The influence of probiotic fermented milk product on colon microbiota, hematological parameters and cell immunity in rats

AbstractInfluence of probiotic fermented milk product on the intestinal microbiota, hematological parameters and immune status of the experiment in vivo at Wistar rats was studied. It was shown, that entering of probiotic strains of Bifidobacterium bifidum 791, Bifidobacterium longum B-379M and Lactobacillus acidophilus NK1 и Streptococcus thermophilus in composition fermented milk products in the total quantity of 2,1107 CFU/ sm3 in digestive tract within three weeks has a positive influence on the resident of colon microbiota. Significant increasing of population levels of Вifidobacterium, Enterobacteriaceae with normal biochemical properties, registered a strong tendency to increase the content of Lactоbacteria, which led to a decreasing the number of potential pathogenic transient flora with pathogenic factors. Monitoring of body mass in experimental animals has shown that including of fermented milk product with probiotic strains in diet has a positive influence on the feed uptake. Probiotic properties of the product also have stimulated effect on the immune status of the rat: improvements in cell immunity (increasing the relative amount of T-helper cells, immuneregulatory index) and hematological parameters (increase of the average concentration of hemoglobin in erythrocyte).

Keywords:probiotic fermented milk product, colon microbiota, bifidobacterium, cell immunity

Вопр. питания. - 2012. - № 3. - С. 18-23.

В качестве пробиотических культур при производстве обогащенных кисломолочных продуктов используются различные штаммы бифидобактерий и молочнокислых бактерий, в основном являющихся представителями нормальной кишечной микробиоты человека. Однако присутствие в продукте видов микроорганизмов, относимых к пробиотическим, не гарантирует пробиотических свойств продукта. Одно из требований, выдвигаемых Всемирной организацией гастроэнтерологов к таким продуктам, гласит: "Заключение о пробиотическом эффекте определенных штаммов не должно автоматически переноситься на законченный коммерческий продукт" [13].

Достоверную оценку эффективности пробиотического продукта как в микроэкологическом аспекте, так и по воздействию на макроорганизм в целом обеспечивают клинические исследования у людей [1, 4-6, 8, 9, 11]. Как правило, таким исследованиям предшествуют доклинические эксперименты на лабораторных животных, позволяющие оценить переносимость продукта и направленность эффекта [2, 3, 7, 12, 14].

Целью настоящей работы была оценка пробиотического воздействия кисломолочного продукта, содержащего штаммы бифидобактерий и лактобацилл, признанных потенциально пробиотическими. Основными критериями оценки являлись состояние микробиоты толстой кишки, иммунологического статуса, гематологических показателей, а также мониторинг общего состояния здоровья животных на протяжении эксперимента. Изучение гематологических показателей и иммунного статуса целесообразно для подтверждения пробиотического действия изучаемых штаммов, так как известно, что одним из его аспектов является активация неспецифической резистентности макроорганизма [1, 9].

Материал и методы

В эксперименте были использованы крысы самцы Вистар с исходной массой тела 73-98 г. Крысы были распределены на 2 группы - по 10 животных в каждой. В течение 3 нед животные получали полноценный стандартный рацион вивария, воду - ad libitum. Животным опытной (1-й) группы индивидуально ежедневно per os вводили кисломолочный продукт, содержащий пробиотические штаммы бифидобактерий и лактобацилл (Lactobacillus acidophilus NK1, Bifidobacterium bifidum 791, Bifidobacterium longum B-379M), а также Streptococcus thermophilus.

Образцы пробиотического продукта были изготовлены на опытно-экспериментальном заводе ГНУ ВНИМИ РАСХН (Москва). Во всех представленных образцах продукта Bifidobacterium находились в количестве 1,0Ч106 КОЕ/см3; Lactobacillus - 1,0Ч107 КОЕ/см3; Streptococcus thermophilus - 2,0Ч107 КОЕ/см3. Суммарное содержание молочнокислых и пробиотических бактерий составляло 3,0Ч107 КОЕ/см3 продукта. Объем вводимой порции составлял 1,5−2,0% от массы тела, что соответствовало суточному потреблению кисломолочных продуктов человеком. Животные группы сравнения (2-я группа) получали стерильное обезжиренное молоко в том же объеме.

