The experimental model of alimentary polyhypovitaminosis of different degree in rats

AbstractA model of the alimentary polyhypovitaminosis varying degrees basing on partitive simultaneous reduction of all vitamins in rats diet has been proposed. The model has a principal difference from other experimental models, based on complete exclusion of 1 or 2 vitamins from animal diet. The proposed model allows you to get as close to the actually observed combined deficiency of several vitamins among the population. 5-fold decrease of vitamin mixture resulted in the fact that animals received 20–23% of vitamins D, A, B2, 33% of vitamin B1 and 57% of vitamin E from the content of these vitamins in the diet of animals from control group because of some nature vitamins contained in such diet basic components as casein (vitamins D, A, B1, B2) and sunflower oil (vitamin E). After one month treatment a deep deficiency of all vitamins has developed in rats from this group. Liver level of vitamin A decreased 8,5-fold, vitamins E and B1 – approximately 2-fold, vitamins C and B2 by 22%. Urinary excretion of vitamin B1 and B2 declined 2 and 5,3 fold. Blood plasma concentration of vitamin A decreased 1,9 fold, and E – 1,4 fold, B2 – by 30%. Activities of blood plasma vitamin B6-dependent enzymes reduced 1,4-fold. 2-fold decrease in the amount of vitamin mixture ensured intake about 50–59% of vitamins D, A, B2, and B1 and about 71% of vitamin E of those contained in the diet of animals from control group. Vitamin status indexes of these animals occupied an intermediate position. They have developed a moderate deficit of these essential micronutrients. The proposed model may be useful for metabolic disorders identification, the study of vitamins and minerals assimilation, investigations of the influence of biologically active components of food on these processes, as well as the development of personalized approaches to the correction of vitamin insufficient accuracy.

Keywords:model of alimentary polyhypovitaminosis, vitamin A, vitamin E, vitamin В1, vitamin В2, vitamin C, liver, blood plasma, urinary excretion, rats

Вопр. питания. - 2012. - № 2. - С. 51-56.

Результаты обследования витаминной обеспеченности населения нашей страны свидетельствуют о том, что у многих людей независимо от места проживания и профессиональной принадлежности, как правило, обнаруживается значительная недостаточность не какого-либо одного витамина, а сразу нескольких [3]. В первую очередь это относится к витаминам группы В, каротиноидам и витамину D, высокая частота дефицита которого обусловлена недостаточной инсоляцией в широтах нашей страны. Несколько реже встречается недостаточность витаминов А, Е и С.

Биохимическая роль отдельных витаминов достаточно хорошо известна. Для выявления метаболических дефектов недостаточности того или иного витамина обычно используют модельные опыты на животных, в которых их лишают исследуемого витамина путем исключения его из рациона. Гораздо реже используются модели сочетанного алиментарного дефицита 2 витаминов (С и D, В2 и D, В6 и D, С и Е [2, 4, 5, 9, 12]), вызываемого полным исключением из рациона соответствующих витаминов. Применение таких моделей позволяет охарактеризовать возможные метаболические взаимодействия между 2 витаминами, а также оценить взаимодействие функционально связанных витаминов группы В [2, 6, 9, 17]. Имеются единичные сообщения, посвященные исследованию в модельных экспериментах на лабораторных животных нарушений метаболизма витаминов при полигиповитаминозном состоянии организма [16]. Между тем с учетом довольно высокой распространенности среди населения России именно полигиповитаминозов [3] такие исследования представляются весьма важными и актуальными.

В задачу настоящего исследования входило подобрать в эксперименте на крысах такие дозы витаминов в рационе, которые вызывают разную степень глубины полигиповитаминоза, обусловленного сочетанной недостаточностью всех витаминов, что может рассматриваться как модель, воспроизводящая одну из наиболее актуальных болезней человека дизрегуляторного характера.

Материал и методы

Исследования выполняли на крысах-самцах Вистар с исходной массой тела 70-80 г, полученных из питомника НЦБМТ РАМН "Столбовая". Животные были рандомизированно разделены на 3 группы по 8-9 крыс в каждой. Животные 1-й, контрольной, группы (8 крыс) получали полноценный полусинтетический рацион, содержащий 20% казеина, 66,4% кукурузного крахмала, 9% жира (смесь подсолнечного масла и лярда 1:1), 3,5% солевой смеси, 0,1% смеси водорастворимых витаминов и викасола, 0,9% смеси жирорастворимых витаминов (D,L-α-токоферола ацетата, холекальциферола и пальмитата ретинола) в подсолнечном масле [10].

