основании экспериментальных исследований установлено, что фактический размер наночастиц оксида марганца (III, IV) в дисперсном растворе составил 34-39 нм (97,8% от общего количества частиц); размер его микрочастиц в дисперсном растворе, использованном в качестве сравнения, составлял 0,4-592 мкм. Наночастицы имели несферическую форму, что способствует снижению скорости их выведения из организма фагоцитирующими клетками иммунной системы через лимфатические протоки и обусловливает увеличение времени контакта частиц с тканями [7].

Удельная площадь поверхности наночастиц оксида марганца (III, IV) составила 150,23 м2/г и превысила в 1,2 раза площадь поверхности микрочастиц (130 м2/г), что может обусловливать высокую реакционную способность наночастиц in vitro и in vivo [10].

По имеющимся в литературе данным, при взаимодействии с клеточными мембранами наночастицы оксида марганца (IV) стимулируют избыточное образование активных форм кислорода [9, 12] с последующей интенсификацией апоптоза [11, 13]. Наночастицы оксида марганца (III, IV) обладают цитотоксической активностью, реализующейся путем угнетения митохондриальной деятельности [12]. В результате комплексной оценки физических параметров и биологических эффектов предварительно установлено, что наночастицы оксида марганца (III, IV) опасны для здоровья человека (D=1,75 - средняя степень опасности), в связи с чем необходимы дальнейшие токсиколого-гигиенические исследования для установления качественных и количественных параметров токсичности.

В остром эксперименте установлено, что клиническая картина острой интоксикации при введении нано- и микродисперсных растворов оксида марганца (III, IV) носит однотипный и неспецифический характер. У животных 1-6-й групп в первые 20 мин отмечались повышенная возбудимость, судороги, сменившиеся состоянием торможения и угнетения, слабой реакцией на звуковые и болевые раздражители, поверхностным дыханием. Гибель экспериментальных животных во 2-й и 3-й группах отмечалась преимущественно в 1-е сут, в 1-й группе - в период до 48 ч, а в 5-й и 6-й группах сравнения - в период от 48 до 72 ч (см. таблицу). В 4-й и 7-й группах гибели животных в течение срока наблюдения не засвидетельствовано.

Динамика гибели животных после однократного зондового внутрижелудочного введения различных доз нано- и микродисперсного растворов оксида марганца (III, IV)

Установлено, что при однократном зондовом внутрижелудочном введении LD50 нанодисперсного раствора оксида марганца (III, IV) составляет 2340 мг/кг (3-й класс опасности), микродисперсного его раствора - 6000 мг/кг (4-й класс опасности). С помощью расчетов определено, что наночастицы указанного раствора обладают сверхкумулятивностью (индекс кумулятивности - Ik=0,79), микрочастицы - средней кумулятивностью (Ik=0). Расчетные величины пороговой дозы и максимально недействующей дозы хронического эффекта для нанодисперсного раствора оксида марганца (III, IV) составили соответственно 1,6 и 0,26 мг/кг, что в 2,3 раза ниже аналогичных показателей для микродисперсного раствора.

Анализ изменений в венозной крови экспериментальных животных позволил установить, что наночастицы дисперсного раствора оксида марганца (III, IV) в дозе 3500 и 5000 мг/кг оказывают более выраженное токсическое действие на эритроциты и тромбоциты, чем микродисперсный аналог. Это подтверждается наличием полихроматофильных эритроцитов, доля которых составила 20 и 35% от общего числа эритроцитов в периферической крови мышей соответственно 2-й и 3-й группы. При введении микродисперсного оксида марганца (III, IV) в аналогичных дозах доля полихроматофильных эритроцитов в крови мышей составила соответственно 10 и 15%. В 10-20% эритроцитов крови экспериментальных животных 2-й и 3-й группы обнаружены патологические тельца Жоли, что в 2 раза превысило данный показатель в крови мышей в 5-й и 6-й группах. Нанодисперсный раствор оксида марганца (III, IV) вызывает массивную агрегацию тромбоцитов в крови экспериментальных животных 2-й и 3-й групп, в то время как микродисперсный раствор приводит к единичным явлениям агрегации тромбоцитов, причем только при введении дозы 5000 мг/кг. В мазках крови мышей 7-й группы патологических изменений не обнаружено.