В процессе исследования проводили мониторинг состояния животных (поедаемость корма, поведение, состояние шерстного покрова, наличие или отсутствие диареи). Массу тела контролировали с использованием электронных технических весов еженедельно и перед забоем. По окончании эксперимента животных умерщвляли путем декапитации под легким эфирным наркозом, отбирали кровь для иммунологических и гематологических исследований, выделяли слепую кишку и асептически отбирали ее содержимое для исследования микробиоты.

Видовой состав и уровни основных популяций микробиоты кишечника крыс определяли путем количественных посевов содержимого толстой кишки на селективные и дифференциальнодиагностические среды для выделения следующих групп микроорганизмов: бифидобактерий, лактобацилл, энтеробактерий, стафилококков, стрептококков, энтерококков [7].

Субпопуляции лимфоцитов периферической крови выявляли методом прямого иммунофлюоресцентного окрашивания клеток крови с использованием панели моноклональных антител, конъюгированных с флюоресцентными красителями: FITC, PC7, APC (IO Test, Beckman Coulter, США) и лизирующего (фиксирующего) набора реагентов "ImmunoPrep" (Beckman Coulter, США). В работе использованы следующие антитела: CD45RA (клон ОХ-33) - экспрессируется на В-лимфоцитах; CD3 (клон 1F4) - экспрессируется на Т-лимфоцитах; CD4 (клон ОХ-38) - экспрессируется на Т-лимфоцитах-хелперах; CD8 (клон ОХ-38) - экспрессируется на цитотоксических Т-лимфоцитах; CD161а (клон 10/78) - экспрессируется на NK-клетках. Окрашенные клетки анализировали на проточном цитофлюориметре FC-500 (Beckman Coulter, США). Популяцию лимфоцитов выделяли с помощью гетерогенного гейтирования (по параметрам бокового светорассеивания и экспрессии CD45-FITC).

Гематологические показатели крови (содержание эритроцитов, концентрация гемоглобина, гематокрит, средний объем эритроцита, среднее содержание гемоглобина в эритроците, средняя концентрация гемоглобина в эритроците, содержание лейкоцитов и лейкоцитарная формула) определяли на гематологическом анализаторе "Coulter AC TTM 5 diff OV" (Beckman Coulter, США).

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета программ SPSS 11,5 для Windows. Математическая обработка данных эксперимента включала расчет средних значений со стандартными ошибками (М±m). Достоверность различий показателей между группами определяли в соответствии с t-критерием Стьюдента. Различия считали достоверными при р<0,05.

Результаты и обсуждение

Животные опытной группы получали потенциально пробиотические штаммы Bifidobacterium bifidum 791, Bifidobacterium longum B-379M - в количестве 1,0Ч106 КОЕ см3 в сутки; Lactobacillus acidophilus NK1 - 1,0Ч107 КОЕ см3 в сутки. Средние суммарные уровни пробиотических микроорганизмов в изучаемом продукте составляли 1,1Ч107 КОЕ/см3.

Наблюдения за животными в течение эксперимента свидетельствовали об отсутствии отклонений в состоянии здоровья и поведении крыс. Мониторинг массы тела подопытных животных показал, что введение в рацион исследуемого кисломолочного продукта положительно влияло на усвоение корма. У всех крыс отмечен прирост массы тела к концу эксперимента на 72-122% (табл. 1), однако достоверного отличия от прироста массы тела у животных группы сравнения не обнаружено (p>0,05).

Результаты изучения основных популяций микробиоты толстой кишки крыс представлены в табл. 2. В общей численности анаэробного и аэробного компонентов микробиоты различий между группами не отмечено, однако в опытной группе содержание бифидобактерий было достоверно выше, чем в группе сравнения.