Содержание в 100 г сухой смеси водорастворимых витаминов группы В и витамина K с сахарозой составило: В1 (тиамина гидрохлорида) - 500 мг, В2 (рибофлавина) - 500 мг, В6 (пиридоксина гидрохлорида) - 500 мг, РР (никотинамида) - 2 г, кальция пантотената - 2 г, фолиевой кислоты - 200 мг, биотина - 10 мг, В12 (цианокобаломина) - 1,5 мг, K (менадиона натрия бисульфита) - 100 мг. Концентрация витаминов в смеси жирорастворимых витаминов в подсолнечном масле составила (100 мл): А (пальмитата ретинола) - 20 000 МЕ, Е (ацетата D,L-α-токоферола) - 300 МЕ, D3 (холекальциферола) - 10 000 МЕ.

Основанием для выбора в рационе крыс доз витаминов, приводящих к развитию глубокой и умеренной их недостаточности, послужили ранее проведенные исследования по изучению зависимости содержания витамина В2 в тканях и крови крыс от его количества в корме [1]. В проводимых нами настоящих опытах дефицит витаминов у крыс вызывали уменьшением в 2 или 5 раз количества добавляемых в корм животных витаминных смесей. Животным из 2-й группы (9 крыс с умеренной недостаточностью) в корм добавляли смесь витаминов в количестве 50% (0,05% смеси водорастворимых витаминов и викасола, 0,45% смеси жирорастворимых витаминов) от содержания в полноценном рационе крыс контрольной группы. Животным 3-й группы (9 крыс с глубоким дефицитом) добавляли витамины в количестве 20% от их содержания в контроле.

На протяжении всего эксперимента животные находились в клетках из полимерного материала (полистирола) по 2-3 особи при приглушенном естественном освещении (средняя продолжительность светового дня составила 7,5 ч), относительной влажности воздуха от 40 до 60% и температуре 23±2 оС. Животные получали корм ad libitum (средневзвешенное количество - 16,5 г/сут) и имели постоянный доступ к воде. Еженедельно контролировали массу тела животных. Продолжительность эксперимента составила 28 дней. За 20 ч до умерщвления крыс помещали в метаболические клетки для сбора мочи, лишая пищи и предоставляя воду без ограничения. Животных умерщвляли путем декапитации с предварительным легким наркозом.

Собранную с гепарином после декапитации животного кровь центрифугировали в течение 15 мин при 500 об/мин, отбирали плазму и хранили при -20 оС. Печень, взятую сразу после вскрытия животного, взвешивали, определяли абсолютную (в г) и относительную (в %) массу.

Содержание витаминов А (ретинол и пальмитат ретинола) и Е (токоферолы) в плазме крови и экстракте гомогенатов печени, а также в подсолнечном масле и рационе (казеин) определяли методом ВЭЖХ [7, 8]. Витамины В1 и В2 в печени, моче, плазме крови и в рационе (казеине) определяли флюориметрически [7, 8]. Содержание аскорбиновой и дегидроаскорбиновой кислот в печени крыс выявляли колориметрическим методом [11], содержание белка - микробиуретовым методом, креатинина - спектрофотометрически. На биохимическом анализаторе "KoneLab 200i" ("ThermoScientific", Финляндия) определяли активность витаминзависимых ферментов в плазме крови крыс. Выражаем благодарность научному сотруднику ФГБУ "НИИ питания" РАМН к.м.н. С.Х. Сото, проводившему эти исследования.

Экспериментальные данные обрабатывали с помощью пакетов "Статистика" и "SPSS Statistics" для Windows (версия 18.0). Для выявления статистической значимости различий непрерывных величин использовали непараметрические U-критерий Манна-Уитни и критерий Краскелла-Уоллеса для независимых переменных. Различия между анализируемыми показателями считали достоверными при р≤0,05.

Результаты и обсуждение

Данные о суммарном суточном поступлении в организм животных исследуемых витаминов, содержащихся в рационе (в смесях витаминов, подсолнечном масле и казеине корма) представлены в табл. 1, из которой видно, что крысы 2-й группы получали 50-59% от суточной дозы витаминов D, А, В2 и В1, имеющихся в рационе животных контрольной группы, животные 3-й группы - 20-23% витаминов D, А, В2 и 33% витамина В1. За счет подсолнечного маслав рацион животных всех групп поступал витамин Е в форме α-, β- и γ-токоферолов в количестве 1,8 мг токофероловых эквивалентов (ТЭ) на 100 г корма. Вследствие этого животные 2-й группы получали 71%, а 3-й - 57% от содержания витамина Е в рационе животных контрольной группы. Таким образом, животные обеих групп получали витамина Е несколько больше, чем других витаминов. Эта ситуация вполне отражает состояние питания населения РФ, получающего с обычным рационом достаточно большие количества витамина Е и редко испытывающего его дефицит [3].