Морфологические исследования при введении нанодисперсного раствора оксида марганца (III, IV) в дозе 3500 мг/кг выявили изменения во всех исследованных органах экспериментальных животных. Отмечены резкое расширение и полнокровие венозных сосудов печени, почек, заметное переполнение кровью венозных сосудов миокарда и эпикарда, а также камер сердца. В мозговом веществе почек обнаружены кровоизлияния. Наблюдались пролиферативные процессы в макрофагальной и лимфоидной системах экспериментальных животных. Выявлены повышение количества макрофагов и их активизация в печени, обеих почках и (особенно) в легких (рис. 1). В печени клетки Купфера увеличены и выбухают в просвет синусоидных капилляров, мезангиальные клетки в почечных тельцах гипертрофированы, а многочисленные альвеолярные макрофаги содержат фагоцитированный материал. Лимфоидные узелки белой пульпы селезенки расширены, имеют тенденцию к слиянию, в них не наблюдается типичного деления на зоны. В органе преобладает красная пульпа с явлениями диффузной и очаговой лимфатизации. Пролиферация клеток лимфоцитарного и макрофагального рядов приводит к лейкоцитарной инфильтрации паренхиматозных органов. Выявляются многочисленные перипортальные и внутридольковые лим-фоидно-гистиоцитарные инфильтраты в печени, и периваскулярные и межканальцевые - в почке (рис. 2 а, б). Инфильтрация органов лимфоцитами настолько активна, что преодолевает гематоэнцефалический барьер - лимфоидные инфильтраты обнаруживаются даже в белом веществе больших полушарий головного мозга (рис. 3).

При введении микрородисперсного раствора оксида марганца (III, IV) в дозе 3500 мг/кг наблюдается некоторое расширение синусоидных капилляров печени и сосудов микроциркуляторного русла почек (рис. 4). Расширен просвет капсул некоторых почечных телец (рис. 5). В паренхиматозных органах лимфогиостоцитарная инфильтрация носит эпизодический характер, инфильтраты располагаются только в соединительной ткани, они небольших размеров. В отличие от мышей 2-й опытной группы, у животных 5-й группы в коре больших полушарий головного мозга инфильтраты не определяются; отмечается только незначительный периваскулярный и умеренный перицеллюлярный отек, преимущественно в зернистом слое (рис. 6).

Рис. 1. Макрофагальная реакция в легком мыши 2-й (опытной) группы, погибшей в 1-е сут при введении нанодисперсного оксида марганца (III, IV) в дозе 3500 мг/кг, окраска гематоксилином и эозином, *1000

Рис. 2. Лимфогистиоцитарные внутридольковые инфильтраты в печени мыши (а) и периваскулярные инфильтраты в почке мыши (б) 2-й группы, погибшей в 1-е сут при введении нанодисперсного оксида марганца (III, IV) в дозе 3500 мг/кг, окраска гематоксилином и эозином (здесь и на последующих рисунках); 200

Рис. 3. Лимфоцитарная инфильтрация в белом веществе больших полушарий головного мозга мыши 2-й группы, погибшей в 1-е сут при введении нанодисперсного оксида марганца (III, IV) в дозе 3500 мг/кг, *400

Рис. 4. Расширение синусоидных капилляров и гипертрофия ядер части гепатоцитов печени мыши 5-й группы (сравнения), погибшей через 40 мин при введении нанодисперсного оксида марганца (III, IV) в дозе 3500 мг/кг, *400

Таким образом, анализ морфологических изменений внутренних органов экспериментальных животных при однократном внутрижелудочномзондовом введении нано- и микродисперсного растворов оксида марганца (III, IV) в дозе 3500 мг/кг позволил установить более выраженный их характер у мышей 2-й группы, чем у животных 5-й. Эти изменения касаются системы кровообращения и характеризуются расширением и полнокровием венозных кровеносных сосудов во всех изученных органах. Особенно заметно переполнение кровью венозных сосудов миокарда, эпикарда и всех камер сердца. В группе сравнения выраженных изменений у мышей не обнаружено - у них выявляется лишь пролиферация лимфоидной системы, результатом чего становится гипертрофия коркового вещества долек тимуса, лимфоидных фолликулов белой пульпы селезенки и лимфатизации ее красной пульпы. При этом в печени, почках и легких животных 5-й группы также наблюдалась активация клеток макрофагального ряда. Пролиферация лимфоидных клеток и макрофагов приводит к гистолейкоцитарной инфильтрации паренхиматозных органов. Иными словами, возникающие при воздействии нанодисперсного раствора оксида марганца (III, IV) изменения со стороны внутренних органов выражены в большей степени, чем при действии микродисперсного раствора. Они характеризуются в основном нарушениями со стороны венозного русла, что приводит к кровоизлияниям в паренхиматозных органах, особенно в почках. При введении микродисперсного раствора оксида марганца кровоизлияний во внутренних органах не обнаруживается.