Сравнительный анализ популяционных уровней лактобацилл, играющих важную роль в кишечной микробиоте крыс (в частности в подавленииусловно-патогенных цитратположительных энтеробактерий и кокковых форм), показал повышение среднего содержания лактобацилл на порядок у животных, получавших исследуемый кисломолочный продукт с потенциально пробиотическими микроорганизмами. Аналогичные данные получены и в отношении энтерококков.

Как следует из полученных результатов, введение опытного продукта существенно повлияло на уровни энтеробактерий с нормальной ферментативной активностью, активных антагонистов в отношении бактерий, обладающих факторами патогенности. Результаты изучения транзиторных популяций микрофлоры толстой кишки крыс представлены в табл. 3. Существенного воздействия используемого нами опытного кисломолочного продукта на среднее содержание популяций условно-патогенных представителей микробиоты не обнаружено, однако отмечено значительное различие частоты встречаемости гемолитических стрептококков: в опытной группе - 60%, в группе сравнения - 90%, и цитратассимилирующих энтеробактерий - соответственно 30 и 80%.

Таблица 1. Масса тела крыс (в г) в разные сроки эксперимента

Таблица 2. Содержание основных популяций микробиоты толстой кишки крыс после включения в рацион исследуемого кисломолочного продукта (в КОЕ, см3)

Таблица 3. Содержание условно-патогенных популяций микробиоты толстой кишки крыс после включения в их рацион исследуемого кисломолочного продукта (в КОЕ, см3)

Таким образом, в результате микроэкологических исследований установлено положительное влияние продукта, содержащего пробиотические штаммы бифидобактерий и лактобацилл, на состояние микробиоты толстой кишки. Статистически достоверное превышение среднего содержания бифидобактерий и энтеробактерий с нормальной ферментативной активностью, а также выраженная тенденция к повышению среднего уровня лактобацилл в сочетании со значительно более низкой численностью условно-патогенной транзиторной флоры у животных, получавших продукт с пробиотическими микроорганизмами, подтвердило ингибирующее воздействие резидентных групп микроорганизмов и представителей сопутствующей микрофлоры на бактерии с факторами патогенности, что согласуется с данными других авторов [1, 4, 9].

Результаты иммунологических исследований представлены в табл. 4. Как видно из табл. 4, у животных 1-й группы обнаружено статистически достоверное превышение относительного количества Т-хелперов и иммунорегуляторного индекса. Таким образом, использование в эксперименте исследуемого кисломолочного продукта, приготовленного на основе бифидобактерий и лактобацилл, оказало стимулирующее влияние на клеточный иммунитет.

Результаты гематологических исследований параметров крови представлены в табл. 5, 6. Данные табл. 5 характеризуют состояние эритроцитов у экспериментальных животных. Видно, что исследованные гематологические показатели находились в пределах физиологической нормы для крыс [13, 15]. У животных опытной группы обнаружено статистически достоверное повышение средней концентрации гемоглобина в эритроците. Представленные в табл. 8 данные, характеризующие состояние лейкоцитов у крыс, свидетельствуют об отсутствии статистически достоверной разницы показателей в 1-й и во 2-й группах.

Таблица 4. Относительное содержание субпопуляций лимфоцитов периферической крови крыс опытной группы и группы сравнения (М±m, p)

Таблица 5. Средние гематологические показатели, характеризующие состояние эритроцитов крыс

Таблица 6. Средние гематологические показатели, характеризующие состояние лейкоцитов у крыс

Таким образом, проведенные исследования показали, что потребление в течение 21 дня кисломолочного продукта с пробиотическими штаммами Bifidobacterium bifidum 791, Bifidobacterium longum B379M в смеси с Lactobacillus acidophilus NK1 и Streptococcus thermophilus (при содержании в суточной порции 1,0Ч106 КОЕ живых бифидобактерий и 1,0Ч107 КОЕ живых лактобацилл) положительно влияет на состояние микробиоты толстой кишки, клеточный иммунитет и гематологические показатели животных. Применение молекулярно-генетических методов подтвердило ведущую функциональную роль бифидобактерий в сложном многовидовом сообществе микроорганизмов, которым является микробиота кишечника. При этом доказана высокая степень генетической адаптации этих бактерий к толстой кишке - экологической нише бифидобактерий в макроорганизме [1, 15].