Данные о массе тела, относительной и абсолютной массе печени крыс после окончания эксперимента представлены в табл. 2. Достоверных различий между средними значениями этих показателей у животных контрольной и 2-й группы не выявлено. Однако у крыс, получавших 1/5 часть витаминов, наблюдалось некоторое замедление роста и достоверное увеличение относительной массы печени на 13,5%.

Пребывание крыс на экспериментальном рационе с уменьшенным содержанием витаминов приводило к уменьшению экскреции рибофлавина с мочой, собранной за 20 ч (рис. 1). У крыс, получавших витамина В2 в количестве 26% от его содержания в рационе животных контрольной группы, наблюдалось достоверное снижение выведения рибофлавина в 5,3 раза по сравнению с таковым у крыс контрольной группы и в 4,7 раза - по сравнению с крысами, получавшими половинную дозу витаминов. Таким образом, этот показатель весьма надежен для выявления глубокого дефицита витамина В2. Одновременно снижение содержания в корме рибофлавина в 3,9 раза сопровождалось незначительным снижением его концентрации в печени и плавным снижением в плазме крови до уровня, составляющего 71,5% от контрольного.

Содержание крыс на рационе с пониженным количеством витаминов приводило к постепенному параллельному уменьшению уровня витамина В1 в печени и экскреции тиамина с мочой (рис. 2). Экскреция тиамина с мочой у животных, получавших витамин В1 в количестве 33% от его содержания в рационе крыс контрольной группы, снижалась в 2 раза, однако различия были недостовреными. В печени крыс, находившихся на рационах с пониженным количеством витаминов, содержание витамина В1 уменьшалось в 2,2 раза. При этом между экскрецией тиамина с мочой и содержанием витамина В1 в печени наблюдалась заметная достоверная положительная корреляция (ρ=0,548, n=18; p≤0,05).

Таблица 1. Суточное поступление исследованных витаминов с рационом (на 1 крысу)

Таблица 2. Масса тела и печени крыс, получавших различное количество витаминов в течение 28 дней

Рис. 1. Зависимость концентрации рибофлавина в плазме крови, экскреции с мочой и содержания витамина В2 в печени от его уровня в рационе

Здесь и на рис. 2-5:

* - р≤0,05 по сравнению с показателем в контрольной группе;

** - с показателем у животных с умеренным дефицитом витаминов.

У животных, получавших витамин А в количестве 21% от такового в контроле, наблюдалось (рис. 3) достоверное снижение уровня ретинола в плазме крови и в печени, соответственно в 1,9 и 8,5 раза, что отражало возникновение глубокого дефицита этого витамина. Половинная доза витамина А (2-я группа животных) практически не влияла на уровень ретинола в плазме крови, но приводила к падению концентрации пальмитата ретинола в печени до уровня, равного 16,8% от показателя в контрольной группе. Между содержанием этого витамина в плазме крови и печени (как в расчете на 1 г ткани, так и на весь орган) выявлялась заметная достоверная положительная корреляция (ρ=0,627 и 0,675, n=25, p≤0,01). В то же время при уменьшении содержания витамина А в рационе в 2 раза снижение концентрации ретинола в плазме крови было менее выражено за счет снижения его уровня в печени.

Как следует из рис. 4, кривые зависимости содержания витамина Е в плазме крови и печени от его количества в рационе имеют сходный характер. Снижение на 28% суммарного содержания витамина Е в рационе крыс 2-й группы не отражалось на концентрации α-токоферола в плазме крови и печени. Уменьшенное на 42% содержание витамина Е в корме животных приводило к достоверному его снижению в плазме крови и печени (в 1,4 и 1,8 раз соответственно), что свидетельствовало о дефиците этого витамина у животных.

На развитие выраженного дефицита витамина В6 у крыс, получавших 1/5 часть витаминов от рекомендуемого потребления, указывало достоверное уменьшение в плазме крови (в 1,4 раза) активности пиридоксальзависимых аланин- и аспартатаминотрансферазы (табл. 3). Достоверное увеличение активности щелочной фосфатазы в плазме крови на 19% отражало возникновение недостаточности витамина D. Известно, что крысы способны синтезировать витамин С, поэтому в экспериментальные полусинтетические рационы крыс аскорбиновую кислоту не добавляют. Однако пребывание крыс на рационе, дефицитном по всем остальным витаминам, сопровождалось достоверным снижением в печени как суммарного содержания всех форм аскорбиновой кислоты (на 21,5%), так и окисленной (на 10,5%) и восстановленной (на 46,8%) ее форм по сравнению с показателями в контроле (рис. 5). Полученные результаты согласуются с данными о том, что у крыс при изолированном дефиците витамина В6 или А снижается уровень аскорбиновой кислоты в печени [13, 15].