Анализ полученных результатов позволяет заключить, что нанодисперсный раствор оксида марганца (III, IV) при однократном зондовом внутрижелудочном введении обладает в 2,6 раза большей степенью токсичности и кумулятивности (3-й класс опасности по критерию LD50), чем микродисперсный раствор (0,4-592 мкм) (4-й класс). Прогнозный расчет параметров хронической токсичности показал, что пороговая и максимально недействующая дозы для нанодисперсного раствора оксида марганца (III, IV) составила соответственн о 1,6 и 0,26 мг/кг, что в 2,3 раза ниже аналогичных показателей для микродисперсного аналога. Внутрижелудочное однократное поступление наночастиц дисперсного раствора оксида марганца (III, IV) в организм в дозе 3500 мг/кг вызывает гематотоксическое действие, проявляющееся в виде патологических включений в эритроцитах и повышенной агрегации тромбоцитов, степень выраженности и распространенности которых нарастает с увеличением дозы. Наблюдаются расстройства кровообращения в виде расширения и полнокровия вен и заполнения их просвета эритроцитами, приводящие к кровоизлияниям во всех изученных органах. Выявлены пролиферативные процессы в лимфоидной и макрофагальной системах, результатом которых являются гипертрофия коркового вещества долек тимуса, лимфоидных фолликулов белой пульпы селезенки и лимфатизации ее красной пульпы, активация клеток макрофагального ряда в печени, почках и легких.

Рис. 5. Расширение просвета капсул почечных телец в почке мыши 5-й группы, погибшей через 40 мин при введении нанодисперсного оксида марганца (III, IV) в дозе 3500 мг/кг, *400

Рис. 6. Незначительный периваскулярный и умеренный перицеллюлярный отек в зернистом слое коры больших полушарий головного мозга мыши 5-й группы, погибшей через 8 ч при введении нанодисперсного оксида марганца (III, IV) в дозе 3500 мг/кг, *400

Литература

1. Бокуняева Н.И., Жевелик Ю.С., Золотницкая Р.П. Справочник по клиническим лабораторным методам исследования. - М.: Медицина, 1975. - 383 с.

2. Грег С., Синг К. Адсорбция, удельная поверхность, пористость: Пер. с англ. - М.: Мир, 1984. - 306 с.

3. Методические указания по разработке и научному обоснованию предельно допустимых концентраций вредных веществ в воде водоемов. - М.: МЗ СССР, 1976.

4. Онищенко Г.Г., Зайцева Н.В., Землянова М.А. Гигиеническая идентификация последствий для здоровья при внешнесредовой экспозиции химических факторов / Под ред. Г.Г. Онищенко. - Пермь: Книжный формат, 2011. - 529 с.

5. Онищенко Г .Г. Стратегия безопасности наноиндустрии // Здоровье населения и среда обитания. - 2011. - № 5. - С. 4-8.

6. Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов: методические указания - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009. - 43 с.

7. Тутельян В.А., Гмошинский И.В., Гинцбург А.Л. и др. Методические рекомендации по выявлению наноматериалов, представляющих потенциальную опасность для здоровья человека: Метод. рекомендации. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009. - 35 с.

8. Finney D .J. Probit Analysis. - Cambridge, 2009. - 272 p.

9. Hussan S.M., Jovorina A.K. The interaction of manganes nanoparticles with pc-12 cells induces dopamine depletion // Toxicol. Sci. - 2006. - Vol. 92, N 2. - P. 456-463.

10. Lison D., Lardot C., Huaux F. et al. Infuence of partice surface area on the toxicity of insoluble manganese dioxide dusts // Arch. Toxicol. - 1997. - Vol. 71. - P. 725-729.

11. Pahl H.L. Activators and target genes of Rel/NF-kB transcription factors // Oncogene. - Vol. 18. - P. 6853-6866.

12. Sakon S., Xue X., Takekawa M. et al. NF-kB inhibits TNFinduced accumulation of ROS that mediate prolonged MAPK activation and necrotic cell death // EMBO J. - 2003. - Vol. 15. - P. 3 8 9 8 - 3 9 0 9 .

13. Takizawa H., Ohtoshi T., Kawasaki S. et al. Diesel exhaust particles induce NF-kB activation in human bronchial epithelial cells in vitro: importance in cytokine transcription // J. Immunol. - 1999. - Vol. 162. - P. 4705-4711.