Достоверное превышение популяционных уровней бифидобактерий, ферментативно активных энтеробактерий и лактобацилл (микроорганизмов, обладающих антагонизмом в отношении условно-патогенным микроорганизмов) на фоне выявленного нами низкого потенциала патогенности свидетельствует о пробиотических свойствах исследованного кисломолочного продукта. Последние подтверждены стимулирующим влиянием на клеточный иммунитет и повышением средней концентрации гемоглобина в эритроците.

Данная работа выполнена в рамках государственного контракта № 02.522.12.2009 "Разработка технологий универсального быстропереориентируемого производства заквасок прямого внесения для биотехнологической промышленности" Федеральной целевой программы "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники на 2007-2012 гг.".

Литература

1. Амерханова А.М. Научно-производственная разработка новых препаратов-синбиотиков и клинико-лабораторная оценка их эффективности: Автореф. дис. - д-ра биол. наук. - М., 2009. - 42 с.

2. Байгарин Е.К., Жминченко В.М., Зилова И.С. и др. // Вопр. питания. - 2009. - Т. 78, № 3. - С. 33-37.

3. Батищева С.Ю., Поздняков А.Л., Кузнецова Г.Г. и др. // Там же. - 2002. - Т. 72, № 4. - С. 44-46.

4. Гончарова Г.И. Бифидофлора человека, ее защитная роль в организме и обоснование сфер применения препарата бифидумбактерин: Автореф. дис. - д-ра биол. наук. - М., 1982. - 48 с.

5. Кафарская Л.И., Инжеваткина С.М., Володин Н.Н. и др. // Вопр. дет. диетологии. - 2005. - Т. 3, № 1. - С. 72-95.

6. Конь И.Я. // Леч. врач. - 2007. - № 1. - С. 21-25.

7. Кузнецова Г.Г., Трушина Э.Н., Мустафина О.К. и др. // Вопр. питания. - 2011. - Т. 80, № 3. - С. 31-37.

8. Теплов В.И. Функциональные продукты питания. - М.: А-Приор, 2008. - 240 с.

9. Шевелева С.А., Кузнецова Г.Г. Батищева С.Ю. и др. Функциональная эффективность различных кисломолочных и пробиотических продуктов // Материалы междунар. конф. "Пробиотики, пребиотики и синбиотики и функциональные вопросы питания. Современное состояние и перспективы". - М., 2004. - С. 11-12.

10. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Т. 1. Микрофлора человека и животных и ее функции. - М.: Медицина, 1998. -288 с.

11. Callaway T.R., Edrington T.S., Anderson R.C. et al. // Anim. Health Res. Rev. - 2008. - Vol. 9, N 2. - P. 217-225.

12. Lewi P. J., Marsboom R.P. Toxicology reference data - Wistar rat. - Amsterdam: Elsevier, 1981. - 381 p.

13. Probiotics and prebiotics. Practice Guideline World Gastroenterology Organisation. May 2008. - P. 127 / http://www.worldgastroenterology.org/probiotics-prebiotics.html.

14. Suckow M.A., Weisbroth S.H., Franklin C.L. The Laboratory Rat. - Burlington, USA: Elsevier Academic Press, 2006. - 912 p.

15. Venture M., Canchaya C., Fitzgerald G.F. et al. // J. Antonie Van Leeuwenhoek. - 2007. - Vol. 91. - P. 351-372.