Рис. 2. Зависимость экскреции тиамина с мочой и содержания витамина В1 в печени от его уровня в рационе

В целом полученные результаты свидетельствуют о развитии у крыс, получавших в течение 1 мес витамины в количестве 50% от содержания их в полноценном рационе, выраженной витаминной недостаточности, а у получивших 20% от содержания в полноценном рационе наблюдается глубокий дефицит всех витаминов.

Как известно, обычно используемые модели дефицита витаминов основаны на полном исключении из рациона животных исследуемых витаминов. Принципиальным отличием предложенной нами модели, базирующейся на дробном одновременном снижении количества всех витаминов, является возможность максимального приближения к реальной обеспеченности витаминами населения.

Полученные нами кривые зависимости обеспеченности организма витаминами (уровень в печени, плазме крови, экскреции с мочой) от их дозы в рационе, позволяют заключить, что могут возникнуть полигиповитаминозные состояния заданной степени глубины по каждому витамину. В то же время добавление в рацион обоснованно выбранных доз каждого из витаминов может служить моделью для разработки персонифицированных подходов к коррекции их недостаточности. Несомненно, что использование таких экспериментальных моделей алиментарного полигиповитаминоза у крыс окажется полезным для выявления нарушений метаболизма, изучения усвоения витаминов и минеральных веществ, а также влияния на эти процессы других биологически активных компонентов пищи.

Рис. 3. Зависимость содержания витамина А в плазме крови и печени от его содержания в рационе

Рис. 4. Зависимость содержания α-токоферола в плазме крови и печени от содержания витамина Е в рационе

Таблица 3. Зависимость активности витаминзависимых ферментов плазмы крови от обеспеченности крыс витаминами

Рис. 5. Содержание витамина С (сумма дегидроаскорбиновой и аскорбиновой кислот) в сырой печени крыс в зависимости от глубины сочетанного дефицита витаминов

Литература

1. Вржесинская О.А., Коденцова В.М., Спиричев В.Б. и др. // Вопр. питания. - 1994. - № 6. - С. 9-12.

2. Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Сокольников А.А. и др. // Вопр. мед. химии. - 1993. - Т. 39, № 5. - С. 29-33.

3. Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Спиричев В.Б. // Вопр. питания. - 2010. - Т. 79, № 3. - С. 68-72.

4. Коденцова В.М., Климова О.А., Сокольников А.А. // Вопр. питания. - 1988. - Т. 34, № 2. - С. 41-44.

5. Коденцова В.М., Климова О.А., Сокольников А.А. и др. // Вопр. питания. - 1991. - № 4. - С. 56-59.

6. Метаболические эффекты недостаточности функционально связанных В-витаминов / Под ред. Ю.М. Островского. - Минск: Наука и техника, 1987. - 256 с.

7. Руководство по методам анализа качества и безопасности пищевых продуктов / Под ред. И.М. Скурихина, В.А. Тутельяна. - М.: Брандес-Медицина, 1998. - 340 с.

8. Спиричев В.Б., Коденцова В.М., Вржесинская О.А. и др. Методы оценки витаминной обеспеченности населения: Учеб.-метод. пособие. - М: ПКЦ Альтекс, 2001. - 68 с.

9. Спиричев В.Б. // Педиатрия. - 2011. - Т. 90, № 6. - С. 113-119.

10 Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов Методические указания. МУ 1.2.2520-09. (утв. Роспотребнадзором 05.06.2009).

11. Шпаков А.Е. // Лаб. дело. - 1967. - № 5. - С. 305-307.

12. Babaev V.R., Li L., Shah S. et al. // Arterioscler. Tromb. Vasc. Biol. - 2010. - Vol. 30, N 9. - P. 1751-1757.

13. de Cabo R., BurgessJ.R., Navas P. // J. Bioenerg. Biomembr. - 2006. - Vol. 38, N 5-6. - P. 309-317.

14. Elliott J.G., Lachance P.A. // J. Nutr. - 1980. - Vol. 110, N 76. - P. 14 8 8 -14 9 6 .

15. Selvam R., Ravichandran V. // Indian J. Exp. Biol. - 1993. - Vol. 31, N 1. - Р. 882-887. 16. Teixeira A., Muller L., dos Santos A.A. et al. // Nutrition. - 2009. - Vol. 25, N 5. - P. 590-596.

17. Troen A.M., Shea-Budgell M., Shukitt-Hale B. et al. // Proc. Natl Acad. Sci. USA. - 2008. - Vol. 105, N 34. - P. 12474-12